本发明涉及抗菌水凝胶，特别涉及一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
细菌感染自古以来就对公众健康造成极大的威胁。各种抗菌策略中，最常用手段为应用抗生素治疗细菌感染。然而，耐抗生素病原体的出现使得抗生素类药物的应用受到了极大限制，从而迫使研究人员不断探索新型抗菌药物。近年来，银基纳米材料逐渐受到业界广泛关注，并成为了一种具有高效抗菌、非耐药性及广谱杀菌性的抗菌剂，目前，银基纳米材料已广泛应用于烫伤、烧伤、创伤和其他细菌感染的治疗。然而，银基纳米材料在应用中同样面临问题：1)具有潜在的生物毒性；2)抗菌时效短。因此，进一步研究具有无毒性、长效抗菌的新型纳米材料成为了银基纳米材料必须攻克的难点。
银纳米团簇(agncs，尺寸小于2纳米，原子数介于几十到几千范围内)凭借其超小尺寸、高抗菌活性，丰富可控的表面化学以及良好的生物相容性等优势，在治疗细菌感染等生物医药领域开始受到关注。然而，由于agncs被细菌内化后会发生快速分解，一定程度影响到其抗菌持久性。因此，能否在不影响其抗菌性能的前提下，实现ag 的控制释放是提升其抗菌持久性必须解决的关键问题。
水凝胶作为一种不溶于水，具有三维交联网络结构的聚合物材料，凭借其高吸水性、高孔隙率、生物相容性、无毒性以及高透氧性，被广泛应用于药物和抗菌剂的装载，故发明人试图采用具备的三维网络结构的水凝胶实现对银纳米团簇的药物和抗菌剂的可控释放。然而，随着实验的进行，发明人发现银纳米团簇和水凝胶的复合会影响最终复合物的抗菌性，因此，找到合适的抗菌水凝胶的复合合成方法，使可控释放的复合水凝胶具有较佳的持续抗菌性的同时具有较低的生物毒性，从而提高体系的生物相容性，利于其生物医药应用，具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的抗菌水凝胶的持续抗菌性不佳、生物毒性不够低的技术问题，本发明提供了一种抗菌水凝胶的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种抗菌水凝胶的制备方法，将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌，最终合成产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc。
银纳米团簇(agncs)是以银构成金属核，外部由硫醇配体包裹的一种核壳结构，尺寸(金属核)小于2nm的类分子，由银核及外层配体组成，具有广谱杀菌性和生物相容性的特点，在水相中有良好的分散性能，并且相对于同样具有杀菌效果的银纳米颗粒，因银纳米团簇具有更小的尺寸(小于2nm)，从而具有更加丰富的表面化学性质，同时这种超小尺寸初步解决了银纳米颗粒所潜在的毒性问题。但是，银纳米团簇在复杂的生物体内的稳定性不好，容易发生分解，不利于长期的药物作用，故发明人试图采用具有三维网络结构的然水凝胶细菌纤维素(bc)实现对银纳米团簇的可控释放，来解决银纳米团簇在生物体内的稳定性问题，因此，发明人起初将细菌纤维素bc浸泡于已合成的银纳米团簇agncs溶液中，但是此方法合成的水凝胶复合物agncs@bc的毒性较高，抗菌效果也不佳。随着试验的进行，发明人惊喜的发现，将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌得到水凝胶复合物agncs@bc。本发明采用上述原位合成法制备的产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc的抗菌效果最佳，其毒性也能降到较低水平，化学反应复杂多变，究其原因可能是：本发明以天然水凝胶细菌纤维素(bc)为骨架结构，首先将银离子引入细菌纤维素中，再进行银纳米团簇的合成，故水凝胶复合物agncs@bc在合成过程中，原位合成法使银纳米团簇银核和细菌纤维素得三维结构网络之间的相互作用更强，从而使得银离子释放速率趋于平缓，更加有利于降低生物毒性，从而提高体系的生物相容性，更有利于其生物医药应用；同时，原位合成法使银纳米团簇在水凝胶中损失现象被一定程度抑制，有利于抗菌性能的提高。
作为优选，所述硝酸银溶液的浓度范围为4～12mmol/l，所述硫辛酸的浓度范围为20～60mmol/l，所述硼氰化钠的浓度范围为8～24mmol/l；优选的，所述硝酸银、硫辛酸和硼氢化钠的物质的量浓度比为1:5:2。
将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，作为优选，所述细菌纤维素浸泡的时间为20h。
进一步的，传统水凝胶合成过程通常需要运用具有一定生物毒性的交联剂(如戊二醛等)，从而降低体系的生物相容性，不利于其生物医药应用，本发明无需采用交联剂，进一步降低了复合水凝胶的毒性。
本发明加入相应的配体硫辛酸后，室温搅拌的时间可以为15min；本发明加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌的时间可以为24h。
本发明的另一个发明目的是为了提供一种利用上述制备方法制备的抗菌水凝胶。
最后，本发明提供了所述抗菌水凝胶在制备抗菌、控释药物中的应用；优选地，所述药物的浓度为10mmol/l。
本发明采用细菌纤维素为水凝胶骨架，表面原位合成的水凝胶复合物agncs@bc。本发明将传统基于银纳米颗粒或银离子改进为基于银纳米团簇的抗菌水凝胶，实现了银离子的可控释放，初步降低了体系生物毒性，合成方法中没有使用有毒交联剂，进一步降低了生物毒性；将银纳米团簇及细菌纤维素水凝胶相结合，解决了agncs被细菌内化后会发生快速分解的技术缺陷，充分发挥了银纳米团簇的超强抗菌型和水凝胶的可控释放性以及保水性，使水凝胶复合物agncs@bc的持续抗菌效果达到最佳，其生物毒性又得到了一定程度的降低。由以上技术方案可知，本发明提供的抗菌水凝胶，可充分发挥agncs的广谱抗菌及杀菌效率高的优势，采用原位合成法得到的银纳米团簇起到协同抗菌作用，制备的复合材料具有高效的持续抗菌活性和较低的生物毒性。
附图说明
图1为水凝胶复合物agncs@bc合成示意图；
图2为agncs和agncs@bc的紫外-可见光吸收光谱图；
图3为agncs@bc的透射电镜图见图3；
图4为agncs@bc的场发射扫描电镜图；
图5为agncs@bc的元素分析图；
图6为agncs/bc与agncs@bc抗菌活性对比图；
图7为agncs@bc对不同细菌的抗菌活性图；
图8为不同浓度的agncs@bc(以银的浓度为标准)对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径统计图；
图9为agncs@bc，agno3对哺乳动物细胞的毒性测试图
图10为ag在agncs@bc中的缓释曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域技术人员能够更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中浸泡20h，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌15min，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌24h，所述硝酸银溶液的浓度为4mmol/l，所述硫辛酸的浓度为20mmol/l，所述硼氰化钠的浓度范围为8mmol/l，agno3(硝酸银)：dhla(硫辛酸)：nabh4(硼氢化钠)的摩尔浓度比为1:5:2，最终合成产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc，上述合成示意图如图1所示。
将agncs和实施例1制备的agncs@bc的进行紫外-可见光吸收光谱检测，光谱图见图2，如图2所示，以bc为骨架原位合成的agncs@bc，其浸提液的吸收光谱显示了与agncs相同的特征吸收峰，初步证明agncs@bc中所镶嵌的agncs为ag29。
将实施例1制备得到的agncs@bc进行投射电镜扫描，透射电镜图像见图3，图3可以明显观测到尺寸小于2nm的黑色圆点状银纳米团簇特征结构，进一步证实了银纳米团簇的结构。
将实施例1制备得到的agncs@bc场发射扫描，agncs@bc的场发射扫描电镜图如图4所示，图4可以观察到bc骨架明显的纤维结构，尺寸约为20～30nm，并且具有丰富的孔隙。
并对实施例1得到的agncs@bc进行元素分析，详见图5，图5为agncs@bc的元素分析图，其对c、o、ag三种元素进行了分析，图5显示，三种元素均匀分散于水凝胶的结构中，从而证明在bc结构中成功镶嵌了agncs。
对比例1
室温条件下，将细菌纤维素bc浸泡于已合成的agncs溶液中48h，得到agncs/bc。将对比例1得到的agncs/bc与实施例1得到的agncs@bc进行抗菌性能的对比，以金黄色葡萄球菌为细菌模型，测定agncs@bc及agncs/bc对细菌的抗菌活性。将金黄色葡萄球菌在新鲜的细菌培养液中培养12小时，然后取出菌液稀释至od600＝0.1，然后取出100微升菌液均匀涂在培养平板上，将agncs@bc及agncs/bc放置于平板中心，将培养板置于37℃的恒温箱中培养12小时，观察抑菌环大小，结果如图6所示，附图6显示，相同浓度的agncs@bc与agncs/bc对金黄色葡萄球菌的抗菌活性对比，被agncs@bc处理的细菌培养板(右图)的抑菌环直径大，与agncs/bc相比具有更大的抗菌活性。
实施例2
将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，浸泡20h，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌15min，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌24h，所述硝酸银溶液的浓度为8mmol/l，所述硫辛酸的浓度为40mmol/l，所述硼氰化钠的浓度范围为16mmol/l，agno3(硝酸银)：dhla(硫辛酸)：nabh4(硼氢化钠)的摩尔浓度比为1:5:2，最终合成产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc，上述合成示意图如图1所示。
2.1将实施例2得到的agncs@bc进行抗菌活性测试，具体测试如下：
agncs@bc对金黄色葡萄球菌的抗菌实验：
将金黄色葡萄球菌在新鲜的细菌培养液中培养12小时，然后取出菌液稀释至od600＝0.1(od600＝0.1即大约108个菌落数)，然后取出100微升菌液均匀涂在培养平板上，将agncs@bc及纯bc放置于平板中心，将培养板置于37℃的恒温箱中培养12小时，观察抑菌环大小，结果见图7。
agncs@bc对枯草芽孢杆菌的抗菌实验：
将枯草芽孢杆菌在新鲜的细菌培养液中培养12小时，然后取出菌液稀释至od600＝0.1，然后取出100微升菌液均匀涂在培养平板上，将agncs@bc及纯bc放置于平板中心，将培养板置于37℃的恒温箱中培养12小时，观察抑菌环大小，结果见图7。
所述agncs@bc对大肠杆菌的抗菌实验：
将大肠杆菌在新鲜的细菌培养液中培养12小时，然后取出菌液稀释至od600＝0.1，然后取出100微升菌液均匀涂在培养平板上，将agncs@bc及纯bc放置于平板中心，将培养板置于37℃的恒温箱中培养12小时，观察抑菌环大小，结果见图7。
通过对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌用agncs@bc进行处理，培养12小时后得到如图抑菌环结果，附图7证明agncs@bc具有广谱抗菌作用；同时，运用相同方法进行处理的bc对照组没有呈现出抑菌环，说明bc本身并无抗菌活性。
2.2不同浓度的agncs@bc的抗菌实验：
以金黄色葡萄球菌为细菌模型，测定不同浓度的agncs@bc对细菌的抗菌活性。将金黄色葡萄球菌在新鲜的细菌培养液中培养12小时，然后取出菌液稀释至od600＝0.1，然后取出100微升菌液均匀涂在培养平板上，将4mm，6mm，8mm，10mm，12mm的agncs@bc分别放置于平板中心，将培养板置于37℃的恒温箱中培养12小时，观察抑菌环大小，结果如附图8所示，不同合成浓度下得到agncs@bc的抗菌性能测试；对其抗菌活性进行了测试，结果显示，当浓度为10mm时，具有最佳的抗菌活性。
2.3所述agncs@bc进行细胞毒性的测试，测试过程及结果如下：
取出agncs@bc的浸提液(10mm)，在96孔板中处理哺乳动物细胞12小时，用荧光指示剂肉毒碱同二聚体以及钙黄绿素对细胞进行染色，孵育45分钟，采用冷彩色数码摄像观察细胞的着色情况，分别用agncs@bc，agno3以及超纯水对哺乳动物细胞进行处理，培养12小时，超纯水处理的细胞做为对照组，得到如图的荧光照片，结果如附图9所示，agncs@bc处理的细胞与对照组相比无明显差别，细胞存活率高，证实agncs@bc具有极低的生物毒性，而相应的agno3处理的细胞存活率相对较低，由此可证明agncs@bc水凝胶体系在生物相容性方面额优越性。
2.4ag在agncs@bc中的缓释实验：
将200mg所述agncs@bc浸于500ml超纯水中，放置于37℃的环境中缓慢搅拌，分别在30min，1h，2h，4h，8h，12h，18h，24h，36h，48h取出50微升溶液，并测定溶液中的ag 含量，结果如图10所示，图10的缓释曲线可以看出在ag释放的前30min，释放速率较快，而到释放的2h后速率变缓，8小时以后开始缓慢释放，到48小时达到释放平衡，从而证明了ag在agncs@bc中缓释的效果，故本发明提供的agncs@bc因其缓释性使其具有较好的持续杀菌性；抗菌水凝胶在制备抗菌、控释药物中可以得到应用。
实施例3
将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，浸泡20h，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌15min，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌24h，所述硝酸银溶液的浓度为12mmol/l，所述硫辛酸的浓度为60mmol/l，所述硼氰化钠的浓度范围为24mmol/l，agno3(硝酸银)：dhla(硫辛酸)：nabh4(硼氢化钠)的摩尔浓度比为1:5:2，最终合成产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc。
实施例4
将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，浸泡20h，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌15min，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌24h，所述硝酸银溶液的浓度为10mmol/l，所述硫辛酸的浓度为48mmol/l，所述硼氰化钠的浓度范围为18mmol/l，最终合成产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于，将细菌纤维素浸泡在硝酸银溶液中，并加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌，再加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌，最终合成产物银纳米团簇基的水凝胶复合物agncs@bc。
2.如权利要求1所述的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于：所述硝酸银溶液的浓度范围为4～12mmol/l，所述硫辛酸的浓度范围为20～60mmol/l，所述硼氰化钠的浓度范围为8～24mmol/l。
3.如权利要求2所述的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于：所述硝酸银、硫辛酸和硼氢化钠的物质的量浓度比为1:5:2。
4.如权利要求1所述的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于：所述细菌纤维素浸泡的时间为20h。
5.如权利要求1所述的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于，加入相应的配体硫辛酸，室温搅拌15min。
6.如权利要求1所述的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于，加入相应的还原剂硼氰化钠进行还原，室温搅拌24h。
7.如权利要求1-6任意一项所述的制备方法制备的抗菌水凝胶。
8.如权利要求7所述的抗菌水凝胶在制备抗菌、控释药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于；所述药物的浓度为10mmol/l。
技术总结