本发明涉及一种鸦胆子提取物在预防和/或治疗乳腺癌方面的应用以及鸦胆子提取物的制备方法。
背景技术：
癌症是危害人类生命健康的重大疾病，其中乳腺癌是女性最常见的恶性癌症之一，严重威胁着女性的生命健康。目前，乳腺癌的治疗方法可分为三类，分别为药物治疗(化疗)、放射性治疗和手术治疗。临床上使用的化疗药主要有：环磷酸胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇等。然而，化疗药物在应用过程中常诱发诸多不良反应，如紫杉醇，作为一种细胞毒类药物，由于缺乏靶向特异性，在临床应用时，会产生骨髓瘤抑制、过敏反应、神经毒性、脱发以及药物性疼痛等严重毒副作用。同时，由于化疗药物的来源有限、价格高昂，给患者带来了沉重的经济负担。因此为方便临床使用、降低治疗费用、减轻患者痛苦，寻找可有效抑制癌症发展、降低化疗药物剂量、缓解不良反应的物质成为临床上亟待解决的问题。
技术实现要素：
针对以上不足，本发明提供一种能有效预防和/或治疗乳腺癌的鸦胆子提取物，并且该提取物在包括肝肾在内的其他器官都无明显毒副作用，其显著的抑制乳腺癌细胞效果使得其在乳腺癌治疗方面具有极大的前景。
鸦胆子为苦木科(simaroubaceae)鸦胆子属(bruceaj.f.miller)植物鸦胆子(bruceajavanica(linnaeus)merrill)的干燥成熟果实，又名老鸦胆、苦参子和鸦胆子。鸦胆子始载于《本草纲目拾遗》，性苦味寒，有小毒，入大肠经；具有清热解毒，止痢，截疟，腐蚀赘疣的功效。鸦胆子的主要成分为苦木内酯、生物碱和脂肪酸等，其具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗寄生虫和降血糖等。
鸦胆子油为鸦胆子果实中提取得到的脂肪油，由于鸦胆子油能够透过血脑屏障用于治疗多种恶性肿瘤、慢性胃炎和尖锐湿疣等疾病，因此鸦胆子油被制成多种剂型并已成为知名中成药上市多年。鸦胆子油制备方法也较为成熟，常用的制备方法即以石油醚为溶媒，采用超声提取法、索氏提取法和超临界co2萃取法等进行提取。
然而研究发现，鸦胆子还含有大量苦木内酯类成分，主要为鸦胆子苦醇和鸦胆子苦素等，这些成分具有较好的抗肿瘤活性。由于这些成分均为极性成分，因此采用现行方法提取制备鸦胆子油后，他们基本仍大量存在于药渣中，而目前对于药渣部分的研究较少，未见对其进行深入开发和资源综合利用，造成浪费。
本发明通过以下方案达到上述目的：
第一方面，本发明提供一种鸦胆子提取物在预防和/或治疗乳腺癌方面的应用。
其中，鸦胆子提取物包括鸦胆子乙醇提取物或鸦胆子油。
第二方面，本发明提供一种鸦胆子提取物在制备预防和/或治疗乳腺癌药物的应用。
其中，鸦胆子提取物包括鸦胆子乙醇提取物或鸦胆子油。
第三方面，本发明提供一种鸦胆子乙醇提取物的制备方法，包括：取鸦胆子，或提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣，加入乙醇溶液，进行连续回流提取，收集回流提取液，剩下沉淀再重复上述步骤操作，重复1-3次，合并所有滤液；将滤液减压浓缩，得到鸦胆子乙醇提取物。
在上述制备方法中，以1:4的料液比加入乙醇溶液。
在上述制备方法中，乙醇溶液优选为95％的乙醇水溶液。
在上述制备方法中，重复次数优选为2次。
在上述步骤中，减压浓缩后还可以冷冻干燥，得到鸦胆子乙醇提取物。
发明人发现，在上述制备方法中，采用95％的乙醇水溶液并且重复次数为2次时，可以实现较高的提取率，例如使用该方法使可使提取率达到1.4％及以上。
发明人发现，使用冷冻干燥可使提取物活性最大程度保留。
一种优选的鸦胆子乙醇提取物的制备方法，包括：取鸦胆子，或提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣，以液料比1:4的比例加入95％的乙醇溶液，进行连续回流提取，收集回流提取液，剩下沉淀再重复上述步骤操作，重复2次，合并所有滤液；将滤液减压浓缩，冷冻干燥，得到鸦胆子乙醇提取物。
上述优选的制备方法可在试剂、能耗最为合理的情况下获得较高的提取效率，并保证提取物的抑制效果。
第四方面，提供一种上述制备方法制备得到的鸦胆子乙醇提取物。
第五方面，提供一种预防和/或治疗乳腺癌的药物，包括鸦胆子提取物，及药学上可接受的载体。
其中，鸦胆子提取物包括鸦胆子乙醇提取物或鸦胆子油。
本发明中所述的鸦胆子油可以通过常规方法制备得到，也可以市售购买。
例如，一种常规方法制备鸦胆子油的的方法：取鸦胆子，利用石油醚提取，提取液蒸馏回收石油醚，过滤得到鸦胆子油。
采用本发明的制备方法得到的鸦胆子乙醇提取物，进行体外抗乳腺癌细胞实验，结果表明鸦胆子提取物作用于细胞48小时后，能显著抑制乳腺癌细胞增殖和自噬。
采用本发明的制备方法得到的鸦胆子乙醇提取物，进行乳腺癌小鼠体内抗肿瘤实验，结果表明鸦胆子提取物，灌胃给药后，能明显抑制肿瘤生长，减轻肿瘤重量，缩小肿瘤体积，抑制肿瘤组织自噬，并且对小肠、肝脏和肾脏无明显损伤。
其中，本发明制备的鸦胆子乙醇提取物ic50值为10.42μg/ml，抑制效果显著。
采用本领域常规方法得到的鸦胆子油，进行乳腺癌小鼠体内抗肿瘤实验，结果表明鸦胆子油，灌胃给药后，能明显抑制肿瘤生长，减轻肿瘤重量，缩小肿瘤体积，抑制肿瘤组织自噬，并且对小肠、肝脏和肾脏无明显损伤。
现有技术通常认为，鸦胆子的鸦胆子油是其抗肿瘤活性主要活性物质，因此，对于鸦胆子油的提取受到广泛的关注，然而，本发明申请中对鸦胆子或者提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣进行乙醇提取后发现，乙醇提取物对于乳腺癌发展表现出了非常显著的抑制效果，且在较低剂量下即表现出与鸦胆子油接近的抗肿瘤效果，也无明显毒副作用，说明该乙醇提取物的抗肿瘤活性优于鸦胆子油；另一方面，从鸦胆子或者提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣中获得的乙醇提取物，两者的抗肿瘤效果无明显差异，说明鸦胆子油，以及鸦胆子或者提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣的乙醇提取物，均是鸦胆子抗乳腺癌的活性成分。
与现有技术相比，本发明申请的制备方法中，以鸦胆子种子或其提取完脂肪酸后的药渣为原料，以乙醇为提取溶剂，经加热回流提取、减压浓缩、冷冻干燥等步骤完成制备，一方面，本发明申请的提取物无需去糖处理、硅胶柱层析及重结晶即可获得，从而使本发明申请的提取物具有制备工艺简单，试剂安全无毒，生产成本低，另一方面，通过提取参数的组合，使得提取物得率高、产量大，而提取物的抑制效果好，完全不需要进一步纯化或结晶即可实现显著的抑制效果。
发明人进一步将鸦胆子乙醇提取物与鸦胆子油分别对乳腺癌细胞的抑制作用进行比较后发现，在体外，鸦胆子乙醇提取物能明显抑制乳腺癌细胞生长而鸦胆子油对乳腺癌细胞无明显影响；在体内，鸦胆子油与鸦胆子乙醇提取物均能抑制乳腺癌细胞生长，两者效果相近。这可能提示鸦胆子乙醇提取物具有更好的治疗乳腺癌方面的潜力。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
本发明的鸦胆子乙醇提取物在提取过程中，充分利用鸦胆子药材，以乙醇为溶剂，采用加热回流提、减压浓缩、冷冻干燥的提取方法，具有试剂环境友好，工艺简单，生产成本低，有效避免有机溶剂污染的优点，且该提取方法可以最大限度保留鸦胆子提取物的活性，其ic50值低，提取得到的鸦胆子提取物具有制备治疗乳腺癌药物的前景。
本发明发现，鸦胆子提取物，既可以发挥抗肿瘤作用，又对机体无明显副作用，具有良好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明鸦胆子提取物及其提取方法和应用以及有益效果进行详细说明。
图1是本发明实施例1鸦胆子乙醇提取物的成分检测结果图。
图2是本发明试验例1鸦胆子乙醇提取物对乳腺癌细胞活力影响结果。
图3是本发明试验例1各组细胞的自噬相关蛋白表达水平westernblot图。
图4是本发明试验例1各组细胞的ulk1蛋白表达水平变化图。
图5是本发明试验例1各组细胞的beclin-1蛋白表达水平变化图。
图6是本发明试验例1各组细胞的p62蛋白表达水平变化图。
图7是本发明试验例1各组细胞的lc3ii/i蛋白表达水平变化图。
图8是本发明试验例2各组动物肿瘤组织体积变化图。
图9是本发明试验例2各组动物肿瘤组织重量变化图。
图10是本发明试验例2各组动物小肠组织he染色比较图。
图11是本发明试验例2各组动物肝组织he染色比较图。
图12是本发明试验例2各组动物肾组织he染色比较图。
图13是本发明试验例2各组动物肿瘤组织自噬相关蛋白westernblot图。
图14是本发明试验例2各组动物肿瘤组织ulk1蛋白表达水平变化图。
图15是本发明试验例2各组动物肿瘤组织beclin-1蛋白表达水平变化图。
图16是本发明试验例2各组动物肿瘤组织p62蛋白表达水平变化图。
图17是本发明试验例2各组动物肿瘤组织lc3ii/i蛋白表达水平变化图。
图18是本发明试验例3各组动物肿瘤组织体积变化图。
图19是本发明试验例3各组动物肿瘤组织重量变化图。
图20是本发明试验例3各组动物小肠组织he染色比较图。
图21是本发明试验例3各组动物肝组织he染色比较图。
图22是本发明试验例3各组动物肾组织he染色比较图。
图23是本发明试验例3各组动物肿瘤组织自噬相关蛋白westernblot图。
图24是本发明试验例3各组动物肿瘤组织ulk1蛋白表达水平变化图。
图25是本发明试验例3各组动物肿瘤组织beclin-1蛋白表达水平变化图。
图26是本发明试验例3各组动物肿瘤组织p62蛋白表达水平变化图。
图27是本发明试验例3各组动物肿瘤组织lc3ii/i蛋白表达水平变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
除非特别说明，本发明实施例采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明中的鸦胆子包括鸦胆子种子。
实施例1鸦胆子药渣的制备
鸦胆子，购自白云山明兴制药有限公司。
取鸦胆子，以料液比1:5的比例加入石油醚作为提取溶剂，进行连续加热回流提取，过滤，收集滤渣烘干，即为鸦胆子药渣。
实施例2鸦胆子乙醇提取物的制备及成分分析
鸦胆子，购自白云山明兴制药有限公司。
取鸦胆子，或提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣，以料液比1:4的比例加入95％的乙醇，进行连续回流提取，过滤，收集滤液，剩下沉淀重复上述提取过程两次，将三次所得滤液合并，减压浓缩至无乙醇味，冷冻干燥，即为鸦胆子乙醇提取物，提取率为1.4％。
鸦胆子提取物的成分分析：将鸦胆子乙醇提取物溶于甲醇，以水和甲醇作为流动相，采用液相色谱法(hplc)进行成分检测，检测波长为240nm，鸦胆子提取物的色谱图如图1所示。
从图1可以看到，240nm波长下可检测出鸦胆子乙醇提取物中含有多种成分，其中通过保留时间对比发现，其中包括鸦胆子苦醇(保留时间约为33min)。
试验例1鸦胆子乙醇提取物对乳腺癌细胞的抑制作用
1、鸦胆子乙醇提取物对mda-mb-231细胞活力的影响
将乳腺癌细胞(mda-mb-231)培养于deme完全培养基中(含1％青链霉素双抗及10％胎牛血清)，于37℃恒温、5％co2饱和湿度的无菌培养箱中培养。取生长对数时期的细胞，用磷酸缓冲盐清洗两遍，加入适量胰酶消化细胞，收集细胞，离心，加入适量上述培养基重悬，调整细胞浓度为3×104个/ml，然后接种于96孔板中。过夜培养后，加入鸦胆子乙醇提取物溶液(按照实施例2制备所得)，使其终浓度为0.78～200μg/ml。培养48h后，于每孔中加入20μl噻唑蓝溶液(mtt)，继续培养4h后，于酶标仪490nm处检测光密度od值，并计算各自ic50值与细胞活力百分比。
2、免疫印迹法(westernblot，wb)检测细胞自噬相关蛋白表达水平
取生长对数时期的细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于6孔板中。过夜培养后，按表1所示，设置5组。培养48h后，收集6孔板细胞，使用wb技术测定检测自噬相关蛋白(ulk1、p62、、lc3ii/i)表达水平。其中与空白对照组比较，“*”“**”分别表示p<0.05，p<0.01。
表1
3、结果
如图2所示，给药48小时后，鸦胆子乙醇提取物能明显抑制mda-mb-231细胞活性，并且呈现出一定的浓度依赖性(1.5625～200μg/ml)，其ic50值为10.42μg/ml，说明鸦胆子乙醇提取物能有效抑制肿瘤细胞生长，在体外起到抗肿瘤作用，具有制备治疗乳腺癌药物的前景。
图3至图7的检测结果说明，与空白对照组相比，鸦胆子乙醇提取物组(中浓度、高浓度组)中ulk1和beclin-1蛋白表达水平明显降低，而p62蛋白表达水平上升(低浓度、中浓度组)，lc3ii/i蛋白表达比值明显降低(高浓度组)。说明鸦胆子乙醇提取物能通过抑制mda-mb-231细胞自噬，从而发挥抗肿瘤作用。
试验例2鸦胆子乙醇提取物对荷瘤小鼠乳腺癌的抑制作用
1、造模与给药
取balb/c裸鼠，雌性。适应性饲养3天后，按体重随机分为正常组(10只)和荷瘤组(40只)。荷瘤组接种乳腺癌细胞mda-mb-231(2×106个/只)，建立小鼠乳腺癌模型。当肿瘤体积长到1mm3，将荷瘤组进行随机分组，按表2连续给药21天，正常组和模型组给予等体积的生理盐水。
表2
2、取材与检测
实验过程中，每周测量两次肿瘤体积。末次给药24h后，将小鼠脱臼处死，剖取肿瘤、小肠、肝脏、肾脏。将肿瘤进行拍照、称重后冻存，用于免疫印迹实验(westernblot，wb)，检测其中自噬相关蛋白(ulk1、p62、beclin-1、lc3ii/i)表达水平。取小肠、肝脏、肾脏组织用于苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining，he)观察组织变化。其中与模型组比较，“*”“**”分别表示p<0.05，p<0.01。
3、结果
如图8、图9所示，给药21天后，紫杉醇组和鸦胆子乙醇提取物组(高、低剂量组)均可明显抑制肿瘤的生长，使肿瘤的体积和重量明显下降。说明鸦胆子乙醇提取物在荷瘤小鼠体内具有显著的抗肿瘤作用。
图10、图11、图12的he染色结果表明，与模型组相比，紫杉醇组小肠组织结构发生改变，主要集中在侧肌层疏松，肠绒毛明显缩短；肝组织出现明显的炎症浸润，而与紫杉醇组相比，鸦胆子乙醇提取物组(高、低剂量组)小肠未出现明显损伤，肝组织也无炎症浸润。说明鸦胆子乙醇提取物的抗肿瘤作用并不会致使非靶器官产生毒副作用。
图13至图17的检测结果说明，与模型组相比，鸦胆子乙醇提取物高剂量组中ulk1、beclin-1蛋白表达水平明显降低，lc3ii/i蛋白的比值也明显下降。说明说明鸦胆子乙醇提取物在荷瘤小鼠体内能通过抑制细胞自噬，从而发挥抗肿瘤作用。
试验例3鸦胆子油对荷瘤小鼠乳腺癌的抑制作用
1、材料与方法
4～5周龄雌性balb/c裸鼠，购自广东省实验动物中心(动物许可证证号：gt-iacuc201807262)；紫杉醇注射液(100mg/16.7ml)，由海南全星制药有限公司提供；鸦胆子油乳(货号：160202)购自广州白云山明兴制药有限公司，含10％鸦胆子油。
2、造模与给药
取balb/c裸鼠，雌性。适应性饲养3天后，按体重随机分为正常组(10只)和荷瘤组(50只)。荷瘤组接种乳腺癌细胞mda-mb-231(2×106个/只)，建立小鼠乳腺癌模型。当肿瘤体积长到1mm3，将荷瘤组进行随机分组，按表3连续给药21天，正常组和模型组给予等体积的生理盐水。
表3
3、取材与检测
实验过程中，每周测量两次肿瘤体积。末次给药24h后，将小鼠脱臼处死，剖取肿瘤、小肠、肝脏、肾脏。将肿瘤进行拍照、称重后冻存，用于免疫印迹实验(westernblot，wb)，检测其中自噬相关蛋白(ulk1、p62、beclin-1、lc3ii/i)表达水平。取小肠、肝脏、肾脏组织用于苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining，he)观察组织变化。其中与模型组比较，“*”“**”分别表示p<0.05，p<0.01。
4、结果
如图18、图19所示，给药21天后，紫杉醇组和鸦胆子油组(高、中、低剂量组)均可明显抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤组织的体积和重量明显下降。说明鸦胆子油在荷瘤小鼠体内具有显著的抗肿瘤作用，同时该作用与鸦胆子乙醇提取物的抗肿瘤作用相近(见图8、图9)。
图20、图21、图22的he染色结果表明，与模型组相比，紫杉醇组小肠组织结构发生改变，主要集中在侧肌层疏松，肠绒毛明显缩短；肝组织出现明显的炎症浸润，而与紫杉醇组相比，鸦胆子油组(高、中、低剂量组)小肠未出现明显损伤，肝组织也无炎症浸润。说明鸦胆子油的抗肿瘤作用并不会致使非靶器官产生毒副作用。
图23至图27的检测结果说明，与模型组相比，鸦胆子油组(中剂量、高剂量组)中ulk1蛋白表达水平以及lc3ii/i蛋白表达的比值均明显下降，beclin-1蛋白表达水平显著降低(高剂量组)。说明鸦胆子油在荷瘤小鼠体内能通过抑制细胞自噬，从而发挥抗肿瘤作用。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
1.一种鸦胆子提取物在制备预防和/或治疗乳腺癌药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，鸦胆子提取物包括鸦胆子乙醇提取物或鸦胆子油。
3.一种鸦胆子乙醇提取物的制备方法，其特征在于，包括：取鸦胆子，或提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣，加入乙醇溶液，进行连续回流提取，收集回流提取液，剩下沉淀再重复上述步骤操作，重复1-3次，合并所有滤液；将滤液减压浓缩，得到鸦胆子乙醇提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，以1:4的料液比加入乙醇溶液；或，乙醇溶液为95％的乙醇水溶液。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重复次数优选为2次。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，减压浓缩后还冷冻干燥，得到鸦胆子乙醇提取物。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用95％的乙醇水溶液，并且重复次数为2次。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括：取鸦胆子，或提取完脂肪酸后的鸦胆子药渣，以液料比1:4的比例加入95％的乙醇溶液，进行连续回流提取，收集回流提取液，剩下沉淀再重复上述步骤操作，重复2次，合并所有滤液；将滤液减压浓缩，冷冻干燥，得到鸦胆子乙醇提取物。
9.一种预防和/或治疗乳腺癌的药物，其特征在于，包括鸦胆子提取物，及药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，鸦胆子提取物包括鸦胆子乙醇提取物或鸦胆子油。
技术总结