本发明属于医药卫生领域，涉及鹿草醇提物在制备预防和/或治疗心肌缺血性疾病药物中的应用。
背景技术：
缺血性心脏病(ischemicheartdisease,ihd),又称冠状动脉粥样硬化性心脏病,简称冠心病,主要是指由于冠状动脉粥样硬化使血管腔阻塞、冠脉供血和心肌需求之间失衡，导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病。近年来，心肌缺血在我国的患病率呈逐年上升的趋势，已成为中老年人的常见病和多发病，一些20～30岁的年轻人也出现心肌缺血的表现。缺血性心脏病发病机制复杂，至今尚未完全阐明。氧化应激和能量代谢学说是目前较公认的解释缺血性心脏病发病机理的重要学说，心肌组织的缺血缺氧诱导了氧化应激，产生大量ros，同时干扰了心肌细胞的能量代谢，从而造成心肌损伤。
目前临床上治疗心肌缺血的药物众多，如：复方丹参滴丸、冠心苏合丸、速效救心丸等，但传统中药复方存在机理不明、疗效不稳、药效不明显等缺点，因此，寻求安全而有效的心肌缺血的治疗药物十分有必要。
鹿草(rhaponticumcarthamoides(willd.)iijin，rc)为菊科漏芦属植物，分布于新疆西北部、西伯利亚、中亚地区，有新疆人参之称。在民间，鹿草多作为一种强壮剂使用，用于体乏、老年性心功能不全及心血管等疾病的治疗。在俄罗斯的一些药用植物和芳香植物研究所等科研单位，鹿草作为强壮剂的研究较多，同时鹿草作为膳食补充剂可用于术后恢复、消除机体虚弱感以及增加机体能量水平等。最新研究发现，鹿草具有抗脑缺血、抗心律失常等药理作用，同时鹿草可增加供氧能力。
核因子e2相关因子2(nuclearfactorerythroid2p45-relatedfactor2,nrf2),是cnc(cap'n'collar)转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子，能够和抗氧化反应元件are相互作用，增强细胞对氧化应激的抵抗。近年来研究发现，nrf2除了是机体抗氧化防御系统的主要调节因子，在氧化应激中发挥作用外，还可以直接参与关键代谢基因的调控等过程，或通过与其他转录因子的相互作用间接影响其表达，进而参与能量代谢等过程。此外，已有研究证明，川芎、益气活血药等中药及中药复方可通过激活nrf2通路对抗心肌缺血大鼠氧化应激损伤。
虽然现有技术已报道鹿草具有多种生物活性，但鹿草是否能够减轻心肌缺血性疾病，及其相关作用机制还未见报道。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种鹿草醇提物在制备预防和/或治疗心肌缺血性疾病药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了鹿草醇提物在制备预防和/或治疗心肌缺血性疾病药物中的应用。
优选地，所述的药物为通过改善能量代谢水平治疗心机缺血性疾病的药物。
进一步优选地，所述的药物为通过增加心肌组织中atp和nad /nadh含量、降低血清中ld含量而改善能量代谢水平的药物。
优选地，所述的药物为通过改善氧化应激水平治疗心机缺血性疾病的药物。
进一步优选地，所述的药物为通过激活心肌细胞中nrf2蛋白的表达而减轻氧化应激反应的药物。
进一步优选地，所述的药物为降低血清中ck、ck-mb及ast的含量的药物。
进一步优选地，所述鹿草醇提物通过以下方法制备所得：
1)取鹿草根部粉碎，用体积分数为70％的乙醇水溶液作为溶剂进行回流提取数次，每次6小时，合并提取液，得到醇提液；
2)将醇提液中的溶剂回收后，经过滤、浓缩至浸膏，然后烘干、粉碎，制得醇提物。
本发明还公开了一种用于预防和/或治疗心肌缺血性疾病的药物，该药物由鹿草醇提物和药学上可接受的药用辅料制成药学上可接受的剂型；
所述鹿草醇提物通过以下方法制备所得：
1)取鹿草根部粉碎，用体积分数为70％的乙醇水溶液作为溶剂进行回流提取数次，每次6小时，合并提取液，得到醇提液；
2)将醇提液中的溶剂回收后，经过滤、浓缩至浸膏，然后烘干、粉碎，制得醇提物。
优选地，所述药用辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂、表面活性剂、吸收促进剂和润滑剂中的一种或几种。
优选地，所述剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了鹿草醇提物在制备预防和/或治疗心肌缺血性疾病药物中的应用，鹿草醇提物可延长缺氧小鼠的存活时间，减缓心肌缺血缺氧大鼠的血压和st段的变化，鹿草醇提物具有降低大鼠血清中ck、ck-mb、ast的含量的作用，能够减轻iso诱导的大鼠心肌和线粒体的损伤，鹿草醇提物具有降低大鼠血清中ld含量的作用，鹿草醇提物能够通过改善能量代谢水平，来治疗心肌缺血性疾病；鹿草醇提物通过激活nrf2来减轻氧化应激反应，从而改善心肌缺血性疾病。本发明经过体内外药理实验证实，鹿草醇提物具有以下药理活性：(1)抗大鼠心肌缺血缺氧的作用；(2)抗大鼠心肌细胞氧化应激的作用；(3)改善大鼠心肌细胞能量代谢的作用。本发明发现鹿草有良好的治疗心肌缺血缺氧的作用，可用于防治心血管疾病，具有较大的临床应用价值。
附图说明
图1为鹿草醇提物对常压密闭缺氧/iso诱导的心肌缺血缺氧小鼠、iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠ecg、血压的影响；其中，(a)为鹿草醇提物对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响；(b)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧小鼠存活时间的影响；(c)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧小鼠心电图s-t段变化的影响；(d)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心电图s-t段变化的影响；(e)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心率变化的影响；(f)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠收缩压变化的影响；(g)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠舒张压变化的影响；(h)为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠平均压变化的影响。
图2为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心肌酶含量的影响结果图；其中，(a)为ast活性；(b)为ck活性；(c)为ck-mb活性。
图3为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠的心肌组织形态he染色结果图。
图4为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠的线粒体形态透射电镜照片。
图5为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心肌组织能量代谢指标的影响结果图；其中，(a)为nad /nadh；(b)为ld含量；(c)为atp含量。
图6为鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心肌组织氧化应激指标的影响结果图；其中，(a)为sod含量；(b)为mda含量；(c)为cat含量；(d)为gsh-px含量。
图7为鹿草醇提物对cocl2刺激造成h9c2损伤的影响；其中，(a)mtt法检测鹿草醇提物对h9c2活性的影响；(b)为ldh活性；(c)为ast活性；(d)为ck活性；(e)为ck-mb活性。
图8为鹿草醇提物对cocl2损伤大鼠心肌细胞影响的荧光显微镜照片。
图9为鹿草醇提物对cocl2损伤心肌细胞中氧化应激指标的影响结果图；其中，(a)为sod含量；(b)为mda含量；(c)为cat含量；(d)为gsh-px含量。
图10为鹿草醇提物对cocl2损伤心肌细胞中能量代谢指标的影响结果图；其中，(a)为atp含量；(b)为ld含量；(c)为nad /nadh。
图11为鹿草醇提物对cocl2损伤大鼠心肌细胞中nrf2表达的影响结果图。
图12为nrf2对cocl2损伤心肌细胞影响的荧光显微镜照片。
图13为nrf2对cocl2损伤心肌细胞中能量代谢指标的影响；其中，(a)为atp含量；(b)为ld含量。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
一、鹿草醇提物的制备
鹿草醇提物的提取，包括以下步骤：
1)取干燥鹿草根部200g，使用粉碎机将其粉碎成粉末；
2)采用体积分数为70％的乙醇水溶液回流提取三次，一次6小时，合并提取液得醇提液；
3)所述醇提液经回收乙醇后，依次经过滤、浓缩成稠膏、烘干、粉碎处理得鹿草醇提物。
二、鹿草醇提物的药理作用研究
材料来源：新疆兴盛泰生物科技股份有限公司
1、鹿草醇提物对常压密闭缺氧/iso诱导的心肌缺氧小鼠、iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠ecg、血压的影响实验：
km雄性小鼠灌胃鹿草醇提物(60、120、240mg/kg)rc、阳性药红景天r.rosea(6ml/kg)14天，放入250ml广口瓶进行密闭缺氧实验，检测其存活时间，如图1中(a)所示，结果表明，鹿草醇提物和阳性药红景天都能够延长其存活时间。
建模：km雄性小鼠灌胃鹿草醇提物(60、120、240mg/kg)、阳性药红景天(6ml/kg)14天，皮下注射异丙肾上腺素(20mg/kg)3天，构建心肌缺血缺氧小鼠模型。
采用bl-420s生物机能实验系统检测大鼠造模前后心电图(ecg)变化；其后放入250ml广口瓶进行密闭缺氧实验，检测其存活时间。如图1中(b)和(c)所示，结果表明，鹿草醇提物及阳性药红景天都能够改善小鼠心电图变化并延长其存活时间。
造模：sd雄性大鼠灌胃鹿草醇提物(40、80、160mg/kg)、阳性药红景天(4ml/kg)14天，皮下注射异丙肾上腺素(85mg/kg)2天构建特异性心肌缺血缺氧大鼠模型。
采用bl-420s生物机能实验系统检测大鼠造模前后心电图(ecg)变化，如图1中(d)所示；采用bp-300a全自动大小鼠无创血压测量系统检测大鼠造模前后心率变化，如图1中(e)所示；采用bp-300a全自动大小鼠无创血压测量系统检测大鼠造模前后血压变化，如图1中(f)、(g)、(h)所示，结果表明，鹿草醇提物能够改善大鼠心电图、心率及血压的变化。
2、鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心肌酶、心肌组织形态、线粒体形态的影响实验：
按照上述方法对sd雄性大鼠进行造模，造模成功后2小时腹主动脉采血，3500rpm离心10min，收集上清液，置于-20℃保存。采用肌酸激酶(ck)、肌酸激酶同工酶(ck-mb)、谷草转氨酶(ast)测定试剂盒，分别检测ast、ck及ck-mb、的含量，结果如图2中(a)、(b)和(c)所示，结果表明，与iso组相比，鹿草醇提物及阳性药红景天都能够降低大鼠血清中ast、ck、ck-mb的含量，减少iso诱导缺血缺氧大鼠造成的心肌损伤；处死大鼠，取心脏，用生理盐水冲洗除去血污，剔尽脂肪组织等非心肌组织，顺房室沟从心尖到心基底部平行将心室切开，取心室肌组织修成大约lmm3的小块，投入电镜固定液中，用于透射电镜检测线粒体形态如图4所示；其余心室肌组织投入4％多聚甲醛，用于he染色检测心肌组织形态，如图3所示。结果表明，鹿草醇提物及阳性药红景天能够改善大鼠线粒体和心肌组织形态。
3、鹿草醇提物对iso诱导的心肌缺血缺氧大鼠心肌组织氧化应激、能量代谢的影响实验：
取约100mg心肌组织，加入冷的生理盐水，用组织匀浆机制备10％心肌匀浆。然后匀浆液离心，转速为3000转/分，在4℃下离心15分钟。取匀浆上清，采用超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、过氧化氢酶(cat)测定试剂盒，检测氧化应激指标sod、mda、gsh-px、cat的含量，如图6所示，结果表明，鹿草醇提物能够降低心肌组织中mda含量(图6中(b))，增加心肌组织中sod(图6中(a))、cat(图6中(c))、gsh-px(图6中(d))的含量。
采用腺嘌呤核苷三磷酸(atp)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad(h))、乳酸(ld)测定试剂盒，检测能量代谢指标atp、nad /nadh、ld的含量，如图5所示，结果表明，鹿草醇提物及阳性药红景天能够降低大鼠血清中ld的含量(图5中(b))，增加心肌组织中atp(图5中(c))、nad /nadh(图5中(a))的含量。
4、鹿草醇提物对cocl2损伤心肌细胞的影响实验：
s1：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板中每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度1000-10000/孔；
s2：5％co2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底50％，加入不同浓度的鹿草醇提物(100、200、400μg/ml)；
s3：5％co2，37℃孵育24h，加入cocl2(400μmol/l)；
s4：每孔加入10μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h；
s5：吸去孔内培养液；
s6：每孔加入100μl培养二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪od490nm处测量各孔的吸光值。
如图7所示，结果表明，同cocl2组相比，鹿草醇提物和阳性药红景天苷提高了缺氧心肌细胞的存活率。
5、鹿草醇提物对cocl2损伤心肌细胞中氧化应激、能量代谢的影响实验：
h9c2种6孔板，饥饿4h，鹿草醇提物(100、200、400μg/ml)预处理24h，cocl2(400μmol/l)刺激24h后，收集细胞检测细胞中sod、gsh-px、cat和mda含量，同上处理细胞，6孔板中加入稀释好的碧云天ros检测试剂盒中的试剂dcfh-da(无血清培养液稀释，稀释比1:1000)1ml，5％co2，37℃孵育20min。然后用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞的dcfh-da。最后通过荧光显微镜进行拍照。结果如图8、图9所示。
结果表明，与对照组相比，缺氧组显著降低心肌细胞中sod、cat、gsh-px活性、升高mda含量和ros水平，与缺氧组相比，鹿草醇提物组和阳性药红景天苷组显著升高了心肌细胞中sod、cat和gsh-px的含量，如图9中(a)(c)、(d)所示，降低了ros水平和mda含量，如图8、图9中(b)所示，说明鹿草醇提物具有抗氧化应激的活性。
h9c2种6孔板，饥饿4h，鹿草醇提物(100、200、400μg/ml)预处理24h，cocl2(400μmol/l)刺激24h后，收集细胞上清液检测上清液中ld含量，收集细胞检测细胞中atp、nad/nadh含量，如图10所示。
结果表明，与对照组相比，缺氧组显著降低atp、nad/nadh水平、增加ld含量，与缺氧组相比，鹿草醇提物给药组和阳性药红景天苷组显著升高atp、nad /nadh水平，降低ld含量，说明鹿草醇提物具有改善能量代谢的作用。
6、鹿草醇提物对cocl2损伤心肌细胞中nrf2表达的影响实验：
h9c2种6孔板，饥饿4h，鹿草醇提物(100、200、400μg/ml)预处理24h，cocl2(400μmol/l)刺激24h后提细胞总蛋白，通过westernblotting检测h9c2中nrf2的表达水平。
(1)大鼠心肌细胞蛋白提取步骤如下：
s1：吸掉培养基，预冷的pbs轻轻漂洗细胞2遍；
s2：加入预冷的ripa裂解液，并按1:10加入蛋白酶抑制剂，每孔200μl，冰上裂解30min，反复吹打细胞；
s3：收集细胞裂解液，4℃，12000rpm离心20min；
s4：将细胞裂解液上清移至另一新的eppendorf管中，取适量用于测定蛋白浓度(蛋白定量bca试剂盒)，其余分装后-80℃保存。
(2)蛋白变性：将5×上样缓冲液按4:1的比例加入到蛋白样品中，混匀，沸水中煮5min使之变性。
(3)目的蛋白的分离：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)法分离目的蛋白。
(4)目的蛋白的检测：采用ecl化学发光法检测目的蛋白。
(5)凝胶图像分析：采用lane1d生物分析软件对条带的灰度值进行分析，将同一样本的目标蛋白和内参蛋白的的灰度值进行比较相比得到相对灰度值。
如图11所示，实验结果表明，与对照组相比，缺氧组显著降低了心肌细胞中nrf2蛋白表达；与缺氧组相比，鹿草醇提物组和红景天苷组显著增加心肌细胞中nrf2蛋白表达。
7、nrf2对cocl2损伤心肌细胞中中氧化应激和能量代谢的影响实验：
h9c2种6孔板，饥饿4h，鹿草醇提物(100、200、400μg/ml)预处理24h，cocl2(400μmol/l)刺激并加入nrf2的激动剂sfn(2.5μmol/l)24h后，通过试剂盒检测h9c2中ros、atp、ld的表达水平。
结果参见图12，实验结果表明，与对照组相比，缺氧组细胞中ros水平显著升高；与缺氧组比较，鹿草组细胞中ros水平显著降低，激动nrf2后，细胞中ros的水平进一步降低。
结果参见图13，实验结果表明，与鹿草组相比，激动nrf2，可增加缺氧心肌细胞中atp含量，降低ld水平。
本发明以大鼠为研究对象，通过皮下注射异丙肾上腺素(isoproterenol，iso，85mg/kg/day)2天诱导建立心肌缺血缺氧大鼠模型，研究发现鹿草醇提物及阳性药红景天(rhodiolaroseal，r.rosea)具有抗心肌缺血缺氧作用，且是通过改善氧化应激和能量代谢，从而发挥抗心肌缺血缺氧作用的。在细胞水平，以大鼠心肌细胞h9c2为研究对象，通过cocl2刺激建立心肌细胞缺氧模型，发现鹿草醇提物及阳性药红景天苷(salidroside，sal)具有抗心肌缺氧作用，进一步通过激动nrf2等技术，发现鹿草醇提物通过nrf2来改善氧化应激和能量代谢，进而起到抗心肌缺氧的作用。
综上所述，本发明是以干燥鹿草根部为原材料，采用体积分数为70％的乙醇水溶液回流提取得到鹿草醇提液，该发明具有如下优点：(1)鹿草醇提液为天然产物，疗效高，副作用小；(2)本发明研究发现鹿草可通过改善能量代谢水平，来治疗心肌缺血性疾病；(3)本发明研究发现鹿草可通过激活nrf2来减轻氧化应激反应，从而改善心肌缺血性疾病。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
1.鹿草醇提物在制备预防和/或治疗心肌缺血性疾病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过改善能量代谢水平治疗心机缺血性疾病的药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过增加心肌组织中atp和nad /nadh含量、降低血清中ld含量而改善能量代谢水平的药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过改善氧化应激水平治疗心机缺血性疾病的药物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过激活心肌细胞中nrf2蛋白的表达而减轻氧化应激反应的药物。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低血清中ck、ck-mb及ast的含量的药物。
7.如权利要求1～6中任意一项所述的应用，其特征在于，所述鹿草醇提物通过以下方法制备所得：
1)取鹿草根部粉碎，用体积分数为70％的乙醇水溶液作为溶剂进行回流提取数次，每次6小时，合并提取液，得到醇提液；
2)将醇提液中的溶剂回收后，经过滤、浓缩至浸膏，然后烘干、粉碎，制得醇提物。
8.一种用于预防和/或治疗心肌缺血性疾病的药物，其特征在于，该药物由鹿草醇提物和药学上可接受的药用辅料制成药学上可接受的剂型；
所述鹿草醇提物通过以下方法制备所得：
1)取鹿草根部粉碎，用体积分数为70％的乙醇水溶液作为溶剂进行回流提取数次，每次6小时，合并提取液，得到醇提液；
2)将醇提液中的溶剂回收后，经过滤、浓缩至浸膏，然后烘干、粉碎，制得醇提物。
9.如权利要求8所述的用于预防和/或治疗心肌缺血性疾病的药物，其特征在于，所述药用辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂、表面活性剂、吸收促进剂和润滑剂中的一种或几种。
10.如权利要求8所述的用于预防和/或治疗心肌缺血性疾病的药物，其特征在于，所述剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂。
技术总结