本发明涉及一种富硒北虫草多糖泡腾片的制备方法，并提供一种提高富硒北虫草多糖的发酵方法，本发明涉及生物发酵和药物制剂领域。
背景技术：
蛹虫草，又称为北冬虫夏草(cordycepsmilitaris(l.)link)，性味甘平，益肺肾，补精髓，止血化痰，是一种名贵的中药和高级的滋补品，富含多种生物活性物质。研究表明，蛹虫草中含有虫草多糖、虫草素、虫草酸、核苷酸、维生素等多种生物活性物质。其中，蛹虫草多糖是蛹虫草的主要活性成分之一，可达到干重的4%–10%，具有抗氧化、延缓衰老、抗感染、抗辐射、抗肿瘤、抗炎症、调节免疫等功能。虫草多糖被认为是当前世界上最好的免疫促进剂之一。目前，我国己研究成功人工培养蛹虫草的技术，而且人工栽培踊虫草不但无毒无副作用，而且营养成分、药理药效和医用价值基本与野生虫草一致，甚至有些活性物质和含量都超过了野生虫草，这也为人工培养蛹虫草提供了真实可靠地科学依据。但是，人们对蛹虫草的消费，仍主要停留在对子实体鲜品和干品的食用方面，而蛹虫草深加工产品在市场保健品中的占有额微乎其微。虫草多糖的提取也多采用热水浸提法，提取率较低，产品类型的单一。
富硒蛹虫草作为一种新的技术出现，在培养基添加无机硒，通过蛹虫草吸收转化为对人类更易于吸收的有机硒的形式。硒主要存在于蛋白质，多糖和核酸中（蛋白质中硒含量最高，多糖次之，核酸最少），目前，硒蛋白的开发已经近乎完备，但是富硒虫草生长速度慢，影响了大规模推广。含硒核酸因为含硒量太少，没有开发的价值。硒多糖目前开发还处于初级阶段，后续的富硒虫草多糖产品在市场上还是空白的。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题：（1）富硒虫草多糖提取率低；（2）富硒虫草生长周期长；（3）后续产品单一。本发明提供一种富硒北虫草多糖泡腾片的制备方法。
一种富硒北虫草泡腾片的制备方法，包括如下步骤：富硒北虫草液体种子培养；富硒虫草液体发酵培养；分离发酵液中的菌丝体，微波辅助纤维素酶提取菌丝中的富硒虫草多糖；以富硒虫草多糖为原料制备泡腾片。
其中，所述的富硒虫草液体发酵培养采用改良发酵培养基进行发酵，所述的改良发酵培养基具体制备方法为：葡萄糖0.5-3%、蔗糖1-1.8%、蛋白胨1-5%、mgso40-1%、蝉蛹0.4-0.8%、kh2po40-1%，维生素b10.008-0.012%，硒酸钠/亚硒酸钠0.005-0.01wt%，煮沸2-10min，过滤，定容至1000ml，100-130℃灭菌10min以上。
优选的，葡萄糖1%、蔗糖1.4%、蛋白胨1.4%、mgso40.05%、蝉蛹0.6%、kh2po40.25%，维生素b10.012%，硒酸钠/亚硒酸钠0.008wt%，煮沸5min，过滤，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
其中，所述分离发酵液中的菌丝体，微波辅助纤维素酶提取菌丝中富硒虫草多糖，具体为，发酵菌丝烘干至恒重，料液比25-50:1，加入纤维素酶，0-0.5wt%，磷酸盐缓冲液，调节ph至5-7，55℃水浴恒温酶解20min以上，微波辅助，沸水中水浴灭酶5min以上，取上清液并浓缩，采用sevag法出去杂蛋白，保留水相，采用水提醇沉法，得到富硒虫草多糖。
其中，所述的微波功率600w，微波时间6min。
其中，微波辅助酶，微波处理和酶处理交替使用各2-3次。
其中，所述的泡腾片成分虫草多糖24wt%，泡腾剂，泡腾剂用量45wt%，peg6000用量4wt%，甜味剂3wt%，其余为乳糖。
其中，所述的泡腾剂中酸碱比为1：1。
本发明优先采用富硒北虫草（cn103843583a），进行后续的产品开发，现有技术中，富硒虫草生长周期长，不宜富硒虫草蛋白的大规模推广。本发明在改良后的发酵基质上，对富硒北虫草进行发酵培养。发明人发现，富硒多糖主要集中于菌丝上，发酵液中富硒多糖含量很少。本发明提供的改良基质，以无机硒为硒源，辅以维生素b1，蝉蛹和蔗糖，更好的促进虫草菌丝体的生长。发酵后期，得到的菌丝体较多，发酵液中的多糖含量极少，不造成浪费。
更多的，后续采用微波辅助酶处理菌丝，多糖提取率高，杂质少，更有益于后续的产品开发。
本发明有益效果
（1）提供了改良发酵培养基，对虫草进行发酵培养，提高了富硒虫草多糖的含量（主要提高了胞内多糖）；
（2）优化了提取多糖的方法，提取的多糖纯度更高，提取率更高；
（3）将富硒虫草多糖制备成泡腾片，更方便食用，更贴合市场需求。
具体实施方案
以下实施方法均采用富硒北虫草（cn103843583a）为母种。
实施例1富硒虫草发酵培养
（1）基础配方：葡萄糖1wt%、蔗糖1.2wt%、蛋白胨1.4wt%、mgso40.05wt%、蝉蛹0.4wt%、kh2po40.25wt%，维生素b10.006wt%，硒酸钠/亚硒酸钠0.8wt%，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
（2）接种培养：在无菌的条件下，进行菌种接种。将接种菌液放在条件22℃，转速150/rpm的恒温震荡培养箱中培养8-12d待用，重复此过程进行大批发酵液培养。
（3）发酵液处理：将发酵液8000r/min离心10min，分离得到发酵菌丝，60℃烘干至恒重，粉碎，过100目筛，备用。
（4）优化实验条件，对影响粗多糖发酵产量的三个因素：蔗糖（1.2%、1.4%、1.6%）、蝉蛹（0.4%、0.6%、0.8%）、vb1（0.008%、0.01%、0.012%），选用l9（34）表进行正交试验。（采用同样条件的微波辅助纤维素酶提取多糖）
当蔗糖1.4%，蝉蛹0.6%，vb10.012%时，发酵液菌丝干重为27.83g/l，胞内多糖提取量为2.90g/l，同时，对其发酵液中的胞外多糖进行提取（热水提醇沉），测得提取量为0.83g/l。
由此可见，本发明的液体改良发酵培养基发酵培养的虫草多糖主要位于菌丝中（即胞内多糖），胞外多糖含量较少
实施例2微波辅助纤维素酶法提取虫草多糖
（1）基础工艺：发酵菌丝烘干至恒重，料液比30:1加入纤维素酶（0.1%）磷酸盐缓冲液，55℃水浴恒温酶解30min，微波功率600w，微波时间4min,（微波酶解交替重复一次）沸水中水浴灭酶10min，取上清，浓缩提取液，使用sevag法除去杂蛋白，保留水相。得水相后，再往除完蛋白之后的水提液中加入乙醇使多糖沉淀，抽滤后将其放入烘箱中烘干，得虫草多糖。
（2）工艺优化：其他条件不变，分别改变以下条件①料液比20:1、30:1、40:1、50:1、60:1；②纤维素酶添加量0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%；③微波时间0、2min、4min、6min、8min。
（3）综合单因素试验结果，对影响粗多糖提取率的三个因素：料液比（30:1、40:1、50:1）、酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%）、微波时间（4min、6min、8min），选用l9（34）表进行正交试验。当料液比30:1、纤维素酶0.2%、微波6min时，多糖提取率为12.67%。在单因素实验中发现，当料液比为30:1、纤维素酶0.1%、微波0min（只纤维素酶辅助时）多糖提取率为6.14%；当料液比为30:1、纤维素酶0、微波4min（只微波辅助时）多糖提取率为6.56%；对照实验，仅热水浸提，无纤维素酶-微波辅助时，多糖提取率仅为5.23%。
实施例3测定含硒含量
对实施例2提取的胞内多糖样品进行硒含量的测定；
同时提取发酵液中的胞外多糖，进行硒含量的测定；
同时对富硒虫草多糖进行总的硒含量的测定：
采用平板电炉消化样品，双道原子荧光法测定硒含量。
总的硒含量测定为55.87mg/kg；胞内多糖中，硒含量测定为10.64mg/kg.；胞外多糖1.42mg/kg。
由此可见，含硒虫草多糖主要位于胞内多糖内，胞外多糖中的含硒虫草多糖很少。
实施例4富硒虫草多糖泡腾片制备
（1）本研究将采用酸碱分别制粒法来制备泡腾片。方法如下：按配方中的虫草多糖、乳糖的量称出来，平均分成两份，其中一份加入nahco3，另一份加入柠檬酸，两份分别加入适量80%的乙醇溶液为润湿剂，制软材，并搓成颗粒，将搓得的颗粒过20目筛网，在65℃下烘20分钟得到干燥的酸源、碱源颗粒，将两种颗粒混合均匀，加入润滑剂聚乙二醇6000、甜味剂阿斯巴甜，进行压片。
1.一种富硒北虫草泡腾片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：富硒北虫草液体种子培养；富硒虫草液体发酵培养；分离发酵液中的菌丝体，微波辅助纤维素酶提取菌丝中的富硒虫草多糖；以富硒虫草多糖为原料制备泡腾片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的富硒虫草液体发酵培养采用改良发酵培养基进行发酵，所述的改良发酵培养基具体制备方法为：葡萄糖0.5-3wt%、蔗糖1-1.8wt%、蛋白胨1-5wt%、mgso40-1wt%、蝉蛹0.4-0.8wt%、kh2po40-1wt%，维生素b10.008-0.012wt%，硒酸钠/亚硒酸钠0.005-0.01wt%，煮沸2-10min，过滤，定容至1000ml，100-130℃灭菌10min以上。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的改良发酵培养基具体制备方法为：葡萄糖1wt%、蔗糖1.4wt%、蛋白胨1.4wt%、mgso40.05wt%、蝉蛹0.6wt%、kh2po40.25wt%，维生素b10.012wt%，硒酸钠/亚硒酸钠0.008wt%，煮沸5min，过滤，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的分离发酵液中的菌丝体，采用微波辅助纤维素酶提取菌丝中富硒虫草多糖。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的微波辅助纤维素酶提取菌丝中的富硒虫草多糖，具体方法为：将发酵虫草菌丝烘干至恒重，料液比25-50:1，加入纤维素酶，0-0.5wt%，磷酸盐缓冲液，调节ph至5-7，55℃水浴恒温酶解20min以上，微波辅助，沸水中水浴灭酶5min以上，取上清液并浓缩，采用sevag法出去杂蛋白，保留水相，采用水提醇沉法，得到富硒虫草多糖。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的微波功率600w，微波时间6min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的微波辅助纤维素酶中，微波处理和酶处理交替使用各2-3次。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的泡腾片成分：虫草多糖24wt%，泡腾剂，泡腾剂用量45wt%，peg6000用量4wt%，甜味剂3wt%，其余为乳糖。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的泡腾剂中酸碱比为1：1。
技术总结