本发明属于生物技术领域，具体涉及人tpt1/tctp基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤翻译控制蛋白（tpt1或tctp）是一个生长相关的蛋白质，有促进生长、抗凋亡的作用，阻断该蛋白表达能抑制肿瘤细胞株的恶性表型。tpt1/tctp基因与其他甲状腺癌、胸腺瘤之间的关联尚无相关报道。现有技术中使用方法类似基因构建了人基因小分子干扰rna、人基因干扰核酸构建体、人基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。提供sirna或者包含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
本发明深入研究tpt1/tctp基因在肿瘤发生中的调节功能，甲状腺癌、胸腺瘤细胞模型，以rnai为手段研究tpt1/tctp在甲状腺癌、胸腺瘤发生和发展中的作用。核糖核酸干扰(rnainterference，rnai)作为一种基因沉默技术，可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失。目前，该技术在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供人tpt1/tctp基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的采用以下技术方案：
本发明以rna干扰为手段，研究了tpt1/tctp基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制tpt1/tctp基因的转录或翻译，或能够特异性抑制tpt1/tctp蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。所述肿瘤细胞选自甲状腺癌、胸腺瘤之任一。
从genbank中调取人tpt1/tctp基因序列；预测多个sirna位点；合成针对tpt1/tctp基因的有效的sirna序列，两端含酶切位点粘端的双链dnaoligo；慢病毒载体双酶切后与双链dnaoligo连接，构建表达tpt1/tctp基因sirna序列的rnai质粒；将rnai质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293t，产生重组慢病毒颗粒，选取胸腺瘤和甲状腺癌细胞系，慢病毒进行侵染，qpcr检测tpt1/tctp基因的沉默效率，筛选高效沉默tpt1/tctp基因的慢病毒。mtt法检测tpt1/tctp沉默后胸腺瘤和甲状腺癌细胞的增殖能力。
本发明的优点在于：
本发明公开了人tpt1/tctp基因的用途及其相关药物。还公开了人tpt1/tctp基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人tpt1/tctp基因小分子干扰rna、人tpt1/tctp基因干扰核酸构建体、人tpt1/tctp基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的sirna或者包含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人tpt1/tctp基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中tpt1/tctp基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1人甲状腺癌细胞ftc-133细胞tpt1/tctp基因干扰效率鉴定。
图2胸腺瘤细胞thy0517细胞tpt1/tctp基因干扰效率鉴定。
图3tpt1/tctp基因干扰后对人甲状腺癌细胞ftc-133细胞增殖能力的影响。
图4tpt1/tctp基因干扰后对胸腺瘤细胞thy0517细胞增殖能力的影响。
图5tpt1/tctp基因干扰后对人甲状腺癌细胞ftc-133细胞凋亡水平的影响。
图6tpt1/tctp基因干扰后对胸腺瘤细胞thy0517细胞凋亡水平的影响。
具体实施方式
实施例1tpt1慢病毒载体的构建和稳转细胞株的建立
1、sirna靶点设计
登录美国国立生物信息中心（ncbi）查询人tpt1（nm_001286272.1）的碱基序列，利用dsir软件针对编码序列区域设计出12对有效的sirna靶点。
2、plvx-shrna2-puro-tpt1及阴性对照plvx-shrna2-puro-nc质粒构建
根据上述sirna序列(以seqidno：1,2,3为例)，设计相应互补的单链dna，两端加bamhi和ecori酶切位点。
退火:将单链的shrna上下游片段进行退火，形成双链dna片段，随后连接至酶切后的载体上。
退火反应体系：
扩增程序：95℃,5min；室温冷却1-2h。
3.干扰载体双酶切回收
1）plvx-shrna2-puro载体酶切体系：
2）plvx-shrna2-puro载体酶切条件：37℃,2-3h。
3）琼脂糖凝胶鉴定，切胶回收。
4）连接
由于shrna片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进行连接。酶切后的载体和基因连接。以下试剂混合后于16℃连接过夜。连接体系如下（10μl）：
5）转化
（1）将感受态细胞stbl3从-80℃冰箱取出，迅速放入冰上，静置5min融化。
（2）加入上述连接体系至感受态中轻轻震荡混匀，再置于冰上冰浴30min；
（3）将上述混合物置42℃水浴锅内水浴90s进行热休克，迅速转移到冰上，开始计时放置3min；
（4）加入无抗性lb液体培养基900μl，恒温摇床温度设定37℃，转速200r/min，培养0.5-1h；
（5）取已铺好的固体lb-amp培养皿，取100μl悬浮的菌液用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀涂布，37℃恒温培养箱内倒置培养过夜。
6）鉴定阳性克隆：挑菌pcr：测序及比对序列。序列比对正确的克隆即为构建成功的载体。
4、慢病毒包装
10cm口径培养皿培养人胚肾细胞293t细胞。待细胞密度达到70%-80%时转染，使用rre、rev、vsv/g慢病毒包装质粒系统，从培养箱中取出293t细胞（(h)dmem 5
