本发明涉及咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。
背景技术：
脓毒症是由于感染导致机体免疫失衡而导致的脏器功能障碍，是重症患者的主要死亡原因之一。其中，约有40％-50％脓毒症患者并发心功能障碍，并发心功能障碍的患者死亡风险明显增加，而目前对于脓毒症心功能障碍尚缺乏公认有效治疗方案。心肌成纤维细胞是心脏组织中重要的支持细胞，同时发挥重要免疫监视作用，在感染、损伤等情况下，可显著活化，释放炎症因子等，放大炎症反应。近年来的研究发现，炎症因子可能作为一种心肌抑制分子，导致心功能障碍。因此，本技术以心肌成纤维细胞为干预靶点以提供脓毒症心功能障碍的治疗措施。咯利普兰是一种磷酸二酯酶抑制剂，可降低细胞内环磷酸腺苷水平而发挥抗炎作用，已被美国食品及药物管理局批准应用于慢性阻塞性肺疾病。而咯利普兰在脓毒症心功能障碍中的应用目前尚无报道。
技术实现要素：
基于以往研究报道，为了克服以上缺陷，本发明提出了咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。
本发明通过咯利普兰在脓毒症心功能治疗中的实验依据及动物水平的验证，为治疗应用提供了基础。
本发明以心肌成纤维细胞为干预靶点，证实咯利普兰可通过上调双特异性磷酸酶抑制心肌成纤维细胞炎症反应，显著改善脓毒症心功能。
附图说明
图1为lps刺激后心肌成纤维细胞炎症反应及dusp1表达变化图；
图2为咯利普兰对心肌成纤维细胞炎症反应的作用示意图；
图3为敲低dusp1后咯利普兰对心肌成纤维细胞炎症因子分泌的影响图；
图4为咯利普兰对内毒素血症小鼠心肌组织中炎症水平及dusp1表达的影响图；
图5为咯利普兰对内毒素血症小鼠心肌组织中炎性细胞浸润情况影响图；
图6为咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心功能影响图。
具体实施方式
咯利普兰在脓毒症心功能治疗中的实验依据及动物水平的验证，本方案同时在体外培养的心肌成纤维细胞和内毒素血症模型上为咯利普兰的效应提供了实验基础。
动物和试剂：
c57bl/6小鼠购自南方医科大学。所有动物处理程序已获南方医科大学(许可证编号2017j019)动物护理及使用委员会批准，所有动物实验按照南方医学部动物护理指南进行大学。lps-脂多糖(l2630)和rolipram-咯利普兰(r6520)是从sigma-aldrich购买的。用于消化心脏组织的酶liberaseth纯化研究级(054011501)从罗氏(德国曼海姆)购买。rna提取试剂trizol是从lifetechnologies(中国上海)购买的。反转录试剂盒(fsq-101)和real-timepcrmastermix(qpk-201)试剂盒是从丰田(日本大阪)购买。酶联免疫吸附试验(elisa)tnf-α(88-7324-22)、il-6(88-7064-86)和il-1β(88-7013-86)试剂盒购自thermofisher科技公司(加州圣地亚哥，美国)。dusp1抗体(sc-373841)是从santacruz(美国德克萨斯州达拉斯)购买的，并且gapdh(#2118)购自cellsignalingtechnology(马萨诸塞州丹佛市，美国)。二级抗体辣根过氧化物酶(hrp)结合羊抗兔igg(abs20040)和山羊抗鼠igg(abs20039)均购自absin(中国上海)。fluorochrome7-aad(00-6993-50)购自thermofisher(美国)和特异性抗体142cd45-fitc(553080)和ly6g-apc-cy7(560600)购自bdbiosciences(加利福尼亚州圣何塞，美国)。
新生小鼠心脏成纤维细胞的分离与治疗
从新生c57bl/6小鼠心脏中分离出新生鼠心肌成纤维细胞，麻醉后将新生鼠心脏分离并切成碎片。然后，用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗心脏组织，并在37℃下用酶(liberasethresearchgrade)消化15分钟。将含有细胞的上清液转移至完全培养基(含有10％胎牛血清的dmem)以终止消化。剩余组织在37℃酶解15min后进一步消化。消化重复3-4次，从心脏组织中分离出所有细胞。收集所有细胞悬液，250×g离心5min，丢弃上清液，在完全培养基中再悬浮。细胞悬液被转移到培养皿，在37℃和5％二氧化碳的培养箱中培养60分钟。丢弃未附着的细胞后，剩余的附着细胞为心脏成纤维细胞，细胞培养24小时后，根据先前的研究，分别用1μg/mllps处理6小时或10μmol/lrolipram处理1小时，然后单独或联合lps刺激。由于lps溶于生理盐水(ns)，rolipram溶于二甲基亚砜(dmso)，ns和dmso作为溶剂对照。
内毒素血症小鼠模型的制备及治疗
20只c57bl/6小鼠，雄性，8～10周龄，随机分为4组(n＝5)。根据我们先前的研究，用15mg/kg的lps腹腔注射6h建立内毒素血症小鼠模型，lps注射前1h腹腔注射10mg/kg的咯利普兰(rolipram)，以ns和dmso为溶剂对照组。
rna提取和定量rt-pcr(qrt-pcr)
用trizol试剂从心肌成纤维细胞或心肌组织中提取总rna。rna提取和qrt-pcr均按上述方法进行，tnf-α、il-6、il-1β、dusp1和gapdh的引物序列见下表1。表达结果用livak和schmittgen报道的2-δδcq法计算。
表1tnf-α、il-6、il-1β、dusp1和gapdh的rt-pcr引物序列
蛋白质提取
从培养的心肌成纤维细胞或心肌中提取蛋白质组织溶解缓冲液(p0013b，beyotime)。对培养的心肌成纤维细胞，去除培养基，用冷pbs洗涤3次。然后，用裂解缓冲液在冰上裂解细胞20分钟。然后，收集裂解细胞并在12000×g下离心15分钟以获得颗粒碎片，然后使用上清液进行后续测量。心脏组织蛋白的采集采用超声裂解法。超声探头频率为20khz。将组织放入带300μl裂解缓冲液的1.5ml微离心管中，在sonnicator探针尖下轻轻移动10秒振动。然后，在冰上孵育15分钟超声波。然后在12000×g离心20分钟，收集上清液进行蛋白质分析。采用bca蛋白测定法(thermofisher，usa)测定蛋白浓度，酶免疫法和westernblot法检测总蛋白。
酶免疫分析(elisa法)
细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6和白细胞介素-1β的酶免疫测定并根据制造商的指南进行心脏组织检查。在96孔板上分别涂上tnf-α(1:250稀释)、il-6(1:250稀释)和il-1β(1:250稀释)的捕获抗体，在4℃孵育过夜，用稀释缓冲液封闭1h，然后加入标准样品和实验样品，在室温下孵育2h。加入相应的检测抗体tnf-α(1:250稀释)、il-6(1:250稀释)和il-1β(1:250稀释)、亲和素辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(tmb)溶液，用1mol/lh3po4终止反应。在450nm处读取平板，并根据标准计算每个样品的浓度曲线。
蛋白质印迹分析(westernblot法)
western印迹分析是按照前面描述的程序进行的。简单地说，等量的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏氟乙烯膜上。用抗dusp1(1:1000稀释液)和gapdh(1:1000稀释液)的特异性抗体测定蛋白表达，并用tris缓冲液tween-20(tbst)稀释。分别用hrp结合抗鼠igg(1:5000稀释)和抗兔igg(1:10000稀释)作为dusp1和gapdh的二级抗体。化学发光法检测信号，密度法定量。
rna干扰(rnai)对dusp1基因敲除的影响
靶向dusp1的sirna(小干扰rna)是由基因制药公司(上海)合成的。sirna-dusp1和sirna-nc序列(作为对照)的合成寡核苷酸序列如表2所示。分离24小时后，心脏成纤维细胞在无血清dmem中与sirna/脂质体(美国lifetechnology)共孵育6小时，然后正常培养48小时，然后在lps刺激前用10μmol/lrolipram预处理1小时。采用westernblot法和elisa法分别检测lps处理6h后心肌成纤维细胞上清液中dusp1的表达和tnf-α、il-6的浓度。
表2小干扰rna序列
超声心动图测量
与我们之前的研究一样，超声心动图被用来测量小鼠的心功能。动物用1％吸入异氟醚7轻度麻醉，并用40兆赫线性阵列换能器连接到临床前超声系统(sonoscape，深圳，广东，中国)成像。采用左室短轴m模式评价左室射血分数(ef)对心功能的影响。
组织学检查
小鼠腹腔注射戊巴比妥50mg/kg麻醉。取心脏，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋。4μm厚的切片用苏木精和伊红染色，放大200倍镜检(日本尼康)。根据neu等报道的方法，炎症浸润的程度从1分到4分：1分，无炎症细胞浸润；2分，炎症浸润面积8小于10％；3分，炎症浸润面积10～20％；4分，炎症浸润面积20％以上。
小鼠心脏消化及流式细胞术分析
用50mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠。心脏组织被切成碎片，用冷pbs清洗三次，去除血细胞。然后用酶(研究级自由基酶)在37℃消化组织15分钟，将含有细胞的上清液转移到含有10％胎牛血清的培养基中终止消化。剩余组织在37℃酶解15min后进一步消化。消化重复3-4次，从心脏组织中分离出所有细胞。收集所有细胞悬浮液并在250×g下离心5分钟。丢弃上清液，然后将沉淀重新悬浮在pbs中，并通过70μm尼龙网(thermofisher，美国)过滤细胞。红细胞裂解缓冲液(thermofisher，美国)去除红细胞。细胞经7-aad染色，cd45-fitc和ly6g-apc-cy7特异性抗体染色30min，冷pbs洗涤两次，流式细胞仪(bd-facscalibur)检测。数据由flowjo分析。7-aad阴性细胞为活细胞。白细胞比率由cd45阳性细胞/所有活细胞计算。用ly6g阳性细胞/cd45阳性细胞计算中性粒细胞比率。
统计分析
所有数据用spss13.0软件(ibm，armonk，纽约，美国)进行分析。在方差齐性检验后，在lps刺激的心脏成纤维细胞实验中进行了单向方差分析和newman-keuls检验，以进行多组比较。采用双因素方差分析(anova)对心源性成纤维细胞和内毒素血症小鼠的作用进行评价。p<0.05被认为具有统计学意义。
结果
脂多糖增加心肌成纤维细胞炎性细胞因子的表达和分泌
用1μg/mllps刺激心肌成纤维细胞6h后，测定其mrna水平和炎症介质上清液浓度。如图1所示，lps刺激后，tnf-α、il-6和il-1β的mrna水平显著升高，上清液中tnf-α和il-6的浓度也显著升高然而，尽管lps刺激后il-1β的mrna表达显著增加，但上清液中il-1β的浓度没有显著差异。
咯利普兰通过上调心肌成纤维细胞dusp1的表达抑制lps诱导的炎症反应
分别用1μg/mllps和10μmol/lrolipram处理心肌成纤维细胞6h和1h。在lps刺激6h后，测定心肌纤维母细胞dusp1的mrna水平和蛋白表达。
dusp1是炎症反应的负性调节因子，可能是lps诱导的心肌成纤维细胞炎性因子释放的上游。在我们的研究中，用qrt-pcr和westernblotting方法检测lps处理后dusp1的表达，结果表明，lps刺激后dusp1的mrna和蛋白表达均显著下降，提示dusp1的下调可能参与了lps诱导的心肌成纤维细胞炎症反应。
先前的研究发现，rolipram可以上调巨噬细胞中dusp1的表达。为探讨其对lps诱导的心肌成纤维细胞炎症反应的影响，在给药前应用rolipram。
rolipram显著抑制lps诱导的心肌成纤维细胞tnf-α和il-6的上调和分泌，但不抑制il-1β的分泌。经靶向sirna敲除dusp1表达后，rolipram对炎症细胞因子分泌无影响，提示rolipram对炎症反应的保护作用依赖于dusp1的表达。
rolipram通过上调内毒素血症小鼠心脏dusp1的表达抑制lps诱导的炎症介质释放
为了进一步评价rolipram在体内的作用，我们建立了腹腔注射15mg/kglps6h的内毒素小鼠模型，lps rolipram组在lps注射前1h腹腔注射10mg/kgrolipram。分离小鼠心脏，测定促炎分子和dusp1的mrna和蛋白水平。与体外结果相似，lps处理显著降低了心脏dusp1的mrna水平。此外，rolipram可以在mrna和蛋白质水平上增加dusp1的表达，这与心脏成纤维细胞的结果相似。与对照组相比，lps rolipram组的tnf-α和il-6的mrna水平下降了，但与培养的心肌成纤维细胞相比，内毒素组小鼠的心脏中il-1βmrna没有变化。elisa法检测心肌组织中tnf-α、il-6和il-1β的蛋白水平。与对照组相比，lps组tnf-α和il-6水平显著升高，rolipram预处理降低了lps诱导的tnf-α和il-6的产生。
罗利普兰降低内毒素小鼠白细胞浸润改善心功能不全
炎性细胞浸润是组织炎症反应的重要指标，病理结果显示心肌间质存在炎性细胞浸润。然而，rolipram预处理组的炎症细胞浸润程度显著降低lps rolipram组的炎症浸润评分也低于lps处理组。此外，流式细胞术分析显示，罗利普兰治疗可降低内毒素小鼠心脏组织中的白细胞比率和中性粒细胞比率。这些结果提示，罗利普兰可能通过上调内毒素血症小鼠心脏dusp1的表达来抑制lps诱导的炎症反应。
最后，用超声心动图检测罗利普兰对内毒素所致小鼠心功能不全的影响。在乳头肌水平用m模式评价左室射血分数(ef)的变化。左心室短轴的典型m型图像如图4中e图所示，与ns对照组相比，lps处理组的ef降低，提示lps可引起心功能不全。lps rolipram组的ef明显高于lps组，提示rolipram可改善内毒素所致的心功能不全。
1、建立内毒素血症的体外心肌成纤维细胞刺激模型：
分离并培养新生鼠心肌成纤维细胞，给予lps(1μg/ml)刺激6小时，分别用elisa法和rt-pcr法检测细胞培养上清炎症因子浓度及细胞中炎症因子mrna水平，同时分别用rt-pcr法westernblot法检测双特异性磷酸酶mrna及蛋白水平。
结果见后附图1，图中，a-c：lps刺激后心肌成纤维细胞中炎症因子tnf-ɑ、il-6及il-1β转录水平改变；d-e：lps刺激后心肌成纤维细胞培养上清中炎症因子tnf-ɑ、il-6及il-1β浓度改变。g：lps刺激后心肌成纤维细胞中dusp1转录水平改变；h-i：lps刺激后心肌成纤维细胞中dusp1蛋白表达改变(h)及灰度分析(i)。表明，脂多糖刺激可显著增加心肌成纤维细胞炎症因子的转录和分泌，同时导致双特异性磷酸酶下降。
2、体外检测咯利普兰抗炎效果：
脂多糖刺激心肌成纤维细胞前，给予咯利普兰10μm预处理1小时，然后脂多糖刺激6小时后，分别用rt-pcr法westernblot法检测双特异性磷酸酶mrna及蛋白水平；分别用elisa法和rt-pcr法检测细胞培养上清炎症因子浓度及细胞中炎症因子mrna水平。
结果见后附图2，图中，a：咯利普兰处理后心肌成纤维细胞中dusp1转录水平改变；b-c：咯利普兰对心肌成纤维细胞中dusp1蛋白表达改变(b)及灰度分析(c)；d-f：咯利普兰处理对心肌成纤维细胞中炎症因子tnf-ɑ、il-6及il-1β转录水平改变；g-i：咯利普兰处理对lps刺激后心肌成纤维细胞培养上清中炎症因子tnf-ɑ、il-6及il-1β浓度改变。表明，咯利普兰可显著降低脂多糖诱导的心肌成纤维细胞炎症因子的转录和分泌，上调双特异性磷酸酶转录和表达。
3、咯利普兰抗炎机制研究：
检测咯利普兰处理后，心肌成纤维细胞脂多糖刺激6小时，并利用rnai技术选择性敲低双特异性磷酸酶后，用westernblot法检测双特异性磷酸酶蛋白水平变化，用elisa法检测细胞培养液上清中炎症因子浓度。
结果见后附图3，图中，a：心肌成纤维细胞中dusp1敲低情况验证；b：敲低dusp1后咯利普兰对lps刺激后心肌成纤维细胞tnf-ɑ分泌情况的影响；c：敲低dusp1后咯利普兰对lps刺激后心肌成纤维细胞il-6分泌情况的影响。表明，咯利普兰对心肌成纤维细胞炎症反应的调控作用依赖于双特异性磷酸酶。
4、咯利普兰对内毒素血症小鼠心脏炎症反应的影响：
腹腔注射脂多糖15mg/kg建立内毒素血症动物模型，咯利普兰处理组给予咯利普兰10mg/kg预处理1小时。脂多糖刺激6小时后，分别用rt-pcr法westernblot法检测心肌组织中双特异性磷酸酶mrna及蛋白水平；分别用rt-pcr法和elisa法心肌组织中炎症因子mrna及蛋白水平。
结果见后附图4，图中，a：咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心肌组织中dusp1转录水平的影响；b：咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心肌组织中dusp1蛋白水平的影响；c-e：咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心肌组织中炎症因子tnf-ɑ、il-6及il-1β转录水平改变；f-h：咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心肌组织研磨液中炎症因子tnf-ɑ、il-6及il-1β蛋白量改变。表明，咯利普兰可显著降低内毒素血症心脏组织中炎症因子转录水平和蛋白浓度、上调双特异性磷酸酶转录和表达。
5、咯利普兰对内毒素血症小鼠心肌组织炎性细胞浸润的影响：
腹腔注射脂多糖15mg/kg建立内毒素血症动物模型，咯利普兰处理组给予咯利普兰10mg/kg预处理1小时。用石蜡切片检测心脏组织病理学改变，并利用流式细胞术检测心脏组织中炎性细胞浸润比例和中性粒细胞比例变化。
结果见后附图5，图中，a-b：he染色检测咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心肌组织中炎性细胞浸润情况图(a)及评分(b)；c-d：流式细胞术检测咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心肌组织中白细胞浸润情况(c)及中性粒细胞浸润情况(d)影响。表明，咯利普兰可显著改善内毒素血症小鼠心脏组织炎性细胞浸润程度。
6、咯利普兰对内毒素血症小鼠心功能的影响：
腹腔注射脂多糖15mg/kg建立内毒素血症动物模型，咯利普兰处理组给予咯利普兰10mg/kg预处理1小时。脂多糖刺激6小时后，m型心脏超声检测小鼠心功能改变、石蜡切片检测心脏组织病理学改变。同时设立ns-生理盐水对照组。
结果见后附图6，图中，a：m型超声检测各组小鼠左室短轴切面及射血分数；b：各组小鼠射血分数比较。表明，咯利普兰可显著改善内毒素血症小鼠心脏收缩功能。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
1.咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，咯利普兰以心肌成纤维细胞为作用靶点，显著改善脓毒症心功能。
技术总结