本发明属于生物医学技术领域，具体涉及mir-6858在褪黑素防治胶质瘤中的应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
多形性胶质母细胞瘤(gbm)是脑内最常见、最致命的原发恶性肿瘤。尽管胶质母细胞瘤患者在手术和综合治疗方面取得一定进展，但诊断患者的预期寿命只有12-14个月。因此改善胶质母细胞瘤患者预后迫切需要新的治疗策略。
micrornas(mirnas)是一种小的、高度保守的非编码rna分子，通常可直接与3utr区结合来抑制靶mrna。mirnas参与调控多种生物学过程，在癌症中可能作为癌基因或抑癌基因发挥作用。其中，许多mirna参与介导gbm细胞的生长、侵袭和血管生成等多种恶性生物学行为。mirnas也参与调节gbm的化疗反应。luoh等研究表明，c-myc-mir-29c-rev3l信号通路驱动gbm细胞获得对替莫唑胺的抗性。huangt等人证明，mir-93可以抑制多个自噬调节因子，进而调控gbm细胞的替莫唑胺治的疗效。因此，研究mirnas在化疗中的作用具有重要意义。
褪黑素(melatonin，mel)是松果体分泌的胺类激素，具有抗衰老和调节免疫功能。已有证据表明，mel对胃癌、肺癌、结直肠癌、gbm等多种类型的癌细胞均有抗肿瘤作用。mel可以通过改变胶质母细胞瘤干细胞样细胞(gsc)的生物学特性和抑制gsc增殖减少gbm的生长。mel不仅可以直接靶向胶质瘤外，也可以通过靶向sirtuin1调节gbm细胞的微环境。然而，发明人发现，mel是否通过调控mirna来发挥其抗gbm的作用，目前尚不完全清楚。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供mir-6858在褪黑素治疗胶质瘤中的应用，具体的，本发明发现mel对u251、u87、a172和gbm#p3细胞有较强的抗肿瘤作用。重要的是，通过对mel处理后的gbm细胞进行mirna测序，找到靶mirna，mel通过上调mir-6858表达水平抑制gbm细胞生长，进而抑制sirt3/akt信号通路，基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供褪黑素在制备预防和/或治疗胶质瘤产品中的应用。
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗胶质瘤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
具体的，所述预防和/或治疗胶质瘤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
a)抑制胶质瘤细胞增殖；
b)抑制胶质瘤细胞迁移；
c)抑制胶质瘤细胞侵袭；
d)促进胶质瘤细胞mir-6858的表达；
e)抑制胶质瘤细胞sirt3的表达；
f)抑制胶质瘤细胞bcat1的表达；
g)抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达；
h)抑制胶质瘤细胞runx3的表达；
i)抑制胶质瘤细胞p-akt的表达；
j)抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达；
k)抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达；
l)抑制胶质瘤细胞cdk4的表达；
m)抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达；
n)抑制胶质瘤细胞cyclind的表达。
本发明的第二个方面，提供一种促进mir-6858表达和/或活性提高的物质在如下1)-13)至少一种中的应用：
1)抑制胶质瘤细胞增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；
2)抑制胶质瘤细胞迁移，或者制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；
3)抑制胶质瘤细胞侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；
4)抑制胶质瘤细胞sirt3的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞sirt3的表达的产品；
5)抑制胶质瘤细胞bcat1的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞bcat1的表达的产品；
6)抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达的产品；
7)抑制胶质瘤细胞runx3的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞runx3的表达的产品；
8)抑制胶质瘤细胞p-akt的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞p-akt的表达的产品；
9)抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达的产品；
10)抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达的产品；
11)抑制胶质瘤细胞cdk-4的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cdk-4的表达的产品；
12)抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达的产品；
13)抑制胶质瘤细胞cyclind的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cyclind的表达的产品。
本发明的第三个方面，提供一种用于防治胶质瘤的药物组合物，所述药物组合物为如下i)或ii)：
i)褪黑素与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分；
ii)促进mir-6858表达和/或活性提高的物质与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案报道了mel的体内外抗gbm的潜力，发现mel对u251、u87、a172和gbm#p3细胞有较强的抗肿瘤作用。同时通过对mel处理后的gbm细胞进行mirna测序，找到靶mirna。mel通过上调mir-6858抑制gbm细胞生长，进而抑制sirt3/akt信号通路。
上述技术方案阐明了一种新的基于mel和mirna相互作用的分子机制，这种机制为gbm的治疗提供了一种有效的治疗策略。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中mel抑制gbm细胞体外增殖相关图。(a)cck-8测定不同浓度mel处理24小时和48小时的u87、u251、a172和gbm#p3细胞存活率的结果；(b和c)edu测定结果，用apollo567染色细胞以检测edu，dapi染色细胞核，银光显微镜下拍照并叠加图像(比例尺：50μm)。(b)荧光显微镜下拍摄的edu阳性细胞代表图片；(c)不同浓度mel处理u87和gbm#p3细胞48h后。取每个样本4个随机域中edu阳性细胞百分比([edu /dapi ]×100％)。(n＝3，*p<0.05；**p<0.01)；
图2为本发明实施例中mel体外抑制gbm细胞的迁移和侵袭相关图。(a和b)mel(1mm)分别处理u87mg细胞24h、48h，划痕实验评估u87细胞迁移能力；(c和d)transwell实验评估不同浓度mel处理u87mg细胞48h后的细胞侵袭及结果统计；(比例尺50μm，n＝3，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图3为本发明实施例中mel上调gbm细胞mir-6858-5p水平相关图。(a)heat-map分析mel处理后gbm中mirna表达谱；(b)1mmmel分别处理u87和gbm#p3细胞48h，qpcr检测mir-6858-5p水平；(c和d)mir-6858-5pmimic分别处理u87和gbm#p3细胞24h、48h和72h，cck-8实验评估细胞活力；(e和f)mir-6858-5pmimic处理u87细胞48h后transwell实验结果及结果统计。(比例尺50μm，n＝3，*p<0.05)。
图4为本发明实施例中mel通过上调mir-6858-5p来抑制gbm的进展相关图。(a)mel和mir-6858-5p-inhibitor分别处理u87和gbm#p3细胞24h、48h和72h，cck-8评估细胞存活率；(b)mel，mir-6858-5p-inhibitor和dmso分别处理u87和gbm#p3细胞48h，荧光显微镜下拍摄的edu阳性细胞的代表性图片及统计结果；(c)mel，mir-6858-5p-inhibitor和dmso分别处理u87和gbm#p3细胞12h，24h，划痕实验结果及统计；(d)transwell侵袭实验检测u87细胞侵袭能力。(比例尺50μm；n＝3，*p<0.05)。图5为本发明实施例中mel通过mir-6858-5p/sirt3/akt信号通路抑制gbm的进展。(a)通过targetscan和mirdb数据库绘制的差异表达基因韦恩图；(b)mir-6858-5p-mimics处理gbm细胞中靶基因rt-qpcr结果；(c)经mel、mir-6858-5p-inhibitor处理细胞，westernblotting检测结果；(d)经mel、mir-6858-5p-mimics处理细胞，westernblotting检测结果。(n＝3，*p<0.05)。
图6为本发明实施例中mel抑制体内gbm细胞的生长。(a)荧光素酶稳定表达的gbm#p3细胞原位移植入裸鼠体内28天，ivisspectrum成像系统监测评估肿瘤生长及荧光统计结果。(b)kaplan-meier生存曲线确定小鼠生存率。(n＝3，*p<0.05；**p<0.01)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
技术人员理解本发明中使用的术语例如“mirna”和“mir”的变化形式，并且其涉及见于真核生物细胞和后生动物生物体的体液中的短核糖核酸(rna)分子。mirna包括人mirna、成熟单链mirna、前体mirna(pre-mir)、及其变体，其可以是天然存在的。在一些情况下，术语“mirna”还包括初级mirna转录物(pri-mirna)和双链体mirna。除非另外指出，否则当在本发明中使用时，特定mirna的名称是指成熟mirna。mirna前体可以由25至数千个核苷酸，通常40至130、50至120、或60至110个核苷酸组成。通常，成熟mirna由5至100个核苷酸，通常10至50、12至40、或18至26个核苷酸组成。术语mirna还包括最终进入rna诱导沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex，risc)的“引导”链以及与其互补的“过客”链。
本领域中已知的有数种mirna的序列，应理解，以下所示的各个mirna的数据库登录号是人来源的mirna。，同时，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自mirna的数据库登录号：例如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的mirna，例如如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的mirna的那些。
术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mrna来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mrna)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量pcr、多重连接依赖性探针扩增(multiplexligation-dependentprobeamplification，mlpa)pcr)。
术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。
术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。
术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。
在本发明的一个典型实施方式中，提供褪黑素在制备预防和/或治疗胶质瘤产品中的应用。
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗胶质瘤相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
所述产品可以是药物。
所述胶质瘤可以是多形性胶质母细胞瘤(gbm)。
本发明的又一具体实施方式中，所述预防和/或治疗胶质瘤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
a)抑制胶质瘤细胞增殖；
b)抑制胶质瘤细胞迁移；
c)抑制胶质瘤细胞侵袭；
d)促进胶质瘤细胞mir-6858的表达；
e)抑制胶质瘤细胞sirt3的表达；
f)抑制胶质瘤细胞bcat1的表达；
g)抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达；
h)抑制胶质瘤细胞runx3的表达；
i)抑制胶质瘤细胞p-akt的表达；
j)抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达；
k)抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达；
l)抑制胶质瘤细胞cdk4的表达；
m)抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达；
n)抑制胶质瘤细胞cyclind的表达。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进mir-6858表达和/或活性提高的物质在如下1)-13)至少一种中的应用：
1)抑制胶质瘤细胞增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；
2)抑制胶质瘤细胞迁移，或者制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；
3)抑制胶质瘤细胞侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；
4)抑制胶质瘤细胞sirt3的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞sirt3的表达的产品；
5)抑制胶质瘤细胞bcat1的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞bcat1的表达的产品；
6)抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达的产品；
7)抑制胶质瘤细胞runx3的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞runx3的表达的产品；
8)抑制胶质瘤细胞p-akt的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞p-akt的表达的产品；
9)抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达的产品；
10)抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达的产品；
11)抑制胶质瘤细胞cdk-4的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cdk-4的表达的产品；
12)抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达的产品；
13)抑制胶质瘤细胞cyclind的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cyclind的表达的产品。
其中，mir-6858优选为成熟mir-6858，进一步优选为mir-6858-5p。
所述胶质瘤为多形性胶质母细胞瘤。
所述产品可以是药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于防治胶质瘤的药物组合物，所述药物组合物为如下i)或ii)：
i)褪黑素与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分；
ii)促进mir-6858表达和/或活性提高的物质与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分。
其中，所述促进mir-6858表达和/或活性提高的物质包括采用基于rna的microrna功能性获得技术和/或基因特异性mirmimics技术上调mir-6858表达和/或促进其活性的物质；如人工合成mir-6858的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调mir-6858表达的启动子；同时也包括化合物类促进剂，如褪黑素。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例
1材料与方法
1.1道德声明
所有的动物实验都得到了山东大学动物保护与使用委员会(iacuc)的批准。
1.2细胞系和细胞培养
人胶质瘤细胞系u87、u251、a172购自中国科学院细胞库(上海；tchu138、tchu58和tchu171)。gbm#p3由卑尔根大学rolfbjerkvig教授提供。dmem培养基(thermofisherscientific，sh30022.01b)，10％胎牛血清(gehealthcarelifesciences，10082147)，5％co2，置于37℃湿化培养箱中。
1.3细胞活力和增殖测定
采用cck-8试剂盒(dojindo，ck04-500)检测细胞活力。细胞(1.0×104细胞/孔)接种于96孔板，37℃孵育过夜。mel(abcam，ab141933)溶于dmso(sigma-aldrich，d2650)中，在培养基中稀释至工作浓度。细胞经过必要处理后，dmem培养基(90μl无血清dmem 10μlcck-8)中37℃孵育4h。使用微平板阅读器450nm检测吸光值(bio-rad，model680；hercules，ca，usa)。edu细胞增殖检测试剂盒说检测细胞增殖。
1.4细胞迁移和侵袭试验
划痕试验评估细胞迁移。将u87和gbm#p3细胞接种于6孔平板中，37℃孵育过夜，200μl吸头在平板底部划线，不同的时间点在显微镜下观察划痕愈合情况，imagej软件定量分析。boydenchamber实验评估细胞侵袭。transwell膜的底部是用人工基底膜预处理4h，5×104个细胞无血清dmem悬浮于transwell板上层，下层加入600μl含有10％fbs的dmem培养基，37℃孵育24h，将迁移至膜底的细胞黏附固定，0.5％结晶紫染色，用棉签去除上腔细胞，光学显微镜下采集图像，根据厂家盒说明书使用rhodaminephalloidin(phdr1，cytoskeleton，inc.)染色法对u87和gbm#p3的细胞骨架变化，荧光显微镜观察。
1.5westernblot
westernbloting分析细胞溶解产物(20μg蛋白质)。cst抗体孵育pvdf膜，包括p-akt(4060)、p-mtor(2974)、cdk-4(9202)、mmp2(9204)、cyclinb(9662)、cyclind(9542)、actb(5174)。imagej软件对结果进行分析。
1.6小rna文库的构建和测序
根据使用说明书用trizol试剂(invitrogen，ca，usa)提取总rna。bioanalyzer2100andrna6000nanolabchipkit(agilent，ca，usa)进行分析(rinno.>7.0)。根据truseqtmsmallrnasampleprepkits(illumina，sandiego，usa)说明书，使用约1ug的总rna制备小rna文库。联川生物公司根据其自有方案在illuminahiseq2500上进行单端测序(36bp)。
1.7mirmimics/inhibitor转染
根据lipofectamine2000试剂说明书转染mirmimics/inhibitor，rt-pcr验证转染效率。
1.8rt-qpcr(实时荧光定量pcr)
microelutetotalrna试剂盒(omegabio-tek，doraville，ga，usa)提取总rna。mircutemirna分离试剂盒(北京天根生物科技有限公司)提取总mirna。引物序列见补充表1。
1.9颅内异种移植模型及药物治疗
无胸腺的老鼠(雄性；4周；20-30g)由上海斯拉克实验动物有限公司(中国上海)提供。用水合氯醛麻醉小鼠(300-400mg/kg)，固定于立体定向框架上。在头皮上切开一个纵向切口，在前囟外侧2.5mm处钻一个直径为1mm的孔。用hamilton注射器将含有可稳定表达荧光素酶的gbm#p3细胞(2×105)20μl无血清dmem植入到右侧纹状体2.5毫米处。第4周时用ivis-200生物荧光成像仪(美国)检测肿瘤的生物发光值。30天后，或当小鼠出现旋转行为、活动减少或出现梳毛和圆顶头等神经症状时，脊椎脱臼法处死小鼠。
1.10统计分析
各组数据均重复三次，数据结果显示为平均数±标准差。使用graphpadprism5软件(美国)对数据进行分析，t检验(student’stest)和单因素方差分析(one-wayanova)进行组间数据比较。其中p<0.05被认定为具有统计学差异；其中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
2研究结果
2.1mel抑制gbm细胞体外增殖
为验证mel对gbm细胞是否有效，首先在体外对u251、u87、a172和gbm#p3细胞进行mel处理，使用cck-8试验测定细胞活力。在体外，用不同浓度的mel处理细胞24和48h，对生存能力进行评估。研究结果表明，mel可以以剂量和时间依赖的方式降低所有gbm细胞系的细胞活性(图1)。edu结果还显示，mel处理48小时后，u87和gbm#p3细胞的增殖明显以剂量依赖方式下降(图1b和1c)。
2.2mel在体外抑制gbm细胞的迁移和侵袭
为了检测mel是否抑制gbm细胞的迁移和侵袭，进行了伤口愈合和侵袭实验。如图2a和2b所示，用mel处理48h后，u87细胞的划痕闭合减弱。采用transwell实验进一步评价mel对gbm细胞侵袭能力的影响。mel处理48h后，通过transwell膜的细胞数随着mel浓度的增加而较少(图2c和d)，这些结果表明mel明显抑制了u87细胞的迁移和侵袭。
2.3mel增加了gbm细胞的mir-6858-5p水平
为确定mel抑制gbm细胞的潜在机制，通过mirna测序筛选mel处理后细胞内靶mirna。heap-map结果显示，1mmmel处理48h后mir-6858-5p水平显著升高(图3a)。使用荧光定量pcr(qrt-pcr)结果进一步证实mel处理后，u87和gbm#p3细胞中mir-6858-5p水平升高(图3b)。此外，mir-6858-5pmimic(100nm)可以以时间依赖的方式抑制u87和gbm#p3细胞的增殖(图3c和3d)。mir-6858-5pmimic(100nm)也抑制了u87细胞的运动潜能(图3e和f)。这些结果表明，mel提高了mir-6858-5p和mir-6858-5pmimic的表达水平，抑制了gbm细胞的肿瘤发展。
2.4mel通过上调mir-6858-5p来抑制gbm的进展
进一步探讨mel是否通过上调mir-6858-5p抑制gbm细胞的恶性行为。mir-6858-5p-inhibitor存在状态下，cck-8实验评估了u87细胞和gbm#p3细胞活性。的数据显示，mir-6858-5p-inhibitor增加了mel处理后的u87和gbm#p3细胞活力(图4a)。同时mir-6858-5p-inhibitor也提升了mel处理后的u87细胞增殖(图4b)。此外，划痕实验和transwell实验结果表明mir-6858-5p-inhibitor可以中和mel对u87细胞的影响(图4c和4d)，这说明mir-6858-5p-inhibitor可以减少mel对gbm细胞运动潜能的抑制作用。
2.5mel通过mir-6858-5p/sirt3/akt信号通路抑制gbm的进展
为鉴别gbm细胞中mir-6858-5p的直接靶标，用targetscan和mirdb数据库预测保守的mir-6858-5p的靶基因(图5a)。根据已发表的文献，从常见基因中筛选出10个可能与胶质瘤相关的基因。然后对这10个基因进行验证，发现mir-6858-5pmimics处理后，sirt3、bcat1、s1pr1和runx3的表达水平下降(图5b)。sirt3是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白去乙酰化酶的亚家族成员，已被证明可以调节结肠癌、前列腺癌和gbm中的akt信号通路。因此，研究了在mel或mir-6858-5p-mimics处理下akt和mtor的磷酸化状态。westernblot结果显示，在mel处理后的u87和gbm#p3细胞中，p-akt、p-mtor、mmp-2、cdk-4、cyclinb和cyclind的表达水平下降，而mir-6858-5p-inhibitor可以抑制mel的作用(图5c)。mir-6858-5p-mimics处理也可以降低p-akt、p-mtor、mmp-2、cdk4、cyclinb和cyclind的表达(图5d)。以上结果表明，mel可以通过mir-6858-5p/sirt3/akt信号通路抑制gbm的进展。
2.6mel抑制gbm细胞在体内的生长
为了确定mel体内的治疗效果，利用颅内肿瘤模型研究了mel对gbm生长的影响。将可稳定表达荧光素酶的gbm#p3细胞植入的胸腺缺失的裸鼠体内，并随机分为对照组(n＝5，pbs)和mel处理组(n＝5，50mg/kg/天)。4周后测量肿瘤的生物发光值。结果表明，mel可以显著降低体内的gbm增长(图6a)。kaplan-meier分析结果显示，mel处理的小鼠与对照组之间存在明显的统计学差异(图6b)。
综上研究表明，mel可通过mir-6858-5p/sirt3/akt信号通路抑制gbm的进展，阐明了一种基于mel治疗与mirna相互作用的新的分子机制。这些数据为gbm的治疗提供了一种新的、有效的治疗策略。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
1.褪黑素在制备预防和/或治疗胶质瘤产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗胶质瘤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
a)抑制胶质瘤细胞增殖；
b)抑制胶质瘤细胞迁移；
c)抑制胶质瘤细胞侵袭；
d)促进胶质瘤细胞mir-6858的表达；
e)抑制胶质瘤细胞sirt3的表达；
f)抑制胶质瘤细胞bcat1的表达；
g)抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达；
h)抑制胶质瘤细胞runx3的表达；
i)抑制胶质瘤细胞p-akt的表达；
j)抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达；
k)抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达；
l)抑制胶质瘤细胞cdk4的表达；
m)抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达；
n)抑制胶质瘤细胞cyclind的表达。
3.如权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述胶质瘤为多形性胶质母细胞瘤。
4.促进mir-6858表达和/或活性提高的物质在如下1)-13)至少一种中的应用：
1)抑制胶质瘤细胞增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；
2)抑制胶质瘤细胞迁移，或者制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；
3)抑制胶质瘤细胞侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；
4)抑制胶质瘤细胞sirt3的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞sirt3的表达的产品；
5)抑制胶质瘤细胞bcat1的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞bcat1的表达的产品；
6)抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞s1pr1的表达的产品；
7)抑制胶质瘤细胞runx3的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞runx3的表达的产品；
8)抑制胶质瘤细胞p-akt的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞p-akt的表达的产品；
9)抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞p-mtor的表达的产品；
10)抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞mmp-2的表达的产品；
11)抑制胶质瘤细胞cdk-4的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cdk-4的表达的产品；
12)抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cyclinb的表达的产品；
13)抑制胶质瘤细胞cyclind的表达，或者制备用于抑制胶质瘤细胞cyclind的表达的产品。
5.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述mir-6858为成熟mir-6858，优选为mir-6858-5p。
6.如权利要求1-5任一项所述应用，其特征在于，所述产品为药物。
7.一种用于防治胶质瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为如下i)或ii)：
i)褪黑素与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分；
ii)促进mir-6858表达和/或活性提高的物质与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述促进mir-6858表达和/或活性提高的物质包括基于rna的microrna功能性获得技术、基因特异性mirmimics技术上调mir-6858表达和/或促进其活性的物质和化合物类促进剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述促进mir-6858表达和/或活性提高的物质包括人工合成mir-6858的短发夹rna、上调mir-6858表达的启动子和褪黑素。
10.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物非活性成分包括药学上载体、赋形剂和稀释剂。
技术总结