本发明涉及一种具有麦芽糖水解酶抑制活性的药物组合物及其应用，属于医药生物领域。
背景技术：
糖尿病(diabetes)是一类慢性高血糖疾病，可主要归类为1型(胰岛素依赖性糖尿病)和2型(非胰岛素依赖性糖尿病)，2型糖尿病是最常见的形式，占所有糖尿病患者的90％以上，此外，当血糖高于正常血糖范围，而又低于糖尿病血糖范围的状态为糖尿病前期，也称为前驱糖尿病。前驱糖尿病是2型糖尿病的前期阶段，如果前驱糖尿病患者不改变其生活状态，超过70％的患者将会发展为2型糖尿病(thelancet,2012,379:2279-2290)。糖尿病及糖尿病前期伴随着胰岛素分泌或抵抗引起的糖、脂、蛋白代谢紊乱，病因多而复杂，是一种代谢性疾病，也是全世界最重要的公共健康问题之一。根据国际糖尿病联合会的统计，截至2017年，全球糖尿病患者数达4.25亿，2045年糖尿病患者人数将会上升至6.29亿。每年有500万人死于糖尿病，应用于糖尿病的医疗开支在疾病医疗开支中位列第二。目前中国糖尿病医疗花费居世界第二位，仅次于美国(internationaldiabetesfederation.idfdiabetesatlas,2017)。流行病学调查也显示，我国前驱糖尿病的患病率为35.7％。由糖尿病引起的一系列并发症常涉及多个器官，如血管损伤、动脉粥样硬化、常见感染和癌症的风险增加等，严重影响着患者的身心健康与生活品质，增加了发病率和死亡率，成为家庭与社会的沉重负担。糖尿病的高发生率对生活质量和医疗系统的经济成本都有重大影响，这是一个重大的公共卫生问题。
延缓，调节或抑制碳水化合物水解酶可以有效控制1型、2型糖尿病和前驱糖尿病的高血糖。α-葡萄糖苷酶在参与碳水化合物和能量代谢中起着重要作用。淀粉首先由唾液α-淀粉酶和胰腺α-淀粉酶催化，直链淀粉水解生成麦芽糖和麦芽三糖，支链淀粉水解生成麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖和极少量的葡萄糖和极限糊精。这些α-淀粉酶的水解产物中，以α-1,4葡萄糖苷键连接的麦芽糖及麦芽寡糖占主要部分，这些麦芽糖或麦芽寡糖在小肠被专一水解α-1,4葡萄糖苷键的麦芽糖酶水解，可生成葡萄糖，吸收入血，因此也有人将其归类为α-葡萄糖苷酶，但准确地讲，麦芽糖水解酶只是具有水解α-1,4葡萄糖苷键功能的α-葡萄糖苷酶。在哺乳动物小肠的糖苷酶中，具有α-1,4葡萄糖苷键水解功能的主要包括麦芽糖酶(maltase)和葡糖淀粉酶(glucoamylase)，这两个酶彼此相连形成麦芽糖-葡糖淀粉酶(maltase-glucoamylase,mgam)，而麦芽糖酶和葡糖淀粉酶也分别被称为mgam的n端和c端。研究中经常以一定量的麦芽糖为底物进行水解反应，根据水解产物葡萄糖的多少，反应麦芽糖水解酶的活性。研究表明麦芽糖水解酶抑制剂，能够有效降低餐后血糖，从而阻止糖尿病的发展的有效手段(bioorgmedchem,2011,19(13):3929-3934)。临床上已经使用了几种口服α-葡萄糖苷酶药物，例如阿卡波糖，伏格列波糖和米格列醇，具有麦芽糖水解酶的抑制活性并控制餐后高血糖。但是这些药物通常具有许多副作用，例如腹胀，肠胃气胀，腹泻和肠气肿。因此，由于它们的低成本和相对安全性，有必要找到植物性食品作为麦芽糖水解酶抑制剂的替代品。
为了发现新的麦芽糖水解酶抑制剂，人们也做了很多的尝试，发现黄酮类化合物显示出对α-葡萄糖苷酶的良好抑制作用。黄酮类化合物在自然界中分布十分广泛，在菊科、豆科、唇形科、芸香科植物中较多，在植物中常以苷元或糖苷的形式存在。黄芩、云实、麻栎、刺楸、银杏、金银花、木犀草、甜菜等植物均含有黄酮成分(jnutrscivitaminol,2006,52,149-153)。它们显示出广泛的生物活性，例如抗氧化，抗炎和抗糖尿病。其中，黄芩素可从黄芩、木蝴蝶中分离得到；槲皮素可从刺楸、银杏中分离得到；野黄芩素可从灯盏花中分离得到；六羟黄酮可从万寿菊中分离得到。黄酮类化合物对麦芽糖水解酶的抑制作用也有一些报道，例如，研究表明，一些黄酮类化合物以及含有黄酮类化合物的植物提取物具有糖苷酶抑制剂的性质，如杨梅素、槲皮素、山奈酚、非瑟酮、木犀草素、大豆苷元、染料木素等对于酵母源麦芽糖水解酶具有较强的抑制作用。然而，黄酮类化合物的降血糖活性和生物利用度较低，对于哺乳动物源的麦芽糖水解酶抑制剂抑制作用较弱。
1-脱氧野尻霉素(1-dnj)属于哌啶类多羟基生物碱，该类生物碱与吡喃糖的结构类似，是吡喃糖环上的氧原子被氮原子取代而形成的一系列化合物。1-dnj主要来自源于浅紫灰链霉菌、芽孢杆菌等微生物以及桑、风信子等植物，1-dnj具有较强的麦芽糖水解酶抑制活性，具有降血糖功效。但微生物及植物中的1-dnj含量低至约0.1％(100mg/100g干品)，且生物利用度较低。尽管1-dnj在体外具有良好的麦芽糖酶水解酶抑制活性，但它的功效相当温和，降糖活性偏弱，尚不能应用于临床(journalofagriculturalfoodsandchemistry,2007,55,8928,沈阳药科大学学报，2000,17,456-460)。
药物的协同作用是药物发现的主要来源，虽然不同的协同作用的药物机理不尽相同，但人们已经可以选用一些方法评价药物的协同作用，例如，chou等人提出了通过计算协同指数(ci,combinationindex)的方式来评价药物之间的协同作用，这种计算模型既可以是适用于动物实验，也可以是适用于体外酶学、抑菌、细胞实验，并且对联用药物的剂量设置，没有十分苛刻的要求。根据药物间的协同、叠加和拮抗作用，药物相互作用计算出的ci值可以分为三个区间。其中协同作用ci<0.9；叠加作用0.9<ci<1.1；拮抗作用ci>1.1。而在评价药物协同作用的强弱时又可以将ci值分为几个区间，小于0.3为强协同；大于0.3小于0.7为较强协同；大于0.7小于0.9为轻微协同。为评价药物协同作用的强弱，提供了一种有效评价方式。
对于作用机制比较复杂的糖尿病，人们已经开始使用开发各种具有协同作用的药物，两种针对ii型糖尿病的联用药物glucovance和avandamet已经fda批准上市，分别是二甲双胍与格列本脲的联用和二甲双胍与罗格列酮的联用，可通过不同的糖代谢途径降低餐后血糖，但是无法避免糖尿病药物的继发性失效，且易导致患者低血糖。中国专利申请号201210158501.3公开了木蝴蝶种子提取物与阿卡波糖协同抑制α-葡萄糖苷酶的作用。此外，药物学家仍在致力于寻找其他具有协同降血糖作用，并且副作用低，维持平稳餐后血糖、不易引发低血糖的药物组合物。但据我们所知，目前黄酮类成分对1-dnj具有协同抑制麦芽糖水解酶的作用尚未见任何报道。
技术实现要素：
为解决现有技术中麦芽糖水解酶抑制剂副作用较大等问题，本发明提供一种包括5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物和1-脱氧野尻霉素的药物组合物，该组合物既能使联用药物间具有协同作用提升药效，并且药物组合物均为天然产物活性成分，副作用低，可降低餐后血糖，预防或治疗糖尿病及肥胖症。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
一种具有麦芽糖水解酶抑制活性的药物组合物，包括5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物和1-脱氧野尻霉素，所述5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物选自以下单体、单体的有机盐或单体的无机盐中的至少一种：黄芩素、野黄芩素或六羟黄酮。
进一步地，所述5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物和1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为5～50,000:1。
进一步地，优选所述黄芩素、其有机盐或其无机盐与1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为10～50,000:1，其中更优选所述黄芩素、其有机盐或其无机盐与1-dnj的混合比例按摩尔比为40～40,000:1，最优选101～25740:1；优选野黄芩素、其有机盐或其无机盐与1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为5～30,000:1，其中更优选所述野黄芩素、其有机盐或其无机盐与1-dnj的混合比例按摩尔比为20～20,000:1，最优选58:1～14947:1；优选六羟黄酮、其有机盐或其无机盐与1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为10～20,000：1，其中更优选所述六羟黄酮、其有机盐或其无机盐与1-dnj的混合比例按摩尔比为40～12,000:1，最优选136～8695:1。
本发明的上述药物组合物中的任一技术方案，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。其在药学上可接受的载体和/或赋形剂是一种或多种常用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或矫味剂的载体。填充剂可选自淀粉、蔗糖、乳糖或微晶纤维素；粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠；表面活性剂可以是十六烷醇或十二烷基硫酸钠；润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、镁、微粉硅胶或聚乙二醇等。
本发明的另一目的在于提供一种包含上述任一所述的药物组合物的制药剂型，包括片剂、胶囊剂、滴丸剂或颗粒剂。
本发明的药物组合物的各种制药剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备所需要的制剂。例如，片剂可为普通片、薄膜片、肠溶片等，可以用上述组合物干粉，加入适量稀释剂选自淀粉、糊精、甘露醇、微晶纤维素，适量的粘合剂选自水、乙醇、纤维素、淀粉、明胶，适量的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、海藻酸钠，以及适当的润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇，加入甜味剂，选自d-木糖、木糖醇、麦芽糖醇、甜叶菊素、天冬甜母，按常规湿法制粒，干燥后整粒或者干法制粒后压片，如为包薄膜衣片，用成膜材料选自纤维素类、聚乙二醇类，按常规包衣，分装入密闭瓶或者铝塑板中。胶囊剂可为普通胶囊剂、肠溶胶囊剂等，可将药物组合物干粉加入适当辅料选自碳酸钙、甘露醇、氧化镁、微粉硅胶等，适当润滑剂选自滑石粉、硬脂酸镁、乙二醇酯、聚硅酮类，以及适当的粘合剂选自矿物油、食油，并加入适当甜味剂，选自d-木糖、木糖醇、麦芽糖醇、甜叶菊素、天冬甜母，混合成干粉或者制成颗粒，填充入胶囊，分装在密闭瓶或者铝塑板中。
本发明所述的具有麦芽糖水解酶抑制活性的药物组合物可用于制备治疗糖尿病药物中，所述的糖尿病为i型糖尿病、ii型糖尿病和糖尿病前期，所述α-糖苷酶针对的底物为麦芽糖。
本发明的药物组合物可通过口服的方式施用于需要这种治疗的患者。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种包括5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物和1-脱氧野尻霉素的药物组合物，具有良好的降糖效果，可有效协同作用提升药效，且副作用低。
因此，本发明的药物组合物能更有效的降低餐后血糖，能够抑制以麦芽糖和为底物麦芽糖水解酶活性，完全使用天然药物活性成分，因此可以提高药效，副作用低，而且还有效地解决了药物联用易引发低血糖等问题。
附图说明
图1a至图1e.黄酮和1-脱氧野尻霉素的化学结构；图1a为黄芩素；图1b为野黄芩素；图1c为六羟黄酮；图1d为槲皮素；图1e为1-dnj。
图2.黄芩素与1-脱氧野尻霉素协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶，图中数值为联用药物的ci值。
图3.野黄芩素与1-脱氧野尻霉素协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶，图中数值为联用药物的ci值。
图4.六羟黄酮与1-脱氧野尻霉素协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶，图中数值为联用药物的ci值。
图5a和图5b.纯化后的麦芽糖-葡糖淀粉酶的碳/氮端电泳分析图。
图6.槲皮素与1-脱氧野尻霉素协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶，，图中数值为联用药物的ci值。
图7.阿卡波糖对小鼠小肠麦芽糖水解酶的抑制。
图8.黄芩素降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高实验(*p<0.05，#p<0.01)。
图9.1-dnj降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高实验(*p<0.05，#p<0.01)。
图10.黄芩素与1-脱氧野尻霉素联用及阿卡波糖降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高实验(*p<0.05，#p<0.01)。
图11.黄芩素与1-脱氧野尻霉素联用及阿卡波降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高实验的曲线下面积分析(*p<0.05，#p<0.01)。
图12.黄芩素和1-脱氧野尻霉素单用以及联用降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高实验的曲线下面积分析。(*p<0.05，)。
图13.黄芩素与1-脱氧野尻霉素联用葡萄糖负荷小鼠餐后血糖升高实验(*p<0.05)。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明中使用的材料和方法：
材料：
本发明所使用的1-dnj购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％；黄芩素、槲皮素购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％；野黄芩素，六羟黄酮购于上海源叶生物科技有限公司公司，纯度≥98％，阿卡波糖购自拜耳医药保健有限公司；麦芽糖购于上海索莱宝生物科技有限公司。
方法：
抑制率的计算方法：
以小鼠小肠α-葡萄糖苷酶为酶源，以麦芽糖为底物，葡萄糖氧化酶法测定生成葡萄糖浓度，按照以下公式计算抑制剂单独或混合使用对酶的抑制率：
其中：
样品组(a)：加入抑制剂后的吸光值
对照组(a)：不加抑制剂，只加入对照缓冲液和酶的吸光值
以各药物单用、联用抑制率随剂量的变化做图，对比单用、联用间抑制率的差异。
协同指数的计算：
按chou等人的理论，使用compusyn软件对联用药物在各个抑制率点上的协同指数(ci)进行计算。
其中：
(d)1：抑制剂1单用达到某特定药效所需剂量
(d)2：抑制剂2单用达到某特定药效所需剂量
(dx)1：抑制剂联用达到某特定药效所需抑制剂1的剂量
(dx)2：抑制剂联用达到某特定药效所需抑制剂2的剂量
如果ci小于0.9，则为协同作用；ci大于0.9小于1.1，则为叠加作用；ci大于1.1，则为拮抗作用。在协同作用的范围内，ci值越小，协同作用越强。
下述实施例用于解释本发明。但是这些实施例绝非意欲限制本发明或其保护范围。这些实施例说明以本发明组合物所取得的协同关系。
实施例1黄芩素与1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的协同抑制
将昆明小鼠(20～23g)禁食16h，断颈处死后取小肠，剖开，用预冷的pbs(0.1m，ph7.0)缓冲液冲洗，后按照1:10(w/v)加入pbs缓冲液。将小肠剪成碎段后匀浆，4℃，10000r/min，离心15min，取上清液作为试验用α-葡萄糖苷酶母液。
酶反应体系总体积为250μl，包括酶液、黄芩素、1-dnj、麦芽糖、缓冲液各50μl，其中黄芩素溶解于50％dmso。首先将酶与两种抑制剂混匀，37℃温育30min，加入50μl麦芽糖溶液启动反应。37℃温育，反应20min。样品置于沸水中5min，以终止反应。使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定生成葡萄糖浓度，待样品冷却，各取5μl，加入200μl葡萄糖氧化酶工作液中于96孔板。充分混匀后37℃反应15min。酶标仪505nm下测定样品吸光值，计算抑制率和ci值。
1-dnj单独使用时，在0.023～0.368μm范围内，对麦芽糖水解酶的抑制率从28.7％增至72.1％。单独使用黄芩素，浓度从37增加到592μm时，对麦芽糖水解酶的抑制率从10.2％增加至68.1％，抑制活性较低。但37、74、148、296、592μm黄芩素分别与0.023、0.046、0.092、0.184、0.368μm1-dnj联用，在各个剂量点上联用抑制率较单用抑制率均有明显提高，ci值均小于0.7(表1)，部分代表性的协同抑制ci值如图2所示，结果表明黄芩素与1-dnj联用对于麦芽糖水解酶水解麦芽糖的过程具有较强的协同抑制作用。
表1.黄芩素与1-dnj协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶的ci指数
实施例2野黄芩素与1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的协同抑制
α-葡萄糖苷酶的制备及抑制率测定方法与实施例1相近，只是将黄酮类化合物换为野黄芩素。将21.5、43、86、172、344μm野黄芩素分别与0.023、0.046、0.092、0.184、0.368μm1-dnj联用，在各个剂量点上联用抑制率较单用抑制率均有明显提高(表2)，ci值均小于0.6，部分代表性的协同抑制ci值如图3所示，结果表明野黄芩素与1-dnj联用对于麦芽糖水解酶水解麦芽糖的过程具有较强的协同抑制作用。
表2.野黄芩素与1-dnj协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶的ci指数
实施例3六羟黄酮与1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的协同抑制
α-葡萄糖苷酶的制备及抑制率测定方法与实施例1相近，只是将黄酮类化合物换为六羟黄酮。将25、50、100、200μm六羟黄酮分别与0.023、0.046、0.092、0.184μm1-dnj联用，在各个剂量点上联用抑制率较单用抑制率均有明显提高(表3)，ci值均小于0.8，部分代表性的协同抑制ci值如图4所示，结果表明六羟黄酮与1-dnj联用对于麦芽糖水解酶水解麦芽糖的过程具有较强的协同抑制作用。
表3.六羟黄酮与1-dnj协同抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶的ci指数
实施例4不同种黄酮对小鼠麦芽糖水解酶以及重组mgamc端和n端抑制活性比较
由实施例1-3可知，黄芩素、野黄芩素和六羟黄酮单用对麦芽糖水解酶的ic50分别为225.5±12.0、80.1±3.8和260.0±12.9μm，而槲皮素在测定浓度下未达到50％的抑制率，进一步提高槲皮素浓度，可知其对麦芽糖水解酶的ic50为322.6±5.0μm，弱于黄芩素、野黄芩素和六羟黄酮。
为了验证黄酮的麦芽糖水解酶的活性，我们构建并表达了具有麦芽糖水解活性的mgam的c端和n端，并进行了纯化。分别pcr扩增人源mgam87-956氨基酸和960-1853氨基酸的mgam-c/n目的基因，酶切后与ppic9k载体连接，热激转化入大肠杆菌e.colidh5α，培养转化子测序。选取测序正确的阳性菌株，过夜培养提取重组质粒。sali酶切线性化ppic9k-mgam-c/n重组质粒后转化进入毕赤酵母gs115感受态细胞中，使用斑点杂交方法进行高表达菌株筛选。之后进行蛋白表达，随后用镍离子金属螯合层析的方法纯化重组蛋白，获得高纯度mgam-c/n蛋白(图5a和图5b)。
测定四种黄酮对mgam的c端和n端活性，方法同实施例1，只是将酶液换为重组表达的mgam的c端和n端活性，黄芩素、野黄芩素、六羟黄酮和槲皮素对mgam的c端的ic50分别为281.9±13.1，17.1±0.5，298.6±4.6和289.8±19.1μm。对mgam的n端的ic50分别为98.2±8.1，63.5±0.7，76.0±14.3以及大于400μm，表明四种黄酮对mgam的c端和n端活性有差别，野黄芩素对mgam的c端和n端活性均较好，黄芩素和六羟黄酮对mgam的n端活性较好，槲皮素对mgam的c端有活性，但偏弱，对n端无活性。
对比例1槲皮素与1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的抑制作用实验
α-葡萄糖苷酶的制备及抑制率测定方法与实施例1相近，只是将黄酮类化合物换为槲皮素。将45、90、180μm槲皮素分别与0.023、0.046、0.092μm1-dnj联用，在各个剂量点上联用抑制率较单用抑制率有提高，但ci值均接近0.9，部分协同抑制的ci值如图6所示，结果表明槲皮素与1-dnj联用对于麦芽糖水解酶水解麦芽糖的过程具有较弱的协同作用。
对比例2黄芩苷与1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的抑制作用实验
α-葡萄糖苷酶的制备及抑制率测定方法与实施例1相近，只是将黄酮类化合物换为黄芩苷。将400μm黄芩苷与0.092μm1-dnj联用，ci值大于0.9，结果表明黄芩苷与1-dnj联用对于麦芽糖水解酶水解麦芽糖的过程不具有协同作用。
对比例3桑叶提取物和1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的抑制作用实验
取辽宁省金州地区的桑叶原料40g，加入400l的60％乙醇水溶液，80℃回流提取3次，每次30min，三次提取液合并过滤，将乙醇去除，用正己烷萃取去除油脂成分，乙酸乙酯萃取后，蒸干成浸膏。以芦丁为标准品，用紫外法(490nm)测得该浸膏的黄酮含量为35％，不同浓度的(50-500μg/ml)黄酮和1-dnj(0.023-0.184μm)联用，并计算协同指数ci值，ci值均大于0.9，未显示出协同抑制作用。
实施例5不同种黄酮与1-dnj对小鼠小肠麦芽糖水解酶的协同抑制对比
由实施例1-4可知，不同结构的黄酮与1-dnj联用时，对小鼠小肠麦芽糖水解酶的协同作用有所不同，比如0.092μm1-dnj和148μm黄芩素联用时，对麦芽糖水解酶的抑制率为72％，ci值为0.43；0.092μm1-dnj和86μm野黄芩素联用时，对麦芽糖水解酶的抑制率为68％，ci值为0.65；0.092μm1-dnj与100μm六羟黄酮联用时，对麦芽糖水解酶的抑制率为65％，ci值为0.39；0.092μm1-dnj和233μm槲皮素联用时，对麦芽糖水解酶的抑制率为63％，ci值为0.74。即黄芩素、野黄芩素和六羟黄酮与1-dnj联用时，协同作用较强，槲皮素与1-dnj联用时，协同作用较弱，表明5,6,7-三羟基取代的黄酮和1-dnj联用具有更好的抑制小鼠小肠麦芽糖水解酶作用。
对比例4黄酮和1-dnj联用与阿卡波糖单用对小鼠小肠麦芽糖水解酶抑制活性对比
按照实施例1的方法，测定了临床中使用的药物阿卡波糖对小鼠小肠麦芽糖水解酶的抑制活性，结果显示其ic50为1.7μm(见图7)，对比实施例1-3可知(见图2～4)，1-dnj和黄芩素、野黄芩素和六羟黄酮联用时，达到50％抑制率时，1-dnj的剂量均在别为0.023～0.046μm，不仅低于1-dnj单用时的0.184μm，也远低于阿卡波糖的剂量。此外，从阿卡波糖的抑制曲线可以看出，阿卡波糖的ic50虽然也较低，表明其具有较好的降糖作用。但随着阿卡波糖浓度的增加，抑制率增加较慢，如剂量增大到16μm时(是ic50剂量的9.4倍)，对小鼠小肠麦芽糖水解酶抑制还未超过80％，即即使服用较高浓度的阿卡波糖，也有一些麦芽糖仍会被水解为葡萄糖，入血后造成血糖升高。而黄芩素、野黄芩素以及六羟黄酮和1-dnj联用后，能显著提高对小鼠小肠麦芽糖水解酶的抑制作用，达到80％抑制率时，1-dnj的浓度均在为0.092～0.184μm，比1-dnj的ic50只提高了3-4倍，而且当使用0.184～0.368μm的1-dnj时(即1-dnj的浓度是其ic50的8倍时)，黄芩素和野黄芩素与1-dnj联用可以使抑制率提高到90％以上，表明会黄酮和1-dnj联用能使更少的麦芽糖转化为葡萄糖，更有效地降低餐后血糖。因此，以上结果表明黄酮和1-dnj联用比阿卡波糖具有更好的药效。
实施例6黄芩素与1-dnj联用协同降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高
使用18-23gc57bl/6小鼠(雄性)，饲养5d使其生理指标稳定。给药前禁食不禁水16h，评价5、10、20和40mg/ml的黄芩素单用降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖的作用，包括阴性对照共5组，每组8只。阴性对照组只灌胃麦芽糖，浓度为2g/kg，灌胃溶液体积为0.2ml/20g。给药组为麦芽糖与不同浓度药物的混合物，也用灌胃方式给药，麦芽糖浓度与阴性对照组相同。麦芽糖负荷及给药后断尾取血，血糖仪测定给药0、30、60、90、120min血糖值。结果如图8所示，虽然10、20和40mg/ml的黄芩素单用能够显著性降低餐后30min血糖值(p<0.05)，但其降血糖能力均较弱，且60min血糖值无显著性差异，也无延迟餐后血糖峰值作用。
同样的方法，评价0.4、0.6、0.8和1mg/ml1-dnj的单用降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖的作用，结果如图9所示，与阴性对照组相比，0.4、0.6、0.8和1mg/ml的1-dnj单用均显著降低餐后30min血糖值(p<0.01)，但0.4mg/ml1-dnj组合其他组相比药效较弱。
同样的方法，评价0.4mg/ml的1-dnj和10mg/ml的黄芩素的联用降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖的作用，并比较了与0.4mg/ml的1-dnj、10mg/ml的黄芩素单用药效的差异，本组实验以1.2mg/ml的阿卡波糖作为阳性对照，因此，本实验共分为阴性对照、阳性对照、联用组、1-dnj单用、黄芩素单用共5组，每组也是8只c57bl/6小鼠。结果如图10所示，0.4mg/ml的1-dnj和10mg/ml的黄芩素联用，餐后30min血糖值与相应黄芩素和1-dnj单用相比均有显著降低(p<0.05)，比较其曲线下面积(auc)也可看出，联用组曲线下面积和黄芩素和1-dnj单用组相比显著降低(p<0.05)(图11)，表明联用组能够维持餐后血糖的平稳，同时联用给药组，无论是麦芽糖负荷前和负荷后，血糖值均高于4，即未出现低血糖的现象。
同时比较联用组和以及图8中不同浓度的1-dnj单用时曲线下面积可知(图12)，达到与联用组相同的减低餐后血糖作用时(p>0.05)，1-dnj单用的剂量为0.8mg/ml，是联用组1-dnj剂量的2倍，而黄芩素，则是即使使用最高的测试浓度40mg/ml，也无法达到联用组的降低餐后血糖的效果(p<0.05)，以上结果表明5,6,7-三羟基取代的黄酮1-dnj联用，能够有效降低药物的使用量，进而降低药物产生副作用的风险。
小鼠禁食后进行葡萄糖负荷并给药，0.4mg/ml1-dnj，10mg/ml黄芩素均未表现出显著降低餐后血糖作用，如图13。这一结果进一步确认，黄芩素、1-dnj单用及联用的降低餐后血糖的机制为对麦芽糖酶水解碳水化合物的抑制作用。
对比例5黄芩素和1-dnj联用与阿卡波糖单用降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高的活性对比
在实施例6中，对比10mg/ml黄芩素和0.4mg/ml1-dnj的联用组与临床使用的药物-阿卡波糖降低麦芽糖负荷小鼠餐后血糖升高的药效，结果显示，联用组各个血糖浓度检测点血糖值均显著低于1.2mg/ml的阿卡波糖组(图10)，血糖维持更平稳，协同组的曲线下面积auc也显著低于阿卡波糖组(p<0.05,图12)，表明和阿卡波糖相比，5,6,7-三羟基取代黄酮和1-dnj联用具有更佳的降低餐后血糖的活性。
1.一种具有麦芽糖酶抑制活性的药物组合物，其特征在于：包括5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物和1-脱氧野尻霉素。
2.根据权利要求1所述的具有麦芽糖酶抑制活性的药物组合物，所述5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物选自以下单体、单体的有机盐或单体的无机盐中的至少一种：黄芩素、野黄芩素或六羟黄酮。
3.根据权利要求1所述的具有麦芽糖酶抑制活性的药物组合物，其特征在于：所述5,6,7-三羟基取代的黄酮类化合物和1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为5～50,000:1。
4.根据权利要求3所述的具有麦芽糖酶抑制活性的药物组合物，其特征在于：所述黄芩素、其有机盐或其无机盐与1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为10～50,000:1，所述野黄芩素、其有机盐或其无机盐与1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为5～30,000:1；所述六羟黄酮、其有机盐或其无机盐与1-脱氧野尻霉素的混合比例按摩尔比为10～20,000：1。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的具有麦芽糖酶抑制活性的药物组合物，其特征在于：还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
6.一种包含权利要求1～5任意一项所述的具有麦芽糖抑制活性药物组合物的制药剂型，其特征在于：包括片剂、胶囊剂、滴丸剂或颗粒剂。
7.权利要求1～5任意一项所述的具有麦芽糖抑制活性的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的具有麦芽糖抑制活性的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于：所述的糖尿病为i型糖尿病、ii型糖尿病或糖尿病前期。
9.根据权利要求7所述的具有麦芽糖抑制活性的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于：所述药物组合物通过抑制麦芽糖酶活性来治疗糖尿病。
技术总结