本发明涉及一种用于改善糖尿病的复合益生菌，属于微生物技术领域。
背景技术：
益生菌在人类有机体中具有许多有利的功能。益生菌可有效抑制致病菌的生长，如产气荚膜梭菌、大肠杆菌、葡萄球菌等，预防食物中毒。益生菌微生物，如乳杆菌、双歧杆菌等，能提高免疫功能，增强对维生素和矿物质化合物的吸收，并刺激有机酸和氨基酸的生成。它们也可以产生多种酶，如脂肪酶和辅酶a等。分子和遗传学研究确定益生菌有益作用可能基于以下四种机制：①通过产生抗菌物质来拮抗；②与病原体竞争粘附上皮细胞和营养物质；③宿主的免疫调节；④抑制细菌毒素的产生。鉴于益生菌对机体健康的重要性，其成为当下的研究热点之一，在临床中也被广泛应用。
2型糖尿病(t2dm)是一组以慢性血浆葡萄糖水平升高为特征的代谢性疾病，其发病主要与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷、肥胖、高热量饮食及生活方式有关。而近年来的研究发现肠道菌群与t2dm关系密切，t2dm患者可发生肠道菌群失调，影响宿主的能量代谢、炎症反应等；同时调节肠道菌群可以影响糖代谢，改善胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性。
妊娠期间的糖尿病有两种情况，一种为妊娠前已确诊患糖尿病，称“糖尿病合并妊娠”；另一种为妊娠前糖代谢正常或有潜在糖耐量减退、妊娠期才出现或确诊的糖尿病，又称为“妊娠期糖尿病(gdm)”。在妊娠早、中期，随孕周的增加，胎儿对营养物质需求量增加，通过胎盘从母体获取葡萄糖是胎儿能量的主要来源。孕妇血浆葡萄糖水平随妊娠进展而降低，空腹血糖约降低10％。原因：胎儿从母体获取葡萄糖增加；孕期肾血浆流量及肾小球滤过率均增加，但肾小管对糖的再吸收率不能相应增加，导致部分孕妇排糖量增加；雌激素和孕激素增加母体对葡萄糖的利用。因此，空腹时孕妇清除葡萄糖能力较非孕期增强。孕妇空腹血糖较非孕妇低，这也是孕妇长时间空腹易发生低血糖及酮症酸中毒的病理基础。到妊娠中、晚期，孕妇体内抗胰岛素样物质增加，如胎盘生乳素、雌激素、孕酮、皮质醇和胎盘胰岛素酶等使孕妇对胰岛素的敏感性随孕周增加而下降。为维持正常糖代谢水平，胰岛素需求量必须相应增加。对于胰岛素分泌受限的孕妇，妊娠期不能代偿这一生理变化而使血糖升高，使原有糖尿病加重或出现gdm。妊娠期往往不能随意用药，而妊娠期糖尿病又对母体和胎儿都具有很大的危害性。
本发明旨在提供一种用于改善糖尿病的复合益生菌，其能够有效改善2型糖尿病以及妊娠期糖尿病，而且主要成分是可以安全应用于食品的菌种，非常安全。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于改善糖尿病的复合益生菌，其能够有效改善2型糖尿病以及妊娠期糖尿病。
中国专利201110325010公开了一株干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)2，于2011年4月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号cgmccno.4775。干酪乳杆菌2的筛选方法是采集甘南藏族自治州牧民家自制发酵牦牛乳样品，来源于传统食品。该菌株在低温条件下发酵性能良好。本公司研发团队发现该株干酪乳杆菌具有较好的改善糖尿病作用，尤其是可以安全应用于改善妊娠期糖尿病，可以应用糖尿病的保健和改善。
中国专利2012105787207公开了一株鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosuslc-sth-13)，该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为：cgmccno.3994；分类命名lactobacillusrhamnosuslc-sth-13，保藏日期2012年7月8日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院。该菌株产乳酸浓度高，能在肠道中定植和存活，增强胃肠道粘膜屏障的功能，具有改善胃肠道的功能，能抑制有害菌的定植，还可在低酸环境存活，忍受肠道环境(如胃酸、胆汁等)的能力强并可定殖于人体肠道。而且鼠李糖乳杆菌及其细胞壁成分能够促进人体外周血单个核细胞分泌肿瘤坏死因子，具有提高机体免疫力的功能。本公司研发团队发现该株鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌联合使用，可以显著促进干酪乳杆菌的改善糖尿病作用。
灵芝属于菌物类中药，也是药食同源的食品，其在我国的应用已长达2000多年，被誉为“中华仙草”。反柄灵芝又名背柄紫灵芝、匙状灵芝，因其形态上菌柄背生与紫芝相异而得名，该灵芝分布于我国云南、福建、广东、广西、香港等地，也可见于印度尼西亚等其它国家。反柄紫灵芝是一种很神奇的滋补品，它营养丰富，深受人们喜爱，能增强人体抵抗力、防癌抗癌、保肝解毒、降三高、改善心血管系统，对中老年人长期失眠、神经衰弱、胃肠病、糖尿病、慢性肺炎、支气管炎、哮喘、肾虚等都有很好的调理作用，且其还有提高大脑记忆力、防老抗衰、养颜美容、延年益寿的功效。
秦付营等从反柄灵芝分离得到2种新的化合物(“反柄紫芝中的二个新化合物”，天然产物研究与开发natprodresdev2016，28:821-824)，其中一种是命名为cochlearole，其侧链实际上为失去1个碳原子的降倍半萜。其结构如下所示：
本公司研发团队发现，cochlearole单独使用并不具有明显的改善糖尿病的效果，直接和干酪乳杆菌cgmccno.4775菌悬液使用也无明显促进效果，但是如果在干酪乳杆菌2的培养基中加入参与发酵，可能通过对cgmccno.4775的生理机能，胞外分泌物等产生影响，则可以大大促进cgmccno.4775改善糖尿病的效果。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种用于改善糖尿病的复合益生菌，其包括：
干酪乳杆菌cgmccno.4775，鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994，以及其他必要的辅剂。
制备上述复合益生菌的方法。
作为进一步优选，在干酪乳杆菌cgmccno.4775的发酵培养基中，含有cochlearole。
所述复合菌剂还可以包括其他益生菌，如干酪乳杆菌，副干酪乳杆菌。
所述复合菌剂可以做成口服液，冻干粉，胶囊等，优选作为口服液。
所述复合菌剂还可以用于发酵食品做成保健食品。
所述食品优选为乳制品。
本发明的研究方法：选择模型小鼠进行效果测试。
本发明的优点：
(1)本发明选用的干酪乳杆菌分离自传统奶酪，是安全性很高的食品用益生菌，而且本身就具有很好的保健效果，鼠李糖乳杆菌更是安全性得到确认，广泛使用的具有显著生理活性的菌种。
(2)灵芝属于菌物类中药，也是药食同源的食品，其在我国的应用已长达2000多年，被誉为“中华仙草”，从灵芝中分离的化合物同样具有很高的安全性，以及潜在的其他保健作用。
(3)本发明的复合菌剂改善糖尿病效果十分显著，适合广大2型糖尿病患者，以及妊娠期糖尿病患者。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例
1、活化菌种：
干酪乳杆菌cgmccno.4775：取一环干酪乳杆菌接种到mrs固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至mrs液体培养基中活化，厌氧培养成1*108cfu/ml干酪乳杆菌cgmccno.4775种子液，使用乳酸调节ph值6.0。
鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994：培养方法同上。
2、配置液体
cochlearole溶液配制：使用水、吐温80(质量分数1％)和皱盖假芝素a配制成皱盖假芝素a浓度为5mg/kg溶液。
3.发酵液配制
a.干酪乳杆菌cgmccno.4775发酵液：鼠李糖乳杆菌cgmcc№.3698种子液至mrs液体培养基中活化，厌氧培养24h，使用培养基调节成1*107cfu/ml，乳酸调节ph值6.0；
b.鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994：同a；
c.混合发酵液1(添加cochlearole)：干酪乳杆菌种子液至mrs液体培养基中活化，同时添加质量分数10％的cochlearole溶液混合培养，厌氧培养24h，使用培养基调节成1*107cfu/ml，乳酸调节ph值6.0；
d.混合发酵液2(添加鼠李糖乳杆菌)：干酪乳杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液同时至mrs液体培养基中活化，厌氧培养24h，使用培养基调节成1*107cfu/ml，乳酸调节ph值6.0。
f.混合发酵液3(添加鼠李糖乳杆菌 cochlearole)：干酪乳杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液同时至mrs液体培养基中活化，同时添加质量分数10％的cochlearole溶液混合培养，厌氧培养24h，使用培养基调节成1*107cfu/ml，乳酸调节ph值6.0。
4.小鼠模型制备
选择km小鼠，15-20g，将小鼠以雌：雄＝2∶1合笼饲养。孕鼠于妊娠第8天通过腹腔注射1％stz80mg/kg构建gdm小鼠模型，每日1次，连续注射3d后检测血糖，若血糖≥11mmol/l，且持续3天则建模成功。将建模成功的90只孕鼠随机分为空白组、对照组、实验组1-4组，各10只，各组小鼠之间无统计学差异。前1天均正常普通喂食。第11天起，连续灌胃1周，各组试验方案如下：
空白组：灌胃0.9％nacl2ml/d；
对照组：灌胃60mg/kg/d吡格列酮；
干酪乳杆菌处理组：干酪乳杆菌cgmccno.4775发酵液(2ml/d)灌胃；
鼠李糖乳杆菌处理组：鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994发酵液(2ml/d)灌胃；
cochlearole处理组：cochlearole(2ml/d)灌胃；
干酪乳杆菌 cochlearole处理组：干酪乳杆菌cgmccno.4775发酵液(1ml/d) cochlearole溶液(1ml/d)灌胃；
干酪乳杆菌 鼠李糖乳杆菌处理组：干酪乳杆菌cgmccno.4775发酵液(1ml/d) 鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994发酵液(1ml/d)灌胃；
cochlearole 鼠李糖乳杆菌处理组：cochlearole溶液(1ml/d) 鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994发酵液(1ml/d)灌胃；
混合发酵液1处理组：混合发酵液(2ml/d)灌胃；
混合发酵液2处理组：混合发酵液(2ml/d)灌胃；
混合发酵液3处理组：混合发酵液(2ml/d)灌胃。
5.gdm小鼠空腹血糖(fbg)的监测
分别于给药前(妊娠第1天)及给药后3d(妊娠第13天)、7d(妊娠第17天)采集小鼠尾静脉血、离心、分离血清，以全血糖仪及配套试纸检测血清fbg。具体结果如表1所示。
6.统计学处理
使用spss16.0,进行统计学分析，计量资料的结果表示为均值±标准差,采用组间t检验。
表1各组别小鼠的空腹血糖(fbg)
注：t检验,l：p<0.05(与空白组比较)；2：p<0.05(和对照组比较)；
各组别小鼠的空腹血糖(fbg)的结果显示干酪乳杆菌cgmccno.4775单独对空腹血糖有一定的作用(p<0.05)，单独cochlearole和鼠李糖乳杆菌均无效果，鼠李糖乳杆菌 cochlearole处理组、干酪乳杆菌 鼠李糖乳杆菌处理组结果和单纯干酪乳杆菌组效果相似，考虑混合使用也无促进作用。但是培养基加入cochlearole或者鼠李糖乳杆菌得到的降糖效果很好，cochlearole 干酪乳杆菌 鼠李糖乳杆菌联合培养效果更好，说明当在培养基阶段加入鼠李糖乳杆菌和cochlearole能够促进干酪乳杆菌的降血糖作用。
综上所述，本公司研发团队发现，干酪乳杆菌cgmccno.4775单独对空腹血糖有一定的作用，cochlearole、鼠李糖乳杆菌单独使用并不具有明显的改善糖尿病的效果，它们直接和干酪乳杆菌cgmccno.4775菌悬液使用也无明显促进效果，但是如果在干酪乳杆菌2的培养基中加入鼠李糖乳杆菌或者cochlearole，能够促进降血糖作用。考虑在培养基中新添加物质参与发酵，可能通过对干酪乳杆菌cgmccno.4775的生理机能，胞外分泌物等产生影响，则可以大大促进cgmccno.4775改善糖尿病的效果。
术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
1.一种用于改善糖尿病的复合益生菌，其包括：
干酪乳杆菌cgmccno.4775，鼠李糖乳杆菌cgmccno.3994，以及其他必要的辅剂。
2.制备权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于：
在干酪乳杆菌cgmccno.4775的发酵培养基中，含有cochlearole。
3.权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于：
所述复合菌剂还可以包括其他益生菌。
4.权利要求1或3所述的复合益生菌，其特征在于：
所述复合菌剂可以做成口服液，冻干粉，胶囊等。
5.权利要求4所述的复合益生菌，其特征在于：
所述复合菌剂做成口服液。
6.权利要求1或3所述的复合益生菌在制备食品上的应用。
技术总结