本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及千金藤碱及其盐作为铁死亡诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
细胞凋亡是研究最深入的细胞死亡类型，然而，近年来，除凋亡外，还发现了许多其他细胞死亡形式，包括自噬细胞死亡，铁死亡，焦亡，谷氨酸凋亡和与外来体相关的细胞死亡。传统的癌症治疗主要针对细胞凋亡，但是，许多癌细胞具有化学抗性并且在细胞凋亡诱导中存在缺陷，控制凋亡和非凋亡细胞死亡的大多数机制也是独立调节的，细胞还可能会经历各种压力，导致凋亡和非凋亡细胞死亡。大部分肿瘤在早期阶段都通过手术切除和放疗进行了治疗，晚期结合外科手术和化学疗法进行多模式治疗。但是一些化学疗法耐药的肿瘤细胞可以通过药物外流、代谢变化、dna损伤修复机制的改变或其他未知机制逃避细胞凋亡等死亡信号，此外癌细胞还表现出比正常细胞更高的ros含量，对促炎和促凋亡分子产生抵抗力以维护自身生存。铁死亡(ferroptosis)，一种发生机制上独立于凋亡和其他方式的新型细胞死亡方式，2003年由dolmas等高通量筛选2万多种化合物的致死效应时发现的由erastin诱导的靶向杀伤hras过表达肿瘤细胞的一种新型铁依赖性的细胞死亡方式，与凋亡，坏死和自噬等经典细胞死亡方式在形态学、生物化学等方面都有较大的差异。2012年，dixonsj把这种细胞死亡方式命名为铁死亡，细胞发生铁死亡时，细胞质内线粒体发生浓缩，内膜嵴变少甚至消失，外膜密度增加、破裂，细胞内活性的二价铁离子增加，最后致命性脂质过氧化物积累进而引起细胞的死亡。研究表明，铁死亡诱导剂erastin在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症中都有较好的抑癌效果，且最近越来越多的研究表明，铁死亡不仅与肿瘤相关，在神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、炎症等疾病中都发挥重要作用。
但是目前发现能诱导铁死亡的药物较少，如erastin和rsl-3——一种谷胱甘肽过氧化物酶4的抑制剂。虽然近来有越来越多的研究报道一些天然产物、分子能在不同细胞中诱导铁死亡，如：青蒿素，丹参，砷等，但这些物质通过铁死亡机制的临床应用尚未得到证实，更多的铁死亡诱导剂仍有待开发。越来越多的证据表明，天然来源的化合物可以诱导癌细胞中非凋亡的程序性细胞死亡，天然化合物为未来的抗癌治疗方法赢得了广阔前景。
千金藤碱(cepharanthine，cep)是从千金藤属植物头花千金藤提取出来的单体化合物，属于生物碱一类，在临床上治疗白细胞减少症，斑秃等。盐酸千金藤碱(cepharanthinehydrochloride，ch)，是经过千金藤属植物头花千金藤提取的千金藤碱盐化而得到的半合成化合物，其结构式为：
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供千金藤碱及其盐作为铁死亡诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用，经试验表明：千金藤碱及其盐通过在肿瘤细胞中诱导细胞发生铁死亡，发挥治疗肿瘤的作用，为肿瘤患者的治疗提供一种新的技术手段。
进一步地，所述药物通过注射给药。
进一步地，所述肿瘤为前列腺肿瘤。
进一步地，所述千金藤碱及其盐诱导前列腺肿瘤发生铁死亡的浓度为1-100μm。
本发明通过实验可知，盐酸千金藤碱在肿瘤细胞中诱导细胞发生铁死亡进而起到抗癌效果，本发明首次检测了盐酸千金藤碱单用对于不同前列腺癌细胞生长的影响。发明人发现加入盐酸千金藤碱之后，细胞发生了死亡但不是凋亡，通过电镜检测前列腺癌细胞形态的变化，发现千金藤碱处理后，线粒体结构发生了变化。
本发明选用1-100μm的盐酸千金藤碱，测定该范围内盐酸千金藤碱对前列腺癌du145、lncap、pc-3、pc-3m细胞株的药物毒性。加入盐酸千金藤碱处理细胞后，发现四株细胞株中活性氧水平提高、脂质过氧化物积累以及gpx4(谷胱甘肽过氧化物酶4)的表达水平下降，抗癌的效果显著。
前列腺癌lncap细胞对盐酸千金藤碱的敏感性最高，盐酸千金藤碱的浓度为20μm时，即能够诱导lncap细胞发生铁死亡。
本发明还提供了一种肿瘤细胞铁死亡诱导剂，所述铁死亡诱导剂包括盐酸千金藤碱。盐酸千金藤碱对神经退行性疾病、心血管疾病等具有治疗潜力。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
本发明提供了千金藤碱及其盐作为铁死亡诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用，千金藤碱及其盐在肿瘤细胞中可以诱导细胞发生铁死亡，诱导凋亡耐受的肿瘤细胞死亡，具有显著的抗癌抗耐药效果，为广大肿瘤患者提供了更多更有效的治疗方案。同时千金藤碱为临床用药，安全性好，盐酸千金藤碱的来源广，获取方式简单且经济，在抗肿瘤技术领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1不同浓度的盐酸千金藤碱抑制各株前列腺癌细胞存活的生存曲线图；
图2是实施例2中前列腺癌细胞在盐酸千金藤碱处理后凋亡图；
图3是实施例3中前列腺癌细胞在盐酸千金藤碱处理之后细胞中活性氧的变化图；
图4是实施例3中前列腺癌细胞在盐酸千金藤碱和铁死亡抑制剂fer-1处理之后细胞内脂质过氧化物水平的变化图；
图5是实施例3中lncap细胞在盐酸千金藤碱与铁螯合剂dfo联用或者与铁死亡抑制剂fer-1联用后对前列腺癌细胞活力的影响图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1、不同浓度的盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞存活的影响
s1.用电子天平称取盐酸千金藤碱粉末放置于离心管中，然后加入二甲基亚砜(dmso)进行溶解，配制成浓度为100mm的母液，后再用dmso稀释成不同的浓度，盐酸千金藤碱的浓度分别为1μm、20μm、40μm、80μm和100μm，分别加入至含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中，实验待用；
s2.选取前列腺癌细胞du145(购买于atcc细胞库)，lncap(购买于atcc细胞库)，pc-3(购买于atcc细胞库)，pc-3m(购买于国家实验细胞资源共享平台)四株细胞，将前列腺癌细胞用含有0.075wt.％i型胶原酶、0.5wt.％ii型胶原酶和0.1wt.％胰蛋白酶的消化液进行消化，37℃消化1min，消化完后，用吸管反复吹打消化后的悬液，铺板到相应的培养皿传代培养或用于药物实验，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况；
s3.将步骤s2制备得到的悬液接种于96孔板中，每孔接种细胞0.8×104，用步骤s1制得的5组含有不同浓度药物的培养基进行前列腺癌细胞培养，共20组实验组，再设置4组相同剂量的dmso组加入含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中进行培养前列腺癌细胞作为对照组，隔夜培养待贴壁后，分别在培养24h和48h时加入10μl5mg/ml四甲基偶氮唑盐(mtt)，37℃孵育4h后吸去dmem/f12培养基和mtt，加入dmso，在摇床上室温反应30min，之后用化学发光仪在570nm波长处测定吸光值，最后用graphpadprism8绘制药物浓度对应细胞存活率的拟合曲线。
本发明是采用mtt的方法检测盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞du145，lncap，pc-3，pc-3m四株细胞24h和48h的毒性，并且计算得到盐酸千金藤碱对不同前列腺癌细胞的ic50值。结果显示，lncap细胞对盐酸千金藤碱的敏感性最高，参照图1。
在本实施例中盐酸千金藤碱的浓度为1μm、40μm、80μm和100μm时，盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞存活的影响类似，拟合曲线类似。
实施例2、检测盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞死亡途径的作用
s1.采用实施例1制备得到的浓度为100mm的母液，后再用培养基稀释成不同的浓度，盐酸千金藤碱的终浓度分别为10μm、20μm，分别培养细胞，分为两组，再设置一组dmso作为空白对照组(以control表示)，加入的dmso剂量与盐酸千金藤碱剂量相同，实验待用；
s2.将实施例1步骤s2制备得到的前列腺癌细胞lncap悬液接种于6孔板中，每孔接种细胞30×104个/ml，用本实施例2步骤s1制得的3组培养基进行前列腺癌细胞培养，培养至24h及48h时，分别将前列腺癌细胞收集到离心管中，离心20min，离心速度为1000rpm/min，离心后去上清，用含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基重悬，离心法弃去培养基，用磷酸盐缓冲液反复冲洗2次，然后加入含5μl的annexinv染料的bindingbuffer重悬，后加入10μl的pi染料，室温孵育5min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，分别记录24h和48h时的前列腺癌细胞凋亡情况，参照图2。
由图2可知，当盐酸千金藤碱的浓度为20μm时，在lncap前列腺癌细胞中诱导显著的细胞死亡，但结果显示，凋亡细胞所占比例不高，提示盐酸千金藤碱诱导其它形式的细胞死亡。
实施例3、测定盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞lncap内活性氧的影响
s1.采用实施例2稀释得到浓度分别为10μm、20μm的盐酸千金藤碱，分别加入至含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中，分为两组，再设置一组dmso作为空白对照组(以control表示)，加入的dmso剂量与盐酸千金藤碱剂量相同，将实施例2制备得到的前列腺癌细胞lncap悬液接种于6孔板中，每孔接种细胞30×104个/ml，用本实施例制得的3组培养基进行前列腺癌细胞培养，实验待用；
s2.按照1:1000的比例用无血清培养基稀释活性氧检测探针dcfh-da，使终浓度为10μm。6孔板中培养的前列腺癌细胞lncap去培养基，每孔加入2ml稀释的dcfh-da溶液；
s3.将6孔板放到37℃细胞培养箱中孵育20min，然后用无血清培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da探针。用胰酶收集前列腺癌细胞lncap到离心管中，离心25min，离心速度为800rpm/min，离心后用pbs重悬清洗一遍，再次离心，离心15min，离心速度为500rpm/min，弃去上清，用200μlpbs重悬细胞之后进一步用流式分析仪在激发波长为488nm、发射波长为525nm的条件下检测细胞内dcfh-da的荧光强度，参考图3。
由图3可知，浓度为20μm的盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞lncap内活性氧的影响较大，前列腺癌细胞lncap内活性氧增加较多，浓度为10μm的盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞lncap内活性氧的影响微低。
实施例4、测定盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞lncap内脂质过氧化物水平的影响
s1.取实施例3稀释得到浓度为20μm的盐酸千金藤碱为一组，浓度为20μm的盐酸千金藤碱联用抑制剂fer-1的溶液为一组，在本实施例中，两组分别加入至含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中，再设置一组dmso作为空白对照组(以control表示)，加入的生理盐水剂量与盐酸千金藤碱剂量相同，将实施例3制备得到的前列腺癌细胞lncap悬液接种于6孔板中，每孔接种细胞30×104个/ml，用本实施例步骤制得的3组培养基进行前列腺癌细胞lncap培养，实验待用；
s2.使用bodipyc11作为探针检测脂质过氧化物水平，6孔板每孔加入5μmbodipyc11，在37℃细胞培养箱里孵育30min，胰酶消化收集前列腺癌细胞lncap到离心管中，离心3min，离心速度为1200rpm/min，离心后用pbs重悬清洗一遍，再次离心，离心5min，离心速度为700rpm/min，弃去上清，用200μlpbs重悬细胞之后进一步用流式细胞仪分析488nm激发波长下的细胞荧光强度，参照图4。
由图4可知，浓度为20μm的盐酸千金藤碱对前列腺癌细胞lncap脂质过氧化物水平影响程度大，高于盐酸千金藤碱联用抑制剂fer-1，脂质过氧化物积累，空白对照组前列腺癌细胞lncap脂质过氧化物水平对相较于其他两组之间。该结果提示盐酸千金藤碱诱导铁死亡。
实施例5、测定盐酸千金藤碱通过铁死亡抑制前列腺癌lncap细胞活力的作用
s1.取实施例3稀释得到浓度为20μm的盐酸千金藤碱为一组，浓度为20μm的盐酸千金藤碱联用抑制剂fer-1的溶液为一组，浓度为20μm的盐酸千金藤碱联用抑制剂铁螯合剂dfo的溶液为一组，三组分别加入至含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基中，将实施例3制备得到的前列腺癌细胞lncap悬液接种于6孔板中，每孔接种细胞30×104个/ml，用本实施例步骤制得的3组培养基进行前列腺癌细胞lncap培养，实验待用；
s2.隔夜培养待贴壁后，分别在培养24h和48h时加入10μl5mg/ml四甲基偶氮唑盐(mtt)，37℃孵育4h后吸去dmem/f12培养基和mtt，加入dmso，在摇床上室温反应30min；
s3.使用bodipyc11作为探针检测脂质过氧化物水平，6孔板每孔加入5μmbodipyc11，在37℃细胞培养箱里孵育30min，胰酶消化收集前列腺癌细胞lncap到离心管中，离心3min，离心速度为1200rpm/min，离心后用pbs重悬清洗一遍，再次离心，离心5min，离心速度为700rpm/min，弃去上清，用200μlpbs重悬细胞之后进一步用流式细胞仪分析488nm激发波长下的细胞荧光强度，参照图5。
由图5可知，铁死亡抑制剂fer-1或铁螯合剂dfo能够逆转盐酸千金藤碱对前列腺癌lncap细胞活力抑制，这一结果证明盐酸千金藤碱为铁死亡诱导剂。
实施例6、肿瘤形成试验
选自雄性athymicbalb/c裸鼠(4-6周龄)购买于中国实验动物科学研究所，置于无菌环境中，将悬浮于200μl基质凝胶/pbs(5mg/ml)中的前列腺癌细胞lncap皮下注射到小鼠身上，构建成裸鼠肿瘤模型，当小鼠体内肿瘤体积生长到100mm3随机分为4组，分为模型组、盐酸千金藤碱低剂量组15mg/kg、盐酸千金藤碱中剂量组30mg/kg、盐酸千金藤碱高剂量组40mg/kg，采用每天腹腔注射的方式，每隔一天测量小鼠的体重以及肿瘤的大小，在第13天处死小鼠收集肿瘤，表1为试验后各组小鼠肿瘤的重量，表2为试验后各组小鼠肿瘤生长率。
表1
表2
根据表1、表2的数据可知，盐酸千金藤碱组小鼠的肿瘤重量远低于模型组小鼠的肿瘤重量，说明盐酸千金藤碱可以抑制肿瘤生长，尤其是以盐酸千金藤碱低剂量组抑制肿瘤效果最佳。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
1.千金藤碱及其盐作为铁死亡诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物通过注射给药。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为前列腺肿瘤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述千金藤碱及其盐诱导前列腺肿瘤发生铁死亡的浓度为1-100μm。
5.一种肿瘤细胞铁死亡诱导剂，其特征在于：所述铁死亡诱导剂包括盐酸千金藤碱。
技术总结