本发明属于医药领域，具体涉及橘皮苷在防止肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
背景技术：
肝脏缺血再灌注损伤(hepaticischemia-reperfusioninjury，hiri)是创伤、肝脏手术和肝移植过程中常见的并发症之一，病理生理过程复杂，包含了器官缺血过程中的损伤及肝脏血流得到再灌注而产生的一系列损伤，是一种重要的临床病理过程。当各种原因导致的肝脏血流中断或不足使肝脏缺血，在恢复血供再灌注后，不仅不能使肝脏功能恢复，反而加重了肝细胞的功能障碍和结构破坏，缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury，iri)是影响肝脏切除手术及肝移植预后的重要因素之一。由于缺血再灌注的疾病过程极为复杂，影响了基础研究向临床应用的转化。因此，如何有效减轻临床手术中iri，进而降低手术对肝脏功能的影响，是目前研究热点之一。
探讨hiri发病机制是寻找有效防治措施的前提。只有深入研究hiri的病理生理机制及相关信号通路，发现可通过药物处理的重要靶点，直接或间接的增强肝组织或肝细胞对iri的耐受能力，才能减轻损伤从而提高手术的安全性。iri是一个复杂的级联事件，目前已有的机制研究包括氧化应激、线粒体膜通透转换孔道、钙超载、hiri相关炎症因子、核转录因子、肝细胞凋亡、补体激活等，迄今对其发生机制尚未完全阐明。其机制主要发生在肝脏缺血性损伤和免疫炎症介导的再灌注损伤两个相互促进相互关联的过程，前者主要是肝脏实质细胞的损伤，后者主要是肝脏间质细胞(kupfer细胞(kcs)、白细胞、树突状细胞等)的损伤以及局部微循环的紊乱。在缺血期，血窦内皮细胞水肿，产生多种有害物质如氧自由基等，同时激活kcs等炎症细胞。激活的kcs等进一步促进氧化反应，释放大量的促炎细胞因子。这些促炎细胞因子在再灌注后可引起血管周围中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润。因此，iri病理生理过程主要是由肝脏固有免疫细胞识别受体介导的炎症反应过程。先天免疫系统，如补体、细胞因子、趋化因子、中性粒细胞和巨噬细胞均参与了hiri。hiri的损伤机制有诸多因素参与，既相互制约又相互促进。
氧化应激和炎症反应的过度激活会直接或间接地导致机体自身损伤，许多实验研究证明，大量的氧化应激和炎症反应的异常激活是hiri的重要病理特征，因此，采取有效的干预措施清除氧化物质、减轻炎症反应激活程度，可减轻肝细胞的损伤，是防治hiri的一个重要策略。目前临床上尚无高效、低毒、特异的防治hiri的药物。
橘皮苷(hesperidin)是一种维生素p黄酮类化合物，主要存在于柑橘属果实中，其相对分子量为610.56kd，分子式为c28h34o15，呈淡黄色结晶性粉末。具有降低血压、抗过敏、降低低密度胆固醇、影响血压、改变体内酶活性、改善微循环、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗癌等生理功能；其次，还具有降低毛细血管的脆性，保护毛细血管，防止微血管破裂出血的作用。
目前为止，橘皮苷减轻肝脏缺血再灌注损伤的研究未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种橘皮苷新的医药用途，具体是提供橘皮苷在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用，其机制为：橘皮苷通过调控激活pi3k/akt通路，抑制氧化应激、减轻炎症反应，从而保护肝脏损伤。其中防止可以为预防和治疗中的任意一种。药物可以是治疗类的药剂或者保健类的保健品。
本发明的另一目的是提供一种防治肝脏再灌注损伤的药物或保健品，所述的药物或保健品是以橘皮苷作为唯一活性成分，或以包含橘皮苷的药物组合物作为活性成分。所述的药物添加药学上可接受的辅料制成临床应用的药物制剂。
优选的，所述的药物制剂包括口服制剂或注射制剂。所述的口服剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或混悬剂等。所述的注射制剂包括输液、注射剂等。
本发明首次公开了橘皮苷对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，其可用于制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品。经试验证明，一定浓度的橘皮苷可以调控炎症因子的异常激活，减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤，对缺血再灌注引起的肝脏损伤有保护作用，通过调控激活pi3k/akt通路，抑制氧化应激、减轻炎症反应，从而保护肝脏损伤。
附图说明
图1为空白对照组(sham)、橘皮苷对照组(control)、单纯肝脏缺血再灌注损伤组(i/r)、橘皮苷肝脏缺血再灌注损伤组(i/r-hdn)(喂食量分别为100mg/kg每次每天、200mg/kg每次每天、400mg/kg每次每天，连续三天)处理后的小鼠血清中alt水平。
图2为橘皮苷对小鼠在部分(70％)肝组织(肝左叶、中叶)缺血再灌注损伤下小鼠肝脏组织形态的影响(10×)；其中，a为给小鼠喂食pbs3天后，未进行小鼠部分肝组织缺血再灌注操作的肝脏组织形态；b为给小鼠喂食橘皮苷(hesperidin)3天后，未进行小鼠部分肝组织缺血再灌注损伤操作后肝脏的组织形态；c为给小鼠喂食pbs3天后，行小鼠部分肝组织缺血再灌注操作后肝脏的组织形态；d为给小鼠喂食橘皮苷(hesperidin)3天后，对小鼠行部分肝组织缺血再灌注损伤操作后肝脏的组织形态。
图3为橘皮苷降低部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠血清中alt水平；其中，sham：假手术组，ir：肝脏缺血再灌注损伤组(橘皮苷(hesperidin)喂食量为200mg/kg每次每天，连续3天)。
图4为橘皮苷降低部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝脏坏死面积水平；其中，ir-pbs：单纯肝脏缺血再灌注损伤组；ir-hesperidin：橘皮苷(hesperidin)肝脏缺血再灌注损伤组(橘皮苷(hesperidin)喂食量为200mg/kg每次每天，连续3天)。
图5a为橘皮苷减轻肝脏缺血再灌注损伤小鼠病变肝组织中炎症因子il-1β的水平；图5b为橘皮苷减轻肝脏缺血再灌注损伤小鼠病变肝组织中炎症因子il-6的水平；其中，sham为空白对照组；control为橘皮苷对照组；ir为单纯肝脏缺血再灌注损伤组、ir-hdn200为橘皮苷肝脏缺血再灌注损伤组(橘皮苷(hesperidin)喂食量为200mg/kg每次每天，连续3天)。
图6a为橘皮苷提高肝脏缺血再灌注损伤小鼠病变肝组织中超氧化物歧化酶的水平；图6b为橘皮苷提高肝脏缺血再灌注损伤小鼠病变肝组织中谷胱甘肽的水平；其中，sham为空白对照组；control为橘皮苷对照组；ir为单纯肝脏缺血再灌注损伤组、ir-hdn200为橘皮苷肝脏缺血再灌注损伤组(橘皮苷(hesperidin)喂食量为200mg/kg每次每天，连续3天)。
图7为部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝脏组织形态的变化(10×)；其中，a为单纯肝脏缺血再灌注损伤组；b为ly294002肝脏缺血再灌注损伤组(ly294002为akt抑制剂)。
图8为ly294002(akt抑制剂)升高肝脏缺血再灌注损伤小鼠血清中alt水平。其中，ir-pbs：单纯肝脏缺血再灌注损伤组；ir-ly294002：ly294002肝脏缺血再灌注损伤组。
图9为ly294002(akt抑制剂)升高肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝脏坏死面积水平。其中，ir-pbs：单纯肝脏缺血再灌注损伤组；ir-ly294002：ly294002肝脏缺血再灌注损伤组。
图10为对小鼠腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002后，观察橘皮苷对部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝脏组织形态的影响(10×)。其中，a为ly294002肝脏缺血再灌注损伤组；b为ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组。
图11为对小鼠腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002后，橘皮苷不能降低部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠血清中alt水平。其中，ir-ly294002：ly294002肝脏缺血再灌注损伤组；ir-ly294002 hesperidin：ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组。
图12为对小鼠腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002后，橘皮苷不能降低部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝脏坏死面积水平。其中，ir-ly294002：ly294002肝脏缺血再灌注损伤组；ir-ly294002 hesperidin：ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组。
其中，图中出现的ns为经统计学分析无显著性差异，p＞0.05；***为经统计学分析有显著性差异，p＜0.001；**为经统计学分析有显著性差异，p＜0.01。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
实验动物
雄性野生型c57bl/6jwt小鼠，8-10周大，25克左右。随机分组，每组8-10只，正常喂养。
第一组试验
动物模型的建立和分组
小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型：腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)-二甲苯(5mg/kg)麻醉药后，用无损伤血管夹夹住供应左肝叶、中肝叶的肝动脉、门静脉和胆管，阻断约70％的肝脏血流(左、中肝叶)，阻断后可见左、中肝叶颜色逐渐变暗，呈灰暗色缺血改变，胃肠处于淤血状态呈暗红色。左、中肝叶缺血60分钟后，放开血管夹进行再灌注阶段。此时可见肝脏、胃肠道逐渐充盈，肝脏从灰白色变红色但仍明显较暗(肝脏表面颜色不均，有褐色斑块)，胃肠暗红色变鲜红色，说明再灌注成功，给予观察6小时。然后留取肝脏组织和血液标本。分组情况：
第一组试验
a、空白对照组：小鼠灌胃法喂食pbs3天，然后直接留取肝脏组织和血液标本；
b、橘皮苷对照组：小鼠经灌胃法喂食橘皮苷(hesperidin)3天(200mg/kg，每天一次)，然后直接留取肝脏组织和血液标本；
c、单纯肝脏缺血再灌注损伤组：小鼠灌胃法喂食pbs3天，然后行肝脏缺血再灌注损伤操作，然后留取肝脏组织和血液标本；
d、橘皮苷肝脏缺血再灌注损伤组：小鼠经灌胃法喂食橘皮苷3天(100mg/kg,或200mg/kg,或400mg/kg，每天一次)，然后行肝脏缺血再灌注损伤操作，然后留取肝脏组织和血液标本。
检查上述各组的肝脏损伤情况：
参照图1所示，与对照组相比，对小鼠进行肝脏缺血再灌注损伤操作后，小鼠血清中的alt显著增加，说明肝功能损伤严重；且不管给小鼠喂食一定浓度的pbs或者橘皮苷，小鼠血清中的alt水平都无法完全恢复，但喂食pbs与喂食橘皮苷相比，小鼠血清中的alt前者大于后者，当给小鼠喂食橘皮苷量100mg/kg时，后者的血清中alt明显小于前者的1.5倍多(3335u/lvs2152u/l)，当给小鼠喂食橘皮苷量为200mg/kg时，后者的血清中alt明显小于前者的2.1倍多(3335u/lvs1606u/l)，当给小鼠喂食橘皮苷量为400mg/kg时，后者的血清中alt明显小于前者的3.2倍多(3335u/lvs1038u/l)，由此可知，给小鼠喂食一定浓度的橘皮苷，明显抑制了小鼠血清中的alt含量的增加，说明橘皮苷具有保护肝脏缺血再灌注损伤的作用。
第二组试验
a、空白对照组：小鼠灌胃法喂食pbs3天，然后直接留取肝脏组织和血液
标本；
b、橘皮苷对照组：小鼠经灌胃法喂食橘皮苷(hesperidin)3天(200mg/kg，每天一次)，然后直接留取肝脏组织和血液标本；
c、单纯肝脏缺血再灌注损伤组：小鼠灌胃法喂食pbs3天，然后行肝脏缺血再灌注损伤操作，然后留取肝脏组织和血液标本；
d、橘皮苷肝脏缺血再灌注损伤组：小鼠经灌胃法喂食橘皮苷3天(200mg/kg，每天一次)，然后行肝脏缺血再灌注损伤操作，然后留取肝脏组织和血液标本。
橘皮苷对部分肝脏缺血再灌注损伤小鼠肝脏组织形态的影响见图2。图2a为空白对照组，图2b为橘皮苷对照组，两组肝脏组织形态显示无肝细胞损伤；图2c为单纯肝脏缺血再灌注损伤组，肝细胞以中央静脉为中心呈放射性排列，肝细胞自中央静脉周围开始坏死，肝细胞呈空泡样变性，炎症细胞浸润，大量肝细胞脂肪变性，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝索；图2d为橘皮苷肝脏缺血再灌注损伤组，肝细胞散在小片状坏死，肝细胞溶质空泡化，细胞边界模糊，血窦膨胀，少量炎症细胞浸润，少量肝细胞脂肪变性。
检查上述各组的肝脏损伤情况：
各组小鼠部分肝脏缺血60分钟，然后再灌注6小时后，血清alt水平见图3。且从图3中可以看出，在sham组中的小鼠无论是否经橘皮苷(200mg/kg，每天一次，连续3天)处理，小鼠血清中的alt水平都没有发生明显变化(183u/lvs193u/l)，说明适当浓度橘皮苷是不会引起肝功能损伤的；与假手术(sham-pbs)组比较，小鼠部分肝脏缺血60分钟、再灌注(ir-pbs组)6小时后，血清alt有显著升高(183u/lvs3335u/l)，说明部分肝脏缺血(60分钟)再灌注(6小时)会严重破坏小鼠的肝功能。由图3中的ir组的alt水平可知，不管给小鼠喂食一定浓度的pbs或者橘皮苷，小鼠血清中的alt水平都无法完全恢复，但喂食pbs与喂食橘皮苷相比，小鼠血清中的alt前者大于后者，且后者明显小于前者的2.1倍多(3335u/lvs1606u/l)，由此可知，给小鼠喂食一定浓度的橘皮苷，明显抑制了小鼠血清中的alt含量的增加，说明橘皮苷具有保护肝脏缺血再灌注损伤的作用。
各组小鼠部分肝脏缺血(60分钟)再灌注(6小时)后，小鼠肝脏坏死面积水平见图4。在ir组中，小鼠灌胃法喂食pbs3天与小鼠经灌胃法喂食橘皮苷3天(200mg/kg，每天一次)相比较，小鼠肝脏坏死面积前者大于后者(35％vs27％)，且后者明显小于前者，由此可知，给小鼠喂食一定浓度的橘皮苷明显缩小了小鼠肝脏坏死面积，说明橘皮苷具有保护肝脏缺血再灌注损伤的作用。
橘皮苷减轻缺血再灌注损伤小鼠病变肝组织中炎症因子的水平见图5a和5b。il-1β、il-6的表达在sham和control中无差异；ir中较sham组明显升高；橘皮苷治疗组较单纯ir组明显下降，说明橘皮苷具有减轻缺血再灌注肝组织中炎症反应的作用。
橘皮苷增加肝脏缺血再灌注损伤小鼠血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平分别见图6a和6b。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)、谷胱甘肽(glutathione，gsh)的表达在sham和control中无差异；ir中较sham组明显降低；橘皮苷治疗组较单纯ir组明显升高；说明橘皮苷具有抑制缺血再灌注肝组织中氧化应激的作用。
第三组试验
a、单纯肝脏缺血再灌注损伤组：小鼠灌胃法喂食pbs3天，然后行肝脏缺血(60分钟)再灌注损伤(6小时)操作，然后留取肝脏组织和血液标本。
b、ly294002肝脏缺血再灌注损伤组：术前30分钟腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002(ly294002剂量为0.5mg/kg)，然后小鼠进行部分肝脏缺血60分钟，然后行再灌注操作，观察6小时，然后留取肝脏组织和血液标本。
pi3k/akt抑制剂ly294002对部分肝缺血再灌注损伤小鼠肝脏组织形态的影响见图7。图7中a为单纯肝脏缺血再灌注损伤组，肝细胞以中央静脉为中心呈放射性排列，肝细胞自中央静脉周围开始坏死，肝细胞呈空泡样变性，炎症细胞浸润，大量肝细胞脂肪变性，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝索；b为ly294002肝脏缺血再灌注损伤组，肝细胞严重坏死，部分区域失去肝脏结构，肝索崩解，出血，大量严重细胞浸润。
检查上述各组的肝脏损伤情况：
各组小鼠部分肝脏缺血(60分钟)再灌注(6小时)后，血清alt水平见图8。在ir组中，单纯肝脏缺血再灌注损伤组与ly294002肝脏缺血再灌注损伤组相比，给小鼠在术前使用腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002(ly294002剂量为0.5mg/kg)后，小鼠血清中alt明显升高(2543u/lvs5053u/l)，说明ly294002具有加重肝脏缺血再灌注损伤的作用。各组小鼠部分肝脏缺血(60分钟)再灌注(6小时)后，小鼠肝脏坏死面积水平见图9。在ir组中，单纯肝脏缺血再灌注损伤组与ly294002肝脏缺血再灌注损伤组相比，给小鼠在术前30分钟腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002(ly294002剂量为0.5mg/kg)后，小鼠肝脏坏死面积明显升高(35.0％vs50.5％)，说明ly294002具有加重肝脏缺血再灌注损伤的作用。
第四组试验
a、ly294002肝脏缺血再灌注损伤组：术前30分钟腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002(ly294002剂量为0.5mg/kg)，然后小鼠进行部分肝脏缺血60分钟，然后行再灌注操作，观察6小时，然后留取肝脏组织和血液标本。
b、ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组：小鼠经灌胃法喂食橘皮苷3天(200mg/kg，每天一次)，术前30分钟腹腔注射pi3k/akt抑制剂ly294002(ly294002剂量为0.5mg/kg)，然后小鼠进行部分肝脏缺血60分钟，然后行再灌注操作，观察6小时，然后留取肝脏组织和血液标本。
橘皮苷在注射抑制剂ly294002情况下对部分肝缺血再灌注损伤小鼠肝脏组织形态的影响见图10，图10中a为ly294002肝脏缺血再灌注损伤组，b为ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组，两组均可见肝细胞严重坏死，部分区域失去肝脏结构，肝索崩解，出血，大量严重细胞浸润。
检测各组的肝脏损伤情况：
各组小鼠部分肝脏缺血(60分钟)再灌注(6小时)后，血清alt水平见图11。在ir组中，ly294002肝脏缺血再灌注损伤组与ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组相比，小鼠血清中alt无明显变化；说明在pi3k/akt抑制剂ly294002作用下，橘皮苷不能保护肝脏缺血再灌注损伤。各组小鼠部分肝脏缺血(60分钟)再灌注(6小时)后，小鼠肝脏坏死面积水平见图12。在ir组中，ly294002肝脏缺血再灌注损伤组与ly294002 hesperidin肝脏缺血再灌注损伤组相比，小鼠肝脏坏死面积无明显变化(50.5％vs49.3％)，说明在pi3k/akt抑制剂ly294002作用下，橘皮苷不能保护肝脏缺血再灌注损伤。
通过对第一组试验、第二组试验、第三组试验的对比和第四组试验分析可以得出，橘皮苷(hesperidin)具有通过调节pi3k/akt通路保护肝脏缺血再灌注损伤的作用。
1.橘皮苷在防止肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过调节pi3k/akt通路保护肝脏缺血再灌注损伤的作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的橘皮苷与药学上可接受的辅料制成药物制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂为口服制剂或注射制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的口服剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或混悬剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射制剂为输液或注射剂。
7.一种防治肝脏缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，所述的药物是以橘皮苷作为唯一活性成分，或以包含橘皮苷的药物组合物作为活性成分。
8.根据权利要求7所述的一种防治肝脏缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，所述的药物添加药学上可接受的辅料制成临床应用的药物制剂。
9.根据权利要求8所述的一种防治肝脏缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，所述的药物制剂包括口服制剂或注射制剂。
技术总结