本发明属于gabaa受体抑制剂领域，尤其涉及槲皮素在制备gabaa受体抑制剂中的应用。
背景技术：
槲皮素(quercetin)，又名栎精，槲皮黄素，分子式为c15h10o7，为黄色针状结晶，是重要的天然黄酮类化合物之一。广泛存在于人们重要的饮食来源中，如水果、蔬菜和茶等。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、心脏保护和抗抑郁等作用。目前对槲皮素的功能研究越来越重要。gabaa受体，又称作γ-氨基丁酸a型受体，是一种离子型受体，而且是一类配体门控型离子通道。gaba广泛地分布于哺乳动物的大脑中，并通过称为gabaa受体的蛋白质络合物对大脑的多种作用进行调节，gabaa受体导致了氯化物传导性和膜极化发生变化。目前公开的可作为gabaa受体配体的种类很多，包括非苯二氮卓类中的吡唑坦、扎来普隆；吡咯酮类中的佐匹克隆等。
目前尚没有槲皮素能够作为gabaa受体抑制剂的报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供槲皮素在制备gabaa受体抑制剂中的应用；槲皮素能够和gabaa受体结合，结合率达到36％～147％。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了槲皮素在制备gabaa受体抑制剂中的应用。
优选的，所述gabaa受体抑制剂包括液体制剂。
优选的，所述液体制剂中槲皮素的浓度为1×10-4～-2mol/l。
优选的，所述液体制剂的溶剂包括二甲基亚砜。
优选的，所述槲皮素的纯度≥99％。
本发明的有益效果：本发明提供的槲皮素在制备gabaa受体抑制剂中的应用，所述槲皮素能够和gabaa受体结合，与地西泮相比，芦丁和gabaa受体结合率达到36％～147％。
附图说明
图1为内源性配体gaba对gabaa型受体电流的激动作用及其恢复时间曲线；
图2为阳性化合物bicuculline对gabaa型受体电流呈梯度抑制；
图3为槲皮素对gabaa型受体电流抑制作用。
具体实施方式
本发明提供了槲皮素在制备gabaa受体抑制剂中的应用。在本发明中，所述gabaa受体抑制剂在应用时优选为液体制剂；本发明对所述gabaa受体抑制剂的溶剂没有特殊限定，在本发明具体实施方式中，所述gabaa受体抑制剂的溶剂优选包括二甲基亚砜，所述二甲基亚砜优选的购自solarbio，货号为d8371。在本发明中，所述槲皮素的纯度≥99％，在本发明中，所述槲皮素优选的购自上海源叶生物股份有限公司，批号为c09s8y43412。在本发明中，以二甲基亚砜溶解所述槲皮素获得所述gabaa受体抑制剂。在本发明中，所述gabaa受体抑制剂中槲皮素的浓度优选为1×10-4～-2mol/l。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
方法方案：
1.利用梯度离心(脱颈椎处死大鼠，剥离全脑，液氮冷冻，将组织放于0.32m的20倍体积的蔗糖溶液(20ml/g)中，破碎组织10s，冰上放置30s，反复3-4次。在4℃，1000g离心力的条件下离心10min，丢弃沉淀。上清液在4℃，20000g离心力的条件下离心20min，弃上清，加水清洗一遍，方法同上。将沉淀溶于50mmtris-hclph＝7.4中，使蛋白质浓度达到0.8～1.6mg/ml，制备的大鼠皮层神经元细胞膜，立即放-80℃冻存。
2.取出膜受体按照以下顺序及比例加入各种反应液
a：总结合管：48μl膜受体 1μl缓冲液(dmso)) 1μl3h-氟硝西泮(perkinelmer,usa,2461442)；
b：非特异性管：48μl膜受体 0μl缓冲液 1μl地西泮(10-6m) 1ul3h-氟硝西泮；
c：中药单体成分管：48μl膜受体 0μl缓冲液 1μl槲皮素(药物浓度10-4m～10-2m) 1μl3h-氟硝西泮(perkinelmer,usa,2461442)；
3.以上各管在加完放射性配体后，立即放入37℃摇床中，孵育2h。
4.抽滤板内溶液于玻璃纤维滤纸(上海兴亚净化材料厂，q/iefj01-1997)上，烘干半小时，加入闪烁液(闪烁液组成：2-苯基-5-(4-联苯基)-1,3,4-噁二唑(pbd)用二甲苯溶解，配置成8g/l的浓度)，xh-6925液闪仪(西安核仪器厂，编号022)计数测量。
5、按照下面公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率：
抑制率＝(总结合管cpm-中药成分cpm)/(总结合管cpm-非特异性结合管)。结果见表1。
表1槲皮素的抑制率
从表1中可以得出，槲皮素的抑制率36％～147％。
实施例2
2实验方法
2.1原代神经元细胞培养
1)在超净工作台0.1％明胶(gelatin)处理玻片，使用前采用无血清培养基清洗3遍，放入3.5cm培养皿备用；
2)出生1-3天乳大鼠75％乙醇消毒头部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出大脑放入预冷的acsf(人工脑脊液)平衡盐溶液中；
3)在解剖显微镜下除去脑膜，分离并取出胚胎大脑皮层(3-4对大脑皮层)；
4)将皮层转移至另外一个盛有1mlacsf溶液的干净小培养皿中，剪碎组织成约1mm3大小；
5)加入2ml0.25％胰酶-edta消化液，并放入37℃水浴内消化5min；
6)取出消化液，加入接种培养基终止消化，放入37℃培养箱；
7)未消化完成部分重复3、4、5步骤3-4次；
8)将几次消化的组织块和细胞混合液经70um筛网过滤至新的培养皿中；
9)将过滤后的细胞悬液合并转移至15ml离心管中，于800rpm离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养基5-10ml，并轻轻吹打成单细胞悬液；
10)细胞计数，调整细胞密度按1×106/ml种入含玻片的培养皿中，放入37℃/5％co2细胞培养箱中培养，24小时后更换为维持培养基；
11)培养7天后，可用于膜片钳实验记录。
2.2膜片钳实验
1)将槲皮素溶液用细胞外液梯度稀释为100μm、300μm、1000μm，阳性对照药荷包牡丹碱溶液用细胞外液稀释至30μm，抑制率为50.74±2.63％(n＝26)；
2)室温条件下，取一个玻片，用细胞外液清洗两次，放置于倒置显微镜载物台上；
3)采用全细胞吸破式膜片钳技术，硼硅玻璃微电极尖端电阻为2～6mω，在gap-free模式下，将膜电位钳制在-60mv，钳制完成后在细胞外液中稳定记录1min，细胞旁灌流给药后当gabaa电流幅值变小开始出现脱敏时，被认为药物作用达到稳态。操作中保证实验中膜电阻大于1,000mω，漏电流少于离子通道电流的10％。
2.3数据分析
原始数据使用clampex10.7记录，以*abf文件保存在斯高研究院计算机网络系统中。数据采集和分析使用pclamp10.7软件程序。选取加入化合物前电流峰值，计算峰值平均值，作为对照电流幅值。选取加入化合物后电流峰值，计算峰值平均值，作为电流被抑制后的幅值。待测化合物对gabaa型受体电流的抑制率依据以下方程进行计算：％抑制率＝{1-(电流剩余幅值)/(对照电流幅值)}*100依据上述计算方法得到待测化合物对gabaa型受体电流的抑制率(平均值±标准误)。
3.实验结果
表2化合物信息表
灌流gaba可诱发出明显的内向电流，依次灌流1/3/10/30/100μmgaba可以梯度激活gabaa型受体电流，拟合曲线可知，ec50为3.95±10.63μm，本实验中均选择30μmgaba所诱导出电流为control。gabaa型受体为配体门控离子通道，为确定脱敏后恢复时间，分别给药30μmgaba后洗脱1/2/3/4/5min，再次给予30μmgaba，比较第二次给药与第一次电流大小，可知5min可以完全洗脱，见图1。
灌流gaba可诱发出明显的内向电流，依次灌流1/3/10/30/100μmbicuculline可以梯度抑制gabaa型受体电流，拟合曲线可知，ic50为38.20±37.60μm,见图2。
灌流30mgaba可诱发出明显的内向电流，同时灌流30mgaba与化合物槲皮素(100/300/1000m)诱发出的电流未有明显变化，见图3。
由以上实施例可以得出，通过全细胞膜片钳检测、槲皮素(quercetin)对gabaa受体通道的作用：对gabaa受体电流有一定程度的抑制作用；阳性对照化合物，30μm的荷包牡丹碱(bicuculline)，抑制gabaa受体通道电流为50.74±2.63％(n＝26)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.槲皮素在制备gabaa受体抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述gabaa受体抑制剂包括液体制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液体制剂中槲皮素的浓度为1×10-4～-2mol/l。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液体制剂的溶剂包括二甲基亚砜。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述槲皮素的纯度≥99％。
技术总结