本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高细胞囊泡包裹肿瘤化疗药形成的载药囊泡产率的方法。
背景技术：
细胞囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、dna、mrna、mirna等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。细胞囊泡在多种疾病的早期诊断、作为免疫调节剂、化疗药物载体等方面具有广阔的临床应用前景，可以为多种疾病包括肿瘤的早期诊断、治疗及预后提供重要的依据。
中国专利cn102302784a公开了一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法，该制剂是以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡为载体，用其包裹肿瘤化疗药制备而成。该制剂直接到达肿瘤部位，提高了化疗药的药效，同时克服了因外源载体给药而对机体产生的毒副作用，作为一种高效的化疗药物载体日益受到研究者的重视，尤其是在制药领域具备广阔的应用前景。cn102302784a还公开了所述肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中包括使用紫外线照射肿瘤细胞获得的细胞囊泡与化疗药的孵育，化疗药以接近该化疗药在作为载体的细胞囊泡中的最大饱和度的量加入到细胞囊泡中，并在室温条件下进行孵育，实现细胞囊泡对化疗药的包裹；或将添加了化疗药的细胞囊泡体系进行2～4小时的静置来实现。其中采用室温孵育的方式制备载药囊泡的具体操作参见cn102302784a说明书实施例2。
但是，采用室温孵育的方式制备载药囊泡，因室温环境变化较大，囊泡产率不稳定。使得批量生产囊泡产率和质量控制难度加大，不利于工业化生产，从而不能满足大规模的临床用药。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高载药囊泡的产率的方法，具体的将细胞囊泡与化疗药物在30～38℃温度范围内孵育，使所述细胞囊泡包裹所述化疗药物而制得载药囊泡。其中，所述细胞囊泡通过紫外线照射或化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡而获得。孵育温度可选地通过二氧化碳培养箱精准控制。
本发明的一个具体实施方式中，将源自凋亡的肿瘤细胞的细胞囊泡与化疗药孵育制备包裹化疗药的肿瘤细胞囊泡，孵育温度分别设置为8、15、25、30、37、42、50℃的二氧化碳培养箱进行。实验结果发现温度范围在30～40℃时，载药囊泡的产率较高。
在此基础上，对优选的温度范围30～40℃进行了进一步细化研究。分别将肿瘤细胞凋亡产生的细胞囊泡与化疗药物的孵育温度条件设置为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃。研究发现温度范围30～38℃条件下的囊泡产率相对较高，载药囊泡的产率大于等于40％。进一步地，当孵育温度为35～37℃时，囊泡产率最高，大于等于60％。
本发明还同时对不同孵育温度与室温孵育制备所得同等数目的载药囊泡在杀伤和抑制肿瘤细胞生长方面的效果进行对比。实验表明采用30～38℃孵育的方法制备所得的载药囊泡在维持稳定和高产率的同时，与室温条件孵育制备的载药囊泡的相比抗肿瘤功能未发生改变。
本发明还使用不同的靶细胞对于25℃、30℃和38℃孵育制备所得的囊泡进行肿瘤抑制作用检测，发现与室温孵育制备所得囊泡在同等数目下对人肺癌系细胞a549、人结肠癌细胞系hct-8、人肝胆管癌细胞系rbe、人肝癌细胞系sk-hep-1的杀伤效果相当，体内抑制腹水增殖的效果也无差异，说明30℃和38℃条件下孵育制备的载药囊泡功能与室温(25℃)孵育制备的无差异。
本发明还检测了不同温度条件下孵育制备的载药囊泡的粒径和药物含量，结果表明25、30和38℃孵育条件下制备的载药囊泡的粒径相当，单位囊泡的药物含量均为5μg，理化性质也无变化。
本发明所述的载药囊泡，其所包裹的药物可以是任何被临床使用的对治疗肿瘤有效的药物，包括但不限于各种化疗剂、生物制剂、某些中药制剂等。在本发明的一个优选实施方案中，所述的肿瘤治疗药为化疗药。
具体地所述化疗药可以是临床上用于治疗各类肿瘤的化疗药，如：肺癌、白血病、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌或胶质瘤等的化疗药，可以是单一化疗药或多种化疗药联合。选自治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌、白血病、胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和胶质瘤肿瘤的化疗药中的一种或几种。
更具体地，所述化疗药选自甲氨蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂和顺铂中的一种或几种。其中一种实施方式中化疗药可选地为甲氨蝶呤。
本发明提供的提高载药囊泡的产率的方法，通过控制孵育温度在35～37℃之间，将载药囊泡的产率提高至大于等于60％，同时其理化性质，抗肿瘤作用未受影响。该方法操作简便，经济高效，适应于工业生产的应用。
附图说明
图1室温孵育制备甲氨蝶呤载药囊泡的产率。
图2不同温度条件下孵育制备载药囊泡的产率。
图330～40℃范围不同温度条件下孵育制备甲氨蝶呤载药囊泡的产率。
图4不同温度条件下(25℃、30℃和38℃)孵育制备的载药囊泡对四种肿瘤靶细胞的杀伤作用。
图5不同温度条件下(25℃、30℃和38℃)孵育制备的载药囊泡对荷瘤小鼠的体内肿瘤抑制作用。
图625℃和37℃条件下孵育制备的载药囊泡的粒径；a为25℃制备囊泡粒径，b为37℃孵育制备囊泡粒径。
图7不同温度条件下(25℃、30℃和38℃)孵育制备的载药囊泡的含药量。
具体实施方式
以下实施例仅具体举例说明本发明的实施方式，不对本发明的范围做任何的限定。其中所采用的细胞、试剂与原料来源如下：
实施例中所使用的细胞的人肺癌系细胞a549、人结肠癌细胞系hct-8、人肝胆管癌细胞系rbe、人肝癌细胞系sk-hep-1购自于中国典型培养物保藏中心。
试剂及药品：3μm商业化标准聚苯乙烯磁珠(细胞囊泡相对计数磁珠)购自美国sigma-aldrich公司、甲氨蝶呤(mtx)购自同济医学院附属同济医院(武汉)。
其他试剂未特别言明均为市售产品。
实验动物：balb/c小鼠、c57bl/6小鼠购自湖北省疾病预防控制中心下属的湖北省医学实验动物研究中心；
实验仪器：nanozs90纳米粒径电位仪：购自英国马尔文仪器有限公司；
流式细胞计数仪：购自bd公司，facscantoⅱ型；
uitimate3000型高效液相色谱仪：购自thermo公司；
上海力康hf240二氧化碳培养箱：购自力康生物医疗科技控股有限公司。
实施例1.室温制备载药囊泡
使用无血清rpmi1640培养基重悬h22小鼠肝癌细胞，使细胞浓度达到1×107/ml，共计17ml。进行紫外照射1h，之后添加化疗药甲氨蝶呤使其在培养液中的药物浓度达到1mg/ml，培养箱内孵育18～20h。
逐级离心得到h22小鼠肝癌细胞来源的囊泡：
1500rpm离心8min、丢弃沉淀；5000rpm离心8min，丢弃沉淀；14000g离心1min，丢弃沉淀；14000g离心1h，使用1ml生理盐水重悬所得沉淀，即为h22细胞来源囊泡。
洗净流式管，加入500μl超纯水；加入10μl商业化的3μm粒径聚苯乙烯微球溶液以及10μl囊泡，摇匀后流式细胞仪检测囊泡浓度，其计算公式为：
囊泡浓度＝囊泡百分比/微球百分比×6.77×107/ml
将计算所得的囊泡浓度与细胞浓度的比值作为载药囊泡的产率。
实验结果显示平行制备的三个批次载药囊泡，每个批次制备三个样品，产率分别为在30％、28％、26％；10％、10％、12％；15％、16％、13％。因室温变化较大，3批次产率变化较大。结果见图1。
实施例2不同温度条件下孵育制备载药囊泡
根据与上述实施例1相同的方法在h22小鼠肝癌细胞培养液中施用甲氨蝶呤后，分别在8、15、25、30、37、42、50℃的二氧化碳培养箱中进行孵育甲氨蝶呤载药囊泡，湿度和二氧化碳浓度设置参数保持一致，均为5％二氧化碳浓度，饱和湿度95％。重复实验三次，并分别测定产率，结果如表1和图2所示。
表1不同温度条件下甲氨蝶呤载药囊泡的产率
实验结果显示，在同一温度条件下，当孵育在培养箱中进行，载药囊泡的产率重现性较好。载药囊泡的产率随温度不同而波动，温度设置为30～37℃之间囊泡产率较高。
实施例3制备载药囊泡的温度条件的优化
在30～37℃范围内进一步研究提高载药囊泡的产率的条件。根据实施例2所使用的方法，将细胞在二氧化碳培养箱内孵育的温度条件设置为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃，分别测定载药囊泡的产率。发现温度范围30～38℃的囊泡产率较高，在35～37℃囊泡产率最高。实验结果见图3所示。
实施例4不同温度条件下孵育的载药囊泡对肿瘤细胞的杀伤作用
培养人肺癌系细胞a549，将培养好的人肺癌系细胞a549培养液分为两组，第一组取出10ml的5×106人肺癌系细胞a549施用100μg甲氨蝶呤；第二组不做任何处理。在施用化疗药的48小时后，按照实施例1的方法收集来自第一组的癌细胞孵育制得的载药囊泡，作为实验组；将实验组的载药囊泡与来自第二组癌细胞培养液的5×106人肺癌系细胞a549在rpmi1640细胞培养液共培养72小时，观察肿瘤细胞的死亡。
分别在25、30和38℃的二氧化碳培养箱中进行上述实验，检验不同温度条件下孵育的载药囊泡对肿瘤细胞的杀伤率。
再分别使用人结肠癌细胞系hct-8、人肝胆管癌细胞系rbe、人肝癌细胞系sk-hep-1重复上述实验，分别得到不同肿瘤细胞系在25℃、30℃和38℃条件下制备的载药囊泡对相应肿瘤的杀伤作用，结果如图4所示。
实验结果表明，不同的靶细胞对于30℃和38℃孵育制备所得的囊泡进行功能检测，发现与25℃孵育制备所得囊泡在同等数目下对各种肿瘤细胞的杀伤效果相当。
实施例5不同温度条件下制备的载药囊泡对小鼠体内肿瘤抑制作用比较
1)培养h22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到3×107个，培养方法同实施例1。从培养的小鼠肝癌细胞培养液中取1ml的5×106肝癌细胞施用100ug甲氨蝶呤，分别25℃、30℃、38℃条件下孵育，在施用化疗药后的48小时，按照实施例1的方法收集细胞囊泡包裹化疗药形成的载药囊泡，将从1ml上清中所制备的载药囊泡的量定位1只小鼠每次注射的用量。
2)取另一组h22小鼠肝癌细胞培养液，从中取出1ml的5×106个小鼠肝癌细胞给予紫外线照射48小时后，收集未包裹化疗药物的h22小鼠肝癌细胞囊泡，作为对照组，其量定为1只小鼠的用量。
3)第1天，从上述培养的h22小鼠肝癌细胞中取1×105h22小鼠肝癌细胞腹腔接种到balb/c小鼠，共注射小鼠32只，获得患h22肝癌细胞腹水的balb/c小鼠，分为4组。
4)第2天开始，将步骤1)制备的得到的载药囊泡，按照确定剂量腹腔注射步骤2)获得的患肝癌的balb/c小鼠，每天一次，连续7天，共计3组，第8天起正常饲养。观察实验小鼠的存活时间。对第二组患肝癌的balb/c小鼠注射由步骤2)制备得到的细胞囊泡，每天一次，连续7天，第8天起正常饲养，作为对照组。
三种条件下制备的载药囊泡对患肝癌小鼠的存活时间的作用见图5所示。结果表明三种温度条件下制备的载药囊泡对患肝癌小鼠体内抑制腹水增殖的效果，无明显差异，说明30℃和38℃制备的载药囊泡功能与25℃制备的相比无差异。
实施例6不同温度条件下制备的载药囊泡的理化性质比较
根据实施例1的方法，分别在25℃条件和37℃的二氧化碳培养箱内孵育制备甲氨蝶呤载药囊泡，采用纳米粒度仪分析载药囊泡粒径，结果表明载药囊泡粒径范围为100-1000nm，结果见图6，图a为25℃孵育制备甲氨蝶呤载药囊泡，图b为37℃孵育制备甲氨蝶呤载药囊泡。
根据实施例1的方法，分别在25℃、30℃和38℃的二氧化碳培养箱内孵育制备甲氨蝶呤载药囊泡，分别取1×107载药囊泡，将其分别用pbs稀释至1ml，然后以14000g的离心力离心1h，去上清，将得沉淀，用500μlpbs清洗重悬，重复两次。
将上述所得载药囊泡溶液，以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀。用细胞囊泡破膜液裂解，冰上孵育30分钟，用超声破碎仪破碎至少40秒，之后1000g离心5分钟，留上清。
在上清中加入两倍体积的乙腈，并剧烈震荡以沉降蛋白，之后1000g离心3分钟，留上清。再次在上清中加入四倍体积的氯仿，以去除脂类物质。之后2000g离心10分钟。
收集上清，高效液相色谱法分别检测上清液中药物含量。其中，流动相是0.05mkh2po4，10％乙腈，ph6.6，流速为1ml/min。柱温为40℃，甲氨蝶呤的紫外吸收波长为304nm。最后，分别计算三种收集的上清的甲氨蝶呤含量。实验结果见图7所示。
根据实验结果可知，在25℃条件和38℃条件制备的载药囊泡的粒径没有变化。在1×107个囊泡的药物含量都在5μg左右。
1.一种提高载药囊泡产率的方法，其特征在于，将细胞囊泡与化疗药物在30～38℃温度范围内孵育，使所述细胞囊泡包裹所述化疗药物而制得载药囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述载药囊泡的产率不小于40％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于制备载药囊泡的孵育温度为35～37℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载药囊泡的产率不小于60％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述细胞囊泡源自凋亡肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞囊泡通过紫外线照射肿瘤细胞或化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡制得。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将细胞囊泡与化疗药物在30～38℃温度的二氧化碳培养箱内进行孵育。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化疗药为选自治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌、白血病、胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和胶质瘤肿瘤的化疗药中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化疗药选自甲氨蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂和顺铂的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述化疗药为甲氨蝶呤。
技术总结