本发明属于生物领域，特别涉及gw8510在制备哺乳动物自然衰老时延长寿命、提高认知能力等药物中的应用。
背景技术：
衰老是随着年龄增长机体组织器官功能退化的过程，与正常胚胎发育、机体老化、衰老相关疾病等都有着密切的联系。近些年对细胞衰老的研究越来越深入，其在抗衰老方面发挥的生物学作用也越来越受到重视。研究表明细胞衰老(cellularsenescence)是指随着时间的推移或面临外界应激压力时，细胞的正常生理功能和增殖能力就会逐渐发生衰退，从而脱离细胞周期，该过程与肿瘤、组织再生及机体衰老等都具有重要的联系。自线粒体衰老理论提出以来，线粒体就已经成为衰老研究的焦点。随着年龄的增长，线粒体功能会逐渐减弱，而同时随着年龄的增长，细胞退化是由活性氧(ros)引起的，其中线粒体衰老理论将线粒体作为ros的主要产生者。目前gw8510的研究仍然很少，已有的研究表明gw8510具有减少化疗副作用，防脱发，黏膜炎的用途。
技术实现要素：
为了能在哺乳动物自然衰老时延长其寿命，本发明提供了gw8510的应用。
本发明的第一方面，提供了gw8510在制备哺乳动物自然衰老时延长寿命、提高认知能力和/或提高肌肉能力和/或提高运动能力药物中的应用。
优选地，gw8510的给药剂量为0.22mg/kg/日～1.1mg/kg/日。
本发明的第二方面，提供了gw8510在制备抑制细胞周期相关蛋白p21和/或cdk家族基因表达药物中的应用。
本发明的第三方面，提供了gw8510在制备治疗和/或改善衰老细胞的线粒体功能药物中的应用。
本发明的第四方面，提供了gw8510在制备延长复制性衰老细胞系寿命药物中的应用。
优选地，所述衰老细胞系包括2bs、wi38。
有益效果：本发明提供gw8510能显著改善自然衰老小鼠的健康衰老并延长其寿命，通过体外机制研究显示，gw8510可以调控细胞周期相关蛋白p21，cdk家族基因的表达，进而改善自然衰老细胞系2bs及wi38的复制性衰老状态。还可以改善衰老细胞的线粒体功能，从而减缓衰老。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1显示gw8510能够延长芽殖酵母寿命。
图2显示gw8510可以缓解2bs(pd45)和wi38(pd45)细胞的复制性衰老；其中，gw8510对老年2bs(a)和wi38(b)细胞活力分析。处于pd45的2bs(c)细胞增殖的影响。mean±sem.n＝5-8.*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图3显示gw8510可以改善老年wi-38的细胞衰老形态；其中，(a)细胞衰老sa-β-gal染色(放大倍数×400)；(b)给药后细胞衰老markerp21基因表达变化量；(c)给药后细胞衰老相关分泌表型(sasp)mrna表达变化。mean±sem.n＝5-8.*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图4显示gw8510能够影响细胞线粒体功能以及周期相关基因的表达；其中，(a)细胞线粒体膜电位染色(tmrm)；(b)线粒体膜电位染色统计图；(c)细胞atp生成量；(d)细胞周期相关基因mrna表达变化。mean±sem.n＝5-8.*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图5显示gw8510可以延长自然衰老小鼠寿命；利用icr小鼠，18月龄开始给药干预。
图6显示gw8510可以延长自然衰老小鼠健康寿命；其中，利用c57小鼠16个月开始给药(a)新颖物体识别实验(表征认知能力)；(b)抓力实验(表征肌肉能力)；(c)疲劳转棒仪实验(表征运动能力)；(d)y-迷宫实验(表征认知能力)。
图7显示gw8510作用靶点是pak1；其中，(a-d)酵母基因敲除菌株gw8510干预下寿命曲线；(e)ste20(pak1酵母同源)敲除菌株寿命曲线；(f)gw8510和pak1蛋白spr(表面等离子共振)实验。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
icr小鼠，雄性，8周，20～22g，购买于北京大学医学部实验动物中心。
维持饲料：购买于北京大学医学部实验动物中心。
c57bl/6j小鼠，雄性，13月，25～28g，购买于北京斯贝福实验动物中心。
维持饲料：购买于北京大学医学部实验动物中心。
所有动物实验都严格按照《实验动物管理和使用指南》的要求，并取得北大实验动物管理委员会的许可。在处死动物的过程中，在麻醉的状态下并尽量减轻动物的痛苦。
2bs细胞(人二倍体成纤维细胞)，wi-38细胞(人胚胎肺成纤维细胞)购买于中国食品药品检定研究院。
gw8510，4-[(7-氧代-6,7-二氢-8h-[1,3]噻唑[5,4-e]吲哚-8-亚基)甲基]氨基]-n-(2-吡啶基)苯磺酰胺，cas：222036-17-1，其分子式为c21h15n5o3s2，化学式结构为：
是一种黄色粉末，水溶性较差，加热可促溶，平均分子量约为449.51g/mol。在本发明中，小鼠给药时将gw8510溶于生理盐水，细胞实验中gw8510溶解于细胞完全培养基。
实施例1gw8510延长酵母复制寿命、延缓细胞衰老和线粒体功能
一、实验方法
1、芽殖酵母培养微流实验
在衰老领域，高等动物或者灵长类恒河猴是研究人类衰老的最理想的替代模型，但由于实验的复杂性、周期长、成本高以及伦理方面的诸多原因使得对于它们的研究存在诸多挑战。但对于低等短寿命模式生物而言，它们大多系统相对简单、成本低、研究时间短，是研究衰老机制的理想模型。因此从实际问题出发，恰当地选择衰老相关模式生物，充分发挥模式生物的优势对于进一步完善衰老及其机制的研究极其重要。saccharomycescerevisiae是人类衰老研究中最简单的单细胞真核生物，其细胞的衰老代谢机制与人体细胞代谢机制相似，其简单而独特的生长代谢规律使其成为细胞衰老研究的重要模式生物。芽殖酵母的培养基分液体培养基sd及固体培养基yepd，其均含有酵母生长所需的氨基酸及葡萄糖。因为酵母在yepd上存活时间远长与sd，于是选用yepd用于酵母的培养及菌种保存，选用sd进行微流实验，有利于缩短实验周期。
先从yepd培养基上挑取少量单克隆菌落放入sd培养基，于30℃摇床中震荡培养20h，然后将生长至一定数量的酵母通入微流芯片。使用显微拍照设备，每隔10min对芯片内部酵母分裂情况进行一次拍摄，一共跟踪拍摄48～60h，监测并记录酵母在整个生命周期的分裂次数，以此来反映酵母的寿命是否得到延长。
2、细胞复苏与冻存
从液氮中取出冻存的2bs和wi-38细胞，立即放入37℃水浴锅中晃动，使之迅速融化。在超净工作台上将2bs细胞转移至离心管(含5ml完全培养基)，封口膜封口后置于离心机内800rpm离心4min，弃上清留取沉淀物，再加入1ml完全培养基。轻柔吹打至细胞分散呈单个后，移入新的无菌培养皿中并放置在37℃5％co2培养箱中进行培养。
消化得到的细胞液转移至离心管，封口膜封口后置于离心机内800rpm离心4min，弃上清留取沉淀物加入1ml细胞冻存液(90％完全培养基 10％dmso)。轻柔吹打细胞，转移至1.5ml冻存管中，先放置于4℃冰箱静置30min，再放置于-20℃冰箱静置2h，再于-80℃冰箱隔夜静置，最后隔日冻存于液氮罐中。
3、细胞培养与传代
离体实验采用的细胞使用含有10％胎牛血清、100u/mlpenicillin和100mg/mlstreptomycin的dmem(2bs及wi38用mem)培养液，置于co2细胞培养箱中，培养条件为37℃，饱和湿度，5％co2，95％空气。
当细胞长至80％-90％时，倒掉培养基，用pbs缓冲液缓慢冲洗3遍，然后加入1ml0.125％胰蛋白酶，轻轻摇晃至完全覆盖细胞，消化2min左右，在显微镜下观察细胞突起的触角回缩呈圆形后，马上倒掉胰酶，加入1ml完全培养基终止消化。用吸管轻柔的反复吹打细胞直至全部脱落，转移至离心管，封口膜封口后置于离心机内800rpm离心4min，弃上清留取沉淀物加入1ml完全培养基。轻柔吹打至细胞分散呈单个后，以1:2比例传代至新的无菌培养皿中并放置在37℃5％co2培养箱中进行培养。
4、细胞计数
取待计数细胞，在超净台中冲洗、消化后，加入适量细胞完全培养基，重悬细胞并吹打均匀，用10/20μl移液器吸取10μl细胞悬液，轻轻滴到细胞计数板盖玻片一侧的边缘，使盖玻片和计数板之间充满细胞悬液，放置3分钟(注意盖玻片下不要有气泡，以免影响计数准确度)，于光学显微镜下用细胞计数器进行计数，再根据相应公式进行计算得到最终细胞总数(计算公式：细胞总数/ml＝四个大格细胞总数/4×104个/ml)
5、细胞活力测定
cellcountingkit-8是一种基于wst-8的细胞活力检测试剂盒。wst-8是一种类似于mtt的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan，96孔板每孔加入10％cck8试剂后，37℃孵育1h，酶标仪450nm测定吸光度。每组设5复孔，细胞活力通过下列公式计算：
cellviability(％)＝(odtreatmentgroup-odblank)/(odcontrolgroup-odblank)×100。
6、细胞增殖检测
取对数生长期的细胞用胰酶消化，以每孔3.5×103个/100μl的密度接种于96孔板，每组设5个复孔，从左到右按时间点顺序(第0,1,2,3,4,5,6天)排列，每个时间点下分为对照组与给药组。96孔板的边缘孔用无菌pbs充填防止边缘效应。置于co2细胞培养箱中，培养条件为37℃，饱和湿度，5％co2，95％空气。接种后四小时以上待细胞贴壁，吸除第0天组细胞培养液，每孔加入10％cck8试剂后，37℃孵育1h，酶标仪490nm测定吸光度。其余分别进行换液，以后每天同一时间测对应时间点的细胞吸光度，直至监测一周，最后根据吸光度值绘制一周细胞增殖曲线。
7、总rna提取
弃去培养液，用pbs洗涤一次。每10cm2培养面积的细胞加入1-2mlrnaisolater，充分覆盖到细胞表面,然后用移液器将细胞吹打下来；移至1.5ml离心管中,反复吹打，冰上静置5min；加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15s,4℃静置5min；12,000g、4℃、离心15min；吸取上层水相至一个新的离心管中；加入等体积异丙醇,颠倒混匀；4℃置10min；12,000g4℃离心10min；弃上清，加入1ml用depc水配制的75％乙醇；轻弹管底，让沉淀悬浮起来,静置3-5min；12,000g、4℃离心5min，弃上清；干燥沉淀2-5min；加入适量的depc水溶解沉淀。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，计算od260/od280检测纯度及浓度。
8、荧光定量pcr
将rna模板、引物、2×ultrasybronesteprt-qpcrbuffe(rwithrox)、superenzymemix和rnase-freewater溶解并置于冰上备用。
表1pcr反应体系1
涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。将热循环仪预热到45℃，将pcr管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应。
表2pcr反应条件2
9、衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-βgal)染色(sabg染色法)
1995年，dimri等第一次用衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-βgal)来鉴定组织衰老，此后这一方法被广泛使用，比较著名的是2009年wang等用肝中sa-βgal和dna损伤的精细对比量，得到可比较的数据资料：年轻老鼠中衰老细胞8％，年老老鼠中衰老细胞17％。此方法原理是基于sa-β-gal在衰老细胞中的特异性高活性表达，而染色剂中的x-gal被sa-βgal催化生成显微镜下可见的蓝色产物，从而染色衰老细胞，而不会染色衰老前的细胞、静止期细胞、永生细胞或肿瘤细胞。
染色工作液按“细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒”说明书方法配置，再放于摇床上震荡30min，取出后经0.22μm微孔滤膜过滤，该法可有效改善染色液析晶对于照片处理的干扰。染色液工作液应注意避光，现用现配。
操作方法：培养皿中培养液吸除，pbs轻轻冲洗3遍，每遍5min，再加入定量β-半乳糖苷酶染色固定液(六孔板对应加入1ml，96孔板对应加入100μl)，室温固定15min，吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次5min。吸除pbs，每孔加入能够完全覆盖培养皿底部的定量染色工作液(六孔板对应加入1ml，96孔板对应加入100μl)。37℃恒温培养箱(空气)中孵育过夜，用封口膜封住六孔板防止蒸发，再用锡纸包住六孔板遮光。
隔日弃除染色液，加入能够完全覆盖培养皿底部的定量核固红染色液复染(核固红复染使得细胞轮廓更加清晰)，静置7min。弃除染色液，加入pbs，显微镜下观察，100倍拍照记录，染上蓝色的阳性细胞即为衰老细胞。
10、线粒体膜电位染色
线粒体膜电位染色试剂盒购自赛默飞公司(货号：i34361)。细胞生长至70％左右加无血清培养基同步化12h，给药生长24h；去除细胞生长培养基；向细胞中加入细胞染色液；在37℃下孵育30分钟；用pbs洗涤，用激光共聚焦检测。
11、atp含量检测
试剂盒购自碧云天公司(货号：s0026)。样品准备：吸除培养液，6孔板每孔加入200微升裂解液，裂解细胞。裂解细胞时为了裂解充分，使用移液器进行反复吹打。裂解后4℃12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。标准曲线测定的准备：冰浴上融解待用试剂，把atp标准溶液用atp检测裂解液稀释成适当的浓度梯度。设置浓度梯度0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μm。atp检测工作液的配制：按照每个样品或标准品需100微升atp检测工作液的比例配制适当量的atp检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的atp检测试剂，按照1:9的比例用atp检测试剂稀释液稀释atp检测试剂。稀释后的atp检测试剂即为用于后续实验的atp检测工作液。atp浓度的测定：a.加100微升atp检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5分钟，以使本底性的atp全部被消耗掉，从而降低本底。b.在检测孔或检测管内加上20微升样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2秒后，用化学发光仪(luminometer)测定rlu值。
二、实验结果
1、gw8510能够延长芽殖酵母寿命
首先选取经典衰老模式生物芽殖酵母作为研究对象，采用微流技术，检测了不同浓度gw8510作用下芽殖酵母的寿命。结果如图1，与对照组相比，给药组芽殖酵母寿命均有一定程度改变，且在gw8510浓度为5μm时，可以显著延长芽殖酵母的寿命。说明gw8510在一定程度上改善了芽殖酵母的复制性衰老表现。
2、gw8510能够缓解细胞复制性衰老
gw8510的抗衰老作用在模式生物芽殖酵母中得到初步验证后，接下来，采用两种自然衰老细胞系：2bs(人胚肺二倍体细胞)和wi38(人胚肺成纤维细胞)作为研究对象，进一步探究gw8510在体外的抗衰老作用。首先通过细胞活力测定实验，检测gw8510对老年(pd45)2bs及wi38细胞活力影响。结果如图2a，b所示，gw8510对2bs及wi38细胞无明显的细胞毒作用，且细胞活力显著高于对照组。接着继续探究gw8510对细胞增殖能力的影响，通过细胞活力测定实验跟踪检测并绘制一周增殖曲线，在490nm波长处吸光度值越大表明细胞增殖速率越高，而增殖速率减缓也是细胞衰老的重要表现之一。结果如图2c所示，gw8510能够显著促进细胞增殖，而对照组细胞随着时间增长，增殖速率减缓，且两组差异随时间增长逐渐增大。
3、gw8510能够改善细胞复制性衰老
检测了衰老细胞的增殖分裂能力之后，继续采用wi-38细胞作为研究对象，进一步探究gw8510在对衰老细胞的作用。进行了细胞衰老sa-β-gal染色分析观察细胞形态改变。结果如图3a所示，老年wi-38(pd45)相比于年轻wi-38(pd30)细胞β-半乳糖苷酶染色阳性更多，提示细胞衰老。而给予gw8510后衰老染色结果相比于对照组，给药组成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色阳性比例显著下降。接着检测了年轻与衰老细胞中衰老相关标志基因的p21的表达。结果如图3b所示，在衰老细胞中p21表达显著升高，而给药干预后其显著性降低。最后检测了给药之后细胞衰老相关分泌表型基因表达变化。结果如图3c所示，相比于对照组，给药组这几个标志性基因表达水平显著下调，且存在统计学差异。以上结果从衰老细胞染色与衰老相关基因表达变化提示gw8510具有一定的抗衰老作用。
4、gw8510可以改善线粒体功能并上调周期相关基因的表达
接着检测了gw8510能否改善线粒体功能，发现在gw8510的干预下，线粒体膜电位显著上升，并有统计学意义，如图4a-b所示，同时还检测atp的产生量，也有明显的差异，以上结果说明gw8510可以改善线粒体功能。最后还发现gw8510可以上调周期相关基因的表达，如图4c所示。
实施例2
一、实验方法
1、gw8510可以延缓自然衰老小鼠寿命
采用18月龄自然衰老icr小鼠作为对象，探究gw8510对自然衰老小鼠的抗衰老作用。对18月龄衰老小鼠分别注射给予生理盐水、2mg/kg与10mg/kg(按照小鼠和人给药剂量关系对比，人的给药剂量为0.22mg/kg、1.1mg/kg)，每天一次，持续给药一周，停3周，重复2次，给药期间记录小鼠存活时间，结果如图5所示，gw8510干预的情况下小鼠寿命明显延长。
2、gw8510可以改善自然衰老小鼠的健康寿命
采用16月龄自然衰老c57小鼠作为对象，对16月龄衰老小鼠分别注射给予生理盐水、2mg/kg与10mg/kg，每天一次，持续给药一周，停3周，重复4次，间歇2个月，再进行每天一次，持续给药一周，停3周，重复2次，给药情况下，小鼠的认知能力(如图6a，d)，肌肉能力(如图6b)，运动能力(如图6c)都得到了明显的改善。
3、gw8510作用于pak1蛋白
首先在酵母中寻找可能的靶点，发现在yck1基因敲除菌株(如图7a)，ypk2基因敲除菌株(如图7b)，tpk2基因敲除菌株(如图7c)，cap1基因敲除菌株(如图7d)中，gw8510延长寿命的效果仍然存在。而在ste20(如图7e)基因敲除菌株中，gw8510不能延长其寿命，所以将其对应到人源的蛋白pak1蛋白，发现gw8510可以和pak1蛋白结合，结合系数kd(m)＝8.155e-07(如图7e)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.gw8510在制备哺乳动物自然衰老时延长寿命、提高认知能力和/或提高肌肉能力和/或提高运动能力药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于：gw8510的给药剂量为0.22mg/kg/日～1.1mg/kg/日。
3.gw8510在制备抑制细胞周期相关蛋白p21和/或cdk家族基因表达药物中的应用。
4.gw8510在制备治疗和/或改善衰老细胞的线粒体功能药物中的应用。
5.gw8510在制备延长复制性衰老细胞系寿命药物中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于：所述衰老细胞系包括2bs、wi38。
技术总结