本发明属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本发明涉及治疗肿瘤耐药性领域。本发明提供了一种治疗肿瘤耐药性的试剂。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的一类疾病，化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一。然而在治疗过程中出现的肿瘤对化疗药物的耐药性是影响肿瘤治疗效果的主要障碍。因此，为了提高肿瘤化疗疗效，对肿瘤耐药机制进行研究找到肿瘤耐药关键靶点，并根据这些靶点进行设计提高肿瘤化疗敏感性的新药是本领域重点研究方向。
plin2又称脂肪分化相关蛋白，是脂滴包被蛋白pat家族蛋白成员之一。人的plin2基因位于9p22.1-p22.3，基因总长5003bp。plin2蛋白的pat结构域高度保守，位于n端区域的第1～115位氨基酸。pat结构域与脂质蓄积以及脂滴、蛋白的稳定有关。在细胞脂质蓄积的过程中plin2的表达增加，一方面是因为脂质蓄积诱导其表达，另一方面是由于其定位于脂滴时蛋白质会更加稳定。plin2表达增加也会保护脂滴水解。plin2可以通过调节脂质储存以维持内质网稳态，进而促进肾癌细胞增殖，特别是在营养和氧气限制的条件下，促进肿瘤细胞的存活(cancerdiscov.2015；5(6):652-67.)。进一步的研究表明，plin2高表达是肾癌潜在的诊断标志物(proteomicsclinappl.2017；11(11-12).)，plin2敲除可以促进肾癌细胞增殖、侵袭和迁移(intjoncol.2018；53(1):137-147.)。然而plin2是否可以调控肿瘤耐药性方面的研究未见报道，本发明首次发现plin2抑制剂可以显著降低肿瘤细胞的耐药性，可以作为降低肿瘤耐药性的用途，为肿瘤耐药治疗提供了新方法和试剂。
技术实现要素：
基于上述肿瘤在化学药物治疗过程中出现的肿瘤耐药问题，本发明的一个目的是提供一种针对plin2的抑制剂作为降低或消除肿瘤耐药治疗中的应用。
本发明通过一系列的功能实验(如cck-8实验、克隆形成试验)验证plin2抑制剂对肿瘤耐药的调控作用。本发明中的实验操作通常是按照常规实验条件进行，也可按照实施例中实验条件操作，试剂使用可按照制造厂商所附说明使用。
作为本发明所述plin2抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述plin2抑制剂包括：抗plin2的抗体、针对plin2编码序列的rna干扰分子或反义寡核苷酸。
作为本发明所述plin2抑制剂在降低或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述抗plin2的抗体包括：对抗plin2或其活性片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体或具有免疫活性的抗体片段。
作为本发明所述plin2抑制剂在降低或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：针对plin2编码序列的rna干扰分子或反义寡核苷酸，优选选自下组rna干扰分子：shrna、sirna、mirna或dsrna。例如本发明实施例中所提供的针对plin2的碱基序列：gccaaguuauuauguuaga；ggcagcauuaacacagucu；gagacugccuauucugaau。
本发明的有益效果是：
本发明提供了通过抑制plin2来提高肿瘤对肿瘤治疗的敏感性的新方法，从而起到了提高肿瘤治疗效果、减少肿瘤治疗剂用量、缓解患者痛苦的积极作用，具有临床的实用性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，具体阐述本发明。下列实施例中，未注明的具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，如sambrook等人著，分子克隆：实验室指南(newyork：coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.抑制plin2的表达提高了卵巢癌耐药细胞对顺铂化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制卵巢癌细胞系skov3的化疗药物顺铂耐药细胞系skov3/ddp中的plin2的表达。利用平板克隆试验观察卵巢癌耐药细胞skov3/ddp对化疗药物顺铂的敏感性。
1.所使用sirna序列
gccaaguuauuauguuaga购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.平板克隆试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液稀释后进行细胞计数。根据计数结果，以每2mlrpmi-1640培养基(美国gibco公司)包含1000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向6孔板中每个孔加入2mlrpmi-1640培养基。将6孔板放置在细胞培养箱里培养24h后，弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔2ml处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂，配好之后每孔2ml。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的rpmi-1640培养基。细胞转染24h之后，用含0、12.5、25、50、100nm/ml的顺铂培养基在细胞培养箱中培养72h之后更换为普通的rpmi-1640培养基继续培养，共计培养两周后终止培养。然后弃去培养液，以每孔2ml的pbs轻轻洗涤细胞，向6孔板中加入4％多聚甲醛固定细胞15min，弃去多聚甲醛，再加入1ml结晶紫染液染色15min，用2mlpbs轻轻洗去染色液，放置室温晾干。显微镜下计数大于50个细胞的克隆形成数，最终计算各实验组克隆形成率，该数据可反应细胞对化疗药物的敏感性。
试验结果
结果表明，在抑制plin2的表达之后，用不同浓度的顺铂处理后均可显著降低skov3/ddp耐药细胞的克隆形成率，提高了卵巢癌细胞对顺铂化疗药物的敏感性。
实施例2.抑制plin2的表达提高了宫颈癌耐药细胞对顺铂化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制宫颈癌细胞系siha化疗药物顺铂耐药细胞系siha/ddp中的plin2的表达。利用cck-8试验观察宫颈癌耐药细胞siha/ddp对化疗药物顺铂的敏感性。
1.所使用sirna序列
ggcagcauuaacacagucu购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒和转染使用培养基
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.cck8试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液进行稀释后用血球计数板细胞计数。根据计数结果，以每100μlrpmi-1640培养基(美国gibco公司)包含5000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向96孔板中每个孔加入100μl培养基。将96孔板放置在细胞培养箱里培养24h后弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔100μl处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂.配好之后每孔加入150μl。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的rpmi-1640培养基。sirna转染24h之后，用含有50nm/ml的顺铂培养基药物处理24,48,72h。更换培养基，向每孔加入100μl的培养基和10μlcck8试剂(购自上海东仁化学科技有限公司)，放置于细胞培养箱中孵育3h。最后使用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度。得到细胞的生存率，该数据可反应细胞对化疗药物的敏感性。
试验结果：
结果表明，抑制plin2的表达之后，用不同浓度的顺铂处理可显著降低宫颈癌siha/ddp耐药细胞的生存率，提高了宫颈癌细胞对顺铂化疗药物的敏感性。
实施例3.抑制plin2的表达提高了肺癌耐药细胞对吉非替尼化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制肺癌细胞系pc-9化疗药物吉非替尼耐药细胞系pc-9/gr中的plin2的表达。利用cck-8试验观察肺癌pc-9/gr细胞对化疗药物吉非替尼的敏感性。
1.所使用sirna序列
gagacugccuauucugaau购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.cck8试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液进行稀释后用血球计数板细胞计数。根据计数结果，以每100μlrpmi-1640培养基(美国gibco公司)包含5000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向96孔板中每个孔加入100μl培养基。将96孔板放置在细胞培养箱里培养24h后弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔100μl处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂.配好之后每孔加入150μl。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的rpmi-1640培养基。sirna转染24h之后，用含有50μmol/l的吉非替尼培养基药物处理24,48,72h。更换培养基，向每孔加入100μl的培养基和10μlcck8试剂(购自上海东仁化学科技有限公司)，放置于细胞培养箱中孵育3h。最后使用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度，得到细胞的生存率，该数据可反应细胞对化疗药物的敏感性。
试验结果：
结果表明，抑制plin2的表达,用不同浓度的吉非替尼可显著降低肺癌耐药细胞系pc-9/gr的生存率，提高了肺癌细胞对吉非替尼化疗药物的敏感性。
实施例4.抑制plin2的表达提高了肝癌耐药细胞对阿霉素化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制肝癌细胞系hepg2化疗药物阿霉素耐药细胞系hepg2/adr中的plin2的表达。利用平板克隆试验观察肝癌耐药细胞hepg2/adr对化疗药物阿霉素的敏感性。
1.所使用sirna序列
gccaaguuauuauguuaga购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.平板克隆试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液稀释后进行细胞计数。根据计数结果，以每2mlrpmi-1640培养基(美国gibco公司)包含1000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向6孔板中每个孔加入2ml培养基。将6孔板放置在细胞培养箱里培养24h后弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔2ml处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂，配好之后每孔2ml。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的rpmi-1640培养基。细胞转染24h之后，用含不同剂量0、12.5、25、50、100mg/l的阿霉素培养基在细胞培养箱中培养72h之后更换为普通的培养基继续培养，共计培养两周后终止培养。然后弃去培养液，以每孔2ml的pbs轻轻洗涤细胞，向6孔板中加入4％多聚甲醛固定细胞15min，弃去多聚甲醛，再加入1ml结晶紫染液染色15min，用2mlpbs轻轻洗去染色液，放置室温晾干。显微镜下计数大于50个细胞的克隆形成数，最终计算各实验组克隆形成率，该数据可反应细胞对化疗药物的敏感性。
结果表明，抑制plin2的表达后，用不同浓度的阿霉素可显著降低肝癌hepg2/adr耐药细胞的克隆形成率，提高了肝癌细胞对阿霉素化疗药物的敏感性。
实施例5.抑制plin2的表达提高了宫颈癌耐药细胞对阿霉素化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制宫颈癌细胞系hela化疗药物阿霉素耐药细胞系hela/adr中的plin2的表达。利用平板克隆试验观察宫颈癌耐药细胞hela/adr对化疗药物阿霉素的敏感性。
1.所使用sirna序列
gagacugccuauucugaau购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.平板克隆试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液稀释后进行细胞计数。根据计数结果，以每2mldmem培养基(美国gibco公司)包含1000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向6孔板中每个孔加入2ml培养基。将6孔板放置在细胞培养箱里培养24h后弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔2ml处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂，配好之后每孔加入2ml。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的dmem培养基。细胞转染24h之后，用含不同剂量0、12.5、25、50、100mg/l的阿霉素药物培养基在细胞培养箱中培养72h之后更换为普通的培养基继续培养，共计培养两周后终止培养。然后弃去培养液，以每孔2ml的pbs轻轻洗涤细胞，向6孔板中加入4％多聚甲醛固定细胞15min，弃去多聚甲醛，再加入1ml结晶紫染液染色15min，用2mlpbs轻轻洗去染色液，放置室温晾干。显微镜下计数大于50个细胞的克隆形成数，最终计算各实验组克隆形成率，该数据可反应细胞对化疗药物的敏感性。
结果表明，抑制plin2的表达后，用不同浓度的阿霉素可显著降低宫颈癌hela/adr耐药细胞的克隆形成率，提高了宫颈癌细胞对阿霉素化疗药物的敏感性。
实施例6.抑制plin2的表达提高了肝癌耐药细胞对5氟尿嘧啶(5-fu)化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制肝癌细胞系bel7402化疗药物5-fu耐药细胞系bel/5-fu中的plin2的表达。利用cck-8试验观察肝癌耐药细胞bel/5-fu对化疗药物5氟尿嘧啶的敏感性。
1.所使用sirna序列
gagacugccuauucugaau购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.cck8试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液稀释后进行细胞计数。根据计数结果，以每2mlrpmi-1640培养基(美国gibco公司)包含1000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向6孔板中每个孔加入2ml培养基。将6孔板放置在细胞培养箱里培养24h后弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔2ml处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂，配好之后每孔加入2ml。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的rpmi-1640培养基。细胞转染24h之后，用含不同剂量0、5、10、20、50mg/l的5氟尿嘧啶培养基在细胞培养箱中培养72h之后更换为普通的培养基继续培养，共计培养两周后终止培养。然后弃去培养液，以每孔2ml的pbs轻轻洗涤细胞，向6孔板中加入4％多聚甲醛固定细胞15min，弃去多聚甲醛，再加入1ml结晶紫染液染色15min，用2mlpbs轻轻洗去染色液，放置室温晾干。显微镜下计数大于50个细胞的克隆形成数，最终计算各实验组克隆形成率，该数据可反应细胞对化疗药物的敏感性。
结果表明，抑制plin2的表达后，用不同浓度的5氟尿嘧啶可显著降低肝癌耐药细胞系bel/5-fu的生存率，提高了肝癌细胞对5氟尿嘧啶化疗药物的敏感性。
实施例7.抑制plin2的表达提高了肺癌耐药细胞对紫杉醇化疗药物的敏感性
为研究抑制plin2是否可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性，发明人通过转染sirna的方法抑制肺癌细胞系a549化疗药物紫杉醇耐药细胞系a549/taxol中的plin2的表达。利用平板克隆试验观察a549/taxol细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。
1.所使用sirna序列
gagacugccuauucugaau购自上海吉玛公司。
2.sirna转染试剂盒
转染试剂盒lipofectaminernaimax购自invitrogen公司，按照invitrogen提供的转染说明书进行操作。转染使用培养基opti-mem购买于gibco公司。
3.平板克隆试验
取生长状态良好的对数生长期细胞，制成均匀的单细胞混悬液。将细胞混悬液稀释后进行细胞计数。根据计数结果，以每2mldmem培养基(美国gibco公司)包含1000个细胞的比例制备细胞混悬液，然后向6孔板中每个孔加入2ml培养基。将6孔板放置在细胞培养箱里培养24h后弃掉培养基，换成opti-mem培养基每孔2ml处理半个小时，配制转染试剂按照1ml的opti-mem培养基加入2μl的sirna加入6μl的lipofectaminernaimax制备转染试剂，配好之后每孔加入2ml。细胞转染6h之后弃掉转染试剂，置换成普通的dmem培养基。细胞转染24h之后，用含不同剂量0、12.5、25、50、100mg/l的紫杉醇培养基在细胞培养箱中培养72h之后更换为普通的培养基继续培养，共计培养两周后终止培养。然后弃去培养液，以每孔2ml的pbs轻轻洗涤细胞，向6孔板中加入4％多聚甲醛固定细胞15min，弃去多聚甲醛，再加入1ml结晶紫染液染色15min，用2mlpbs轻轻洗去染色液，放置室温晾干。显微镜下计数大于50个细胞的克隆形成数，最终计算各实验组克隆形成率。
结果表明，抑制plin2的表达后，用不同浓度的紫杉醇可显著降低肺癌a549/taxol耐药细胞的克隆形成率，提高了肺癌细胞对紫杉醇化疗药物的敏感性。
综上所述，通过抑制不同组织来源的耐药肿瘤中的plin2的表达，可以增强肿瘤的化疗治疗效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.plin2抑制剂的应用，其特征在于：plin2抑制剂在制备提高肿瘤药物治疗敏感性药品或在制备降低或消除肿瘤药物治疗耐药性药品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：plin2蛋白抑制剂为抗plin2的抗体、针对plin2编码序列的rna干扰分子或反义寡核苷酸中的一种或二种以上。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤药物为顺铂、吉非替尼、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶(5-fu)中的一种或二种以上。
4.如权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括肝癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌中的一种或二种以上。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所选的抗plin2抗体包括，对plin2或其活性片段具有免疫活性单克隆抗体、多克隆抗体和具有免疫活性的抗体片段中的一种或二种以上。
6.如权利要求2所述的应用途，其特征在于，所选plin2编码序列的rna干扰分子选自shrna、sirna、mirna、dsrna中的一种或二种以上。
7.如权利要求2或6所述的应用，说述的rna干扰分子sirna的优选序列为gccaaguuauuauguuaga、ggcagcauuaacacagucu、gagacugccuauucugaau中的一种或二种以上。
8.一种治疗肿瘤药物混合物，包含plin2蛋白抑制剂，以及肿瘤药物或肿瘤药物活性成份中的一种或二种以上。
9.如权利要求8所述的治疗肿瘤药物混合物，
所述plin2蛋白抑制剂为权利要求2、5、6或7中所述plin2蛋白抑制剂中的一种或二种以上。
10.如权利要求8所述的治疗肿瘤药物混合物，
所述肿瘤药物为权利要求3或4中所述肿瘤药物中的一种或二种以上。
技术总结