本发明涉及p38γ抑制剂的新应用，特别涉及p38γ抑制剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
背景技术：
癌症严重威胁人们的健康，随着医学的发展，越来越多的癌症已经具有了较好的治疗效果。在众多的癌症中，胰腺癌被称为“癌中之王”，是一种尚未攻克的癌症。现有技术中，胰腺癌从预防、诊断、治疗到预后效果都不理想。《2015年中国癌症统计》数据显示，我国胰腺癌占总体恶性肿瘤发病率和死亡率的第9位和第6位，并且呈快速上升趋势。约3/4的胰腺癌患者在确诊1年后死亡，5年生存率仅为6％，是名副其实的癌中之王。与其他肿瘤相比，如肺癌和乳腺癌等已经有多种“精准”的靶向治疗药物，胰腺癌的临床治疗还停留在“非精准”时代，广泛采用的吉西他滨方案有效率仅为15～20％，5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康和奥沙利铂化学治疗方案(folfirinox方案)不良反应极大，仅少数特定患者可以获益。靶向治疗是目前治疗晚期胰腺癌的新方法之一，常用的有表皮生长因子受体抑制剂，血管内皮生长因子抑制剂和基质金属蛋白酶抑制剂等，但已完成的药物临床试验研究结果多为阴性，临床收益并不明显。
p38γ(又称为sapk3、erk6)是mapk家族的一个新成员，其组织分布具有高度特异性，在骨骼肌中大量表达。p38γ/sapk3信号传导通路可引起多种细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、转化及凋亡等，其级联途径的上游分子及激活方式、下游分子及效应方式又与mapk家族其他成员显著不同。已有研究表明p38γ与部分肿瘤相关。谢学海，田孝东，马永簌等(p38α及β亚型对胰腺癌细胞生物学行为的影响[j].中华实验外科杂志，2019，36(2):261-263.)的研究结果表明p384个亚型在7种胰腺癌细胞株中有不同水平表达，其中p38α在7种胰腺癌细胞株中均显著表达；在aspc、colo357和panc-1细胞株中，p38β表达水平与p38α相当；p38γ在7种胰腺癌细胞株中虽有表达，但水平较低。选择性抑制p38α后，miapaca-2和panc-1细胞增殖、运动和侵袭能力显著下降，且裸鼠体内成瘤实验可见肿瘤体积显著增加。选择性抑制p38β后，可以观察到细胞生长和增殖变慢，但未见运动和侵袭能力的变化。体内成瘤实验中，miapaca-2两个下调p38β细胞克隆成瘤率分别为18.3％和50.0％，较野生型和空质粒转染组显著下降，且肿瘤体积显著减小(p＜0.05)；panc-1两个下调p38β细胞克隆成瘤率为25.0％和12.5％，较野生型和空质粒转染组显著下降(p＜0.05)。
正常胰腺组织仅仅在胰岛可检测到少量p38γ的表达，导管上皮细胞检测不到其表达。但胰腺癌大多数(>80％)起源于胰腺导管上皮，提示p38γ的表达极可能与胰腺癌的发生发展及预后无关。根据目前研究尚无法推知p38γ与胰腺癌的治疗有关。
胰腺癌是癌症死亡的第四大原因。一旦起病，高度侵袭、进展迅速，易于转移，治疗极为艰难。在转移性胰腺癌患者中，确诊后生存期超过5年的患者不到3％。开发一种对胰腺癌有更好作用的药物，具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供p38γ抑制剂的新应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
p38γ抑制剂在制备实验室用pfkfb3磷酸化抑制剂中的应用。
在一些实例中，所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种。
本发明的第二个方面，提供：
一种实验用抑制细胞中pfkfb3磷酸化的方法，包括将细胞与p38γ抑制剂接触。
在一些实例中，p38γ抑制剂的用量可以根据具体的需要进行调整。
本发明的第三个方面，提供：
一种抗肿瘤药物的筛选方法，包括确定候选化合物是否可以抑制p38γ的表达或其活性，当候选化合物可以抑制p38γ的表达或其活性时，判定为具有初步的抗肿瘤候选活性。
本发明的第四个方面，提供：
p38γ抑制剂在制备治疗或辅助治疗胰腺癌药物中的应用。
在一些实例中，所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种。
本发明的第五个方面，提供：
组合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，所述组合物的活性成分包括：
至少一种p38γ抑制剂，以及
至少一种pfkfb3抑制剂。
在一些实例中，所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种；
所述pfkfb3抑制剂选自：3po和pfk15中的至少一种。
本发明的第六个方面，提供：
一种治疗胰腺癌的组合物，其活性成分包括：
至少一种p38γ抑制剂，以及
至少一种pfkfb3抑制剂。
在一些实例中，所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种；
所述pfkfb3抑制剂选自：3po和pfk15中的至少一种。
本发明的有益效果是：
发明人通过实验发现，p38γ可磷酸化pfkfb3氨基酸残基s467位点，激活胰腺癌细胞的糖酵解途径。而pfkfb3是调控糖酵解的关键限速酶，肿瘤细胞中pfkfb3活性的缺失可以显著降低糖酵解水平，并抑制肿瘤生长。通过抑制p38γ的表达或其活性，可以有效阻止pfkfb3的磷酸化修饰，降低肿瘤细胞中pfkfb3活性，抑制肿瘤的生长。通过联合使用p38γ抑制剂和pfkfb3抑制剂，在体内可有效抑制胰腺癌的增殖，为胰腺癌的治疗提供新的靶点，为临床改善胰腺癌的治疗效果提供新的思路。
附图说明
图1是体外激酶实验结合质谱分析鉴定p38γ活化pfkfb3的磷酸化位点的分析结果；
图2是体外激酶实验验证p38γ磷酸化pfkfb3/s467位点的分析结果；
图3是yis生化分析仪检测kpc和kpc-p38γ-ko细胞葡糖糖消耗和乳酸产生结果；
图4是seahorse能量代谢仪检测kpc和kpc-p38γ-ko细胞糖酵解速率和氧耗率的结果；
图5是pfd和pfk-15对kpc和kpc-p38γ-ko糖酵解速率的影响；
图6是pfd和pfk-15对kpc和kpc-p38γ-ko细胞克隆形成能力的影响；
图7～9是p38γ抑制剂(pfd)和pfkfb3抑制剂(pfk15)联合用药抑制胰腺癌细胞生长的体内验证。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
应用体外激酶实验结合质谱分析鉴定p38γ活化pfkfb3的磷酸化位点：
磷酸化修饰是pfkfb3活性的一种重要调节方式，在细胞内能量缺乏的状态下，pfkfb3可被ampk激酶磷酸化并激活，从而促进糖酵解和atp生成。为了阐明p38γ与pfkfb3的相互作用方式，我们用体外激酶实验联合质谱分析的方法，即293t细胞转染空载体对照pcdna3.1和flag-pfkfb3，flag-ip产物与纯化的his-p38γ共同孵育，sds-page电泳分离蛋白后进行质谱分析，发现p38γ可以磷酸化pfkfb3氨基酸残基ser467位点。
具体操作如下：
1、his-p38γ在bl21中的表达。将his-p38γ质粒转化bl21，接菌后挑取单克隆入2-4mlkan lb培养基中37℃摇床中培养过夜。然后将菌液以1:100接种量转接入kan lb培养基中37℃摇床培养2小时30分钟，后加入终浓度1mmiptg置37℃诱导4小时，5000rpm离心10分钟收菌。菌体用pbs洗涤一次，离心后将菌体重悬于15ml裂解液(50mmnah2po4，300mmnacl，10mmimmidazole，ph8.0)超声破碎。12000rpm离心20分钟后进行his蛋白纯化；
2、his-p38γ纯化。将his-p38γ上清加入ni-ntabeads中，4℃结合2小时，后打开盖子，让液体流下。1号洗涤缓冲液(50mmnah2po4，300mmnacl，20mmimmidazole，ph8.0)洗涤2次。2号洗涤缓冲液(0.5％triton-x100，50mmnah2po4，300mmnacl,50mmimmidazole，5mmβ-mecaptoethnol，ph8.0)洗涤2次。最后用洗脱液(50mmnah2po4，300mmnacl，250mmimmidazole，ph8.0)洗脱纯化的蛋白；
3、体外激酶实验。293t细胞转染flag-pfkfb3或者pcdna3.1，转染24小时后收集细胞，ripabuffer裂解1小时，12000rpm离心10分钟收集上清。上清液加入flagbeads4℃孵育过夜。ripabuffer洗涤两次后离心收集beads，加入1μghis-p38γ纯化蛋白和20ul反应缓冲液(20mmhepesph7.6，20mmmgcl2，15μmatp，20mmβ-glycerolphosphate，20mmρ-nitrophenylphophate，0.5mmna3vo4，2mmdtt)30℃孵育30分钟。离心收集beads，加入4x上样缓冲液95℃金属浴变性5分钟后上样，sds-page凝胶电泳分离蛋白；
4，胶内酶解。银染试剂盒显色蛋白条带，用手术刀片切下60kd左右的条带，切成1mm3大小胶块，收集到1.5mlep管内。加入50μl30mmk3fe(cn)6:100mmna2s3o3＝1:1体积比，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立即加入200μl去离子水终止反应，10分钟后去除上清，再加入100μl100mmnh4hco3静置20分钟，去除上清。每管加入90μl100mmnh4hco3，10μl100mmdtt，56℃孵化30分钟，还原蛋白质。去上清，每管加入100μl100％can，5分钟后吸去，加入70μl100mmnh4hco3，30μl200mmiaa，避光20分钟。去上清，每管加入100μl100mmnh4co3，室温15分钟。去上清，加入100μl100％can，5分钟后吸去，冻干。然后加入10μl5ng/μltrypsin溶液，4℃60分钟，使胶块充分吸胀。然后加入30μl50mmnh4hco3，37℃反应16小时。最后吸出蛋白酶解液，转移至新的ep管中，原管加入100μl60％can/0.1％tfa超声15分钟，吸出溶液，并入前次溶液，反复抽提3次，合并冻干。
5，质谱分析。thermoltq-orbitrapelite质谱仪上通过lc-ms/ms分析鉴定多肽。所有光谱均以阳离子模式获得。全扫描ms的分辨率为60000(400m/z)，前体离子扫描的范围为350-1800m/z。依次使用碰撞诱导解离(cid)和电子转移解离(etd)，选择了8个最强的母离子进行ms/ms裂解。
实验结果如图1所示，结果显示p38γ可以磷酸化活化pfkfb3氨基酸位点s467。(a)sds-page凝胶电泳分离蛋白银染结果；(b)质谱分析pfkfb3蛋白的磷酸化位点。
体外激酶实验验证p38γ磷酸化pfkfb3/s467位点
1，pfkfb3/s467a突变质粒的构建。以flag-pfkfb3质粒为模板，应用点突变试剂盒构建467位点突变的质粒(quikchangeiisite-directedmutagenesiskit，agilenttechnologies,200524)。flag-pfkfb3/s467a的引物序列如下：
forward,5'-gtgtcaccccgctagccgcccccgaacccaccaaaaag-3'；(seqidno.：)1
reverse,5'-ctttttggtgggttcgggggcggctagcggggtgacac-3'(seqidno.：2)。
2、293t细胞转染flag-pfkfb3、flag-pfkfb3/s467a和pcdna3.1，转染24小时后收集细胞，ripabuffer裂解1小时，12000rpm离心10分钟收集上清，与纯化的his-p38γ孵育后进行sds-page电泳分析。
实验结果如图2所示，结果显示仅野生型pfkfb3可以被p38γ磷酸化。
yis生化分析仪检测kpc和kpc-p38γ-ko细胞葡糖糖消耗和乳酸产生
将细胞(5×105)接种到6孔板中，培养24小时后更换新鲜培养基。继续培养48小时后，收集培养基，12000rpm离心10分钟，取上清，上机检测。收集细胞蛋白，测浓度，用于进行数据标准化。ysi2950生物化学分析仪测定样品中葡萄糖和乳酸含量。
实验结果如图3所示，结果显示p38γ敲除细胞kpc-p38γ-ko葡萄糖的消耗和乳酸产量显著低于p38γ高表达的kpc细胞。且kpc-p38γ-ko细胞pfk激酶活性也显著低于kpc细胞。
seahorse能量代谢仪检测kpc和kpc-p38γ-ko细胞糖酵解速率(extracelluaracidificationrate,ecar)和氧耗率(oxygenconsumptionrate,ocr)
1、细胞1×104/孔接种到seahorse测量专用细胞培养板，培养过夜。同时水化seahorse探针；
2、氧耗率(ocr)的测定，按照线粒体应激(mito-stress)测定要求，使用相应培养液清洗细胞后加入上机检测所需培养液，置于37℃、无co2的温箱中60分钟，在seahorse测量板a孔中oligomycin(1μm)，b孔中加入fccp(0.5μm)，c孔中加入rotenone(1μm)上机检测；
3、产酸率(ecar)的测定，细胞产酸率反应细胞糖酵解速率。按照糖酵解应激(glycolysis-stress)测定要求，使用相应培养液洗细胞后加入上机检测所需培养液，置于37℃、无co2的温箱中60分钟后，在seahorse测量板a孔中加入葡萄糖(25mm)，b孔中加入寡霉素(oligomycin，1μm)，c孔中加入2-dg(250mm)上机检测；
3、标准化测定，将完成测定的细胞板取出，吸出培养基，每孔加入50μlpbs漂洗一次，去除pbs加入20μl裂解液吹打混匀，冰上裂解15分钟，裂解后每孔加入200μlbca蛋白测定混合液，37℃孵育30分钟，酶标仪测定562nm波长的吸光度值，并将其输入seahorse软件中进行标准化。统计分析标准化后的结果。
实验结果如图4所示，结果显示与kpc细胞相比，kpc-p38γ-ko细胞糖酵解速率(ecar)显著降低。两组细胞的氧耗率(ocr)无显著差别。
pfd和pfk-15对kpc和kpc-p38γ-ko糖酵解速率的影响
实验方法同上，结果如图5所示结果显示pfd和pfk-15单独用药对kpc细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌无显著影响但联合用药可以显著抑制kpc细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌，但对无p38γ表达的kpc-p38γ-ko细胞没有抑制作用。
pfd和pfk-15对kpc和kpc-p38γ-ko细胞克隆形成能力的影响
1、微波炉中溶解1.2％argrose下胶和0.7％argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。配制20％fbs 2×imdm 2×ps，与1.2％argrose下胶按照1:1比例混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温凝固；
2、消化细胞，计数，每孔5000个细胞，准备上胶。按1:1比例混合0.7％argrose上胶和20％fbs 2×1640 2×ps，每种细胞需先配2ml(20％fbs 2×1640 2×ps) 2ml0.7％argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，迅速加入6孔板，每孔1ml，待上层琼脂凝固后，置于5％co2，37℃，培养2-3周，计数。
实验结果如图6所示，结果显示pfd和pfk-15单独用药对细胞的软琼脂克隆形成能力无显著影响，但联合用药可以显著抑制kpc细胞克隆形成能力，但对无p38γ表达的kpc-p38γ-ko细胞没有抑制作用。
p38γ抑制剂(pfd)和pfkfb3抑制剂(pfk15)联合用药抑制胰腺癌细胞生长的体内验证：
方法：kpc(5×104)、kpc/p38γko(5×104)和mia-paca-2(5×106)细胞接种到裸鼠右腋皮下，待平均肿瘤体积达50mm3时随机分组，开始给药：
①灭菌水对照组；
②pfd300mg/kg，灌胃，每天一次；
③pfk1510mg/kg，腹腔注射，每三天一次；
④pfd300mg/kg，灌胃，每天一次联合pfk1515mg/kg，腹腔注射，每三天一次；
每3日测定1次体重及肿瘤的长径和短径，按公式1计算肿瘤体积。实验结束后颈椎脱臼处死裸鼠剥离瘤块并称重，按公式2计算相对肿瘤体积(rtv)，颈椎脱臼处死裸鼠剥离瘤块并称重，按公式3计算抑瘤率(ir)。采用t检验对各组的rtv及瘤重进行统计分析。
肿瘤体积＝长径×短径2×1/2公式1
rtv＝实验结束时肿瘤体积/实验开始时肿瘤体积公式2
ir＝对照组平均rtv(或瘤重)－给药组平均rtv(或瘤重)×100％公式3
实验结果如图7-9所示，pfd或者pfk15单独用药对p38γ高表达的kpc细胞(原代小鼠胰腺癌细胞)和mia-paca-2细胞(人胰腺癌细胞)裸鼠移植瘤的生长均无显著抑制作用。单pfd和pfk15联合用药可显著抑制两种细胞裸鼠移植瘤的生长。且没有观察到小鼠体重下降或死亡。
对于无p38γ表达的kpc-p38γ-ko细胞(原代小鼠胰腺癌细胞)，pfd和pfk15单独用药或者联合用药对小鼠移植瘤的生长均无显著抑制作用。
综上可知，p38γ可磷酸化pfkfb3氨基酸残基s467位点，激活胰腺癌细胞的糖酵解途径。而pfkfb3是调控糖酵解的关键限速酶，肿瘤细胞中pfkfb3活性的缺失可以显著降低糖酵解水平，并抑制肿瘤生长。通过抑制p38γ的表达或其活性，可以有效阻止pfkfb3的磷酸化修饰，降低肿瘤细胞中pfkfb3活性，抑制肿瘤的生长。通过联合使用p38γ抑制剂和pfkfb3抑制剂，在体内可有效抑制胰腺癌的增殖，为胰腺癌的治疗提供新的靶点，为临床改善胰腺癌的治疗效果提供新的思路。
sequencelisting
<110>中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
<120>p38γ抑制剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用
<130>
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>38
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gtgtcaccccgctagccgcccccgaacccaccaaaaag38
<210>2
<211>38
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
ctttttggtgggttcgggggcggctagcggggtgacac38
1.p38γ抑制剂在制备实验室用pfkfb3磷酸化抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种。
3.一种实验用抑制细胞中pfkfb3磷酸化的方法，包括将细胞与p38γ抑制剂接触。
4.一种抗肿瘤药物的筛选方法，包括确定候选化合物是否可以抑制p38γ的表达或其活性，当候选化合物可以抑制p38γ的表达或其活性时，判定为具有初步的抗肿瘤候选活性。
5.p38γ抑制剂在制备治疗或辅助治疗胰腺癌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种。
7.组合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于：所述组合物的活性成分包括：
至少一种p38γ抑制剂，以及
至少一种pfkfb3抑制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种；
所述pfkfb3抑制剂选自：3po和pfk15中的至少一种。
9.一种治疗胰腺癌的组合物，其活性成分包括：
至少一种p38γ抑制剂；
以及至少一种pfkfb3抑制剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于：
所述p38γ抑制剂选自：pirfenidone和pik75中的至少一种；
所述pfkfb3抑制剂选自：3po和pfk15中的至少一种。
技术总结