本发明属于分析化学和生物领域，具体涉及首次提出一种甘草中生物碱类化合物的制备及用途。
背景技术：
碱性化合物在制药、生物及化学领域均占有十分重要的地位。据统计，在fda批准的1000多种小分子药物中，60％以上为碱性药物。生物碱是植物体内的碱性化合物往往具有独特而显著的药理活性，是很多传统中药的药效物质(延胡索、黄连和苦参等)。在已发现的活性天然化合物中，生物碱类化合物占50％以上，所以被认为是天然药物开发中极具潜力的一类化学成分(facchinipj.alkaloidbiosynthesisinplants:biochemistry,cellbiology,molecularregulation,andmetabolicengineeringapplications.[j].annurevplantphysiolplantmolbiol,2001,52(52):29-66.watsonaa,fleetgw,asanon,etal.polyhydroxylatedalkaloids--naturaloccurrenceandtherapeuticapplications.[j].phytochemistry,2010,32(34):32-36.)。
甘草是一味历史悠久的药材，在世界各地都有着广泛的应用。目前发现的最早使用甘草的证据是在古埃及法老的坟墓里，距今已有3000年的历史。其它关于甘草的应用可以追溯到古希腊和古罗马，通常被用作补药和感冒药。在中国，甘草是使用最广泛的一种传统中药，覆盖了约60％的中医药方，甘草首载于《神农本草经》，被列为上品，后代医家不断沿用和发展，到南北朝时期，医药家陶弘景将甘草尊为“国老”，并言：“此药最为众药之王，经方少有不用者”。明代李时珍的巨著《本草纲目》称：“诸药中甘草为君(季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黄酮的研究进展[j].中草药,2004,35(9):1007-1008.惠寿年,董阿玲.国内对甘草化学成分的研究进展[j].中草药,1999,30(4):313-315.)。广泛的药理作用离不开甘草丰富的化学成分。迄今为止，从甘草中已经分离得到了400多个化合物，其中不乏一些药理活性显著的化合物如甘草酸等(hatanot,yasuharat,miyamotok,etal.anti-humanimmunodeficiencyvirusphenolicsfromlicorice[j].chemical&pharmaceuticalbulletin,1988,36(6):2286-8.)。然而，目前分离、分析得到甘草生物碱类化合物鲜有报道，由于分离制备方法的欠缺，大量非生物碱化合物的存在，严重影响了甘草生物碱类化合物生物分离纯化与活性的研究。
最新研究表明，甘草中含有生物碱类物质的含量约为1.3％左右，且具有一定的活性作用，值得深入研究。然而，由于甘草成分复杂，而且非生物碱类杂质疏水性相似，制备甘草生物碱类组分较为低效、耗时。目前，关于甘草生物碱化合物的分离制备，尚未见报道。因此，发展分离制备方法从甘草中制备生物碱类化合物，对于开展相关生物活性研究和新药研发具有重要意义。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的技术目的是提供一种利用简便、经济、高效的强醇提法结合液液萃取法提取、分离制备甘草中生物碱类组分的方法。具体地说是一种采用回流提取法和液液萃取方法，采用醇提法得到甘草提取物，采用不同的ph条件下萃取得到甘草中生物碱类组分；同时，本发明涉及甘草生物碱作用靶点的发现及此类组分再临床上的应用，体外实验表明，本发明中的甘草生物碱组分作用于m受体，目前研究表明，m受体与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合征、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，据此说明甘草生物碱具有一定的临床应用。该方法对甘草生物碱组分的制制备与用途研究表现出良好的参考。
本发明的具体技术方案为：
本发明提供一种甘草中生物碱类化合物的提取、分离制备方法：
1)原料处理：甘草根切成小块阴干，用粉碎机进行粉碎，过20-80目筛，得甘草药材粗粉，备用；
2)甘草提取物的制备：30％-95％(v:v)醇-水溶液作提取溶剂，回流提取法进行提取，经过滤，浓缩，得甘草提取液；
所述的甘草提提取物的制备所使用的溶剂为醇-水溶液为甲醇-水、乙醇-水、正丁醇-水、或异丙醇水中的任一种。
3)甘草生物碱类化合物的制备：将得到的甘草提取物取一定量，用酸水溶解，ph值调至1-4，用有机溶剂萃取1-6次，之后，ph值调至8-12，用有机溶剂萃取1-6次。
所述的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷中的任一种。所述的调ph值所使用的酸为浓度为0.5-5％的醋酸、盐酸、硫酸或酒石酸中的任一种。所述的调ph值所使用的碱为饱和的碳酸钠溶液、0.2-2mol/l氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或15-25％的氨水。
4)得到的萃取溶液经浓缩处理，得到甘草生物碱粗组分。
步骤1)所述的甘草原料处理方法为：将甘草根切成小块、放在阴处晾干2-20天，阴干至含水量为3-8％后，用粉粹机将晾干的甘草根粉萃成粉末，过筛得甘草粉末。
所述的筛为20-80目筛。
步骤2)所述的甘草提取物的制备方法为：称取一定量的甘草药材粉，用5-30倍量的30％-95％(v:v)醇-水溶液回流提取1-5次，每次回流时间为1-6小时，合并提取液，抽滤、浓缩，得到甘草提取物。
所述的甘草提提取物的制备所使用的溶剂为醇-水溶液为甲醇-水、乙醇-水、正丁醇-水、或异丙醇水中的任一种。
步骤3)所述的甘草生物碱类化合物的制备方法为：甘草提取物样品量为5g-1000g，用50ml-5000ml的磷酸、硫酸、或盐酸-水溶液溶解，ph值保持在1-4，用50ml-5000ml的有机溶剂进行萃取1-6次；碱沉，采用0.2-2mol/l的氢氧化钠、0.2-2mol/l氢氧化钾、或氨水进行调节，ph值保持在8-12，之后，用0.5-5倍体积的有机溶剂进行萃取1-6次。
步骤4)所述的甘草生物碱类化合物的制备过程为，将得到的萃取溶液用旋转蒸浓缩、或离心浓缩进行浓缩，即得甘草生物碱类化合物粗碱。浓缩过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-1000pa。
步骤5)甘草生物碱类化合物用途研究，所述的m受体可能是m1,m2,或m3中的任一种或多种。
本发明的有益效果
该方法采用简便、经济、高效的方法实现了甘草生物碱类化合物的提取、分离与制备，解决了甘草生物碱类化合物由与非生物碱类化合物疏水性相似、含量低等原因被忽略的问题。因此，本发明建立了一种甘草生物碱类化合物提取、分离制备的新方法，为该类化合物生物活性的深入研究和新药研发提供技术支撑。
附图说明
图1为(a)甘草提取物高效液相色谱分析图；
(b)甘草提取物和制备得到的甘草生物碱类化合物液相色谱分
析结果。
图2为(a)buffer、buffer、scopolamine、buffer和甘草生物碱(gcswj)处理hek293-m3细胞后，buffer、carb、carb、gcswj和carb在hek293-m3细胞的rfu信号；
(b)buffer、buffer、scop、buffer和scop处理hek293-m3细胞后，buffer、carb、carb、gcswj(50μm)和gcswj在hek293-m3细胞的rfu信号；
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
1)5kg晾干的甘草根用粉粹机进行粉粹，经60目筛，得甘草根药材粉末。
2)1kg甘草粉末用10升70％(v/v)乙醇作提取溶剂(固液比为1:10)，回流提取3h，抽滤，提取3次，合并提取液，浓缩，得甘草提取物(图1(a))。
3)上述提取物，采用0.2％硫酸溶解，硫酸使用量为2l，其ph约为3。采用石油醚进行萃取，石油醚使用量为2l，共萃取3次。分别收集石油醚层和酸水层。酸水部分用25％的氨水调ph至10，氨水使用量为300ml。采用二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷用量为2.5l，共萃取3次。
4)针对收集的二氯甲烷层，采用旋转蒸发法，在35℃，真空度为0.6mpa条件下进行浓缩干燥，及得甘草生物碱类化合物(图1(b))。
实施例2
甘草生物碱(gcswj)在hek293-m3细胞的初步药理学表征：
材料：甘草生物碱类化合物按上述方法制备；hek293-m3细胞购于中国科学院上海细胞库；莨菪碱、carb购于sigma公司。检测平台为fliprflipr高通量细胞水平筛选系统，美国美谷分子公司，检测的信号为相对荧光值(relativefluorescentunit，rfu)。卡巴胆碱(carbachol)，莨菪碱(scopolamine)(均购买于tci)。
对甘草生物碱类化合物进行了m3受体活性筛选；我们利用了稳定表达m3受体的hek-293细胞系，在96孔板中接种稳定表达m3受体的hek-293细胞，80,000细胞/孔，37℃细胞培养箱培养过夜，加入calcium-6dyeloading2小时，以激动剂卡巴胆碱(carbachol)5nm，以拮抗剂莨菪碱(scopolamine)1μm作为对照，用lipr检测钙流，检测甘草生物碱的活性，结果如图2(a)所示：甘草生物碱在200μm浓度下，在m3受体上有明显的激动活性，并且在拮抗剂活性检测时，有效抑制了carbachol的活性。这很有可能是甘草生物碱的特异性激动活性而产生的脱敏效应。为了进一步确定甘草生物碱在m3受体的激动活性，我们将甘草生物碱浓度降低到50μm检测活性，并且用scopolamine进行拮抗，结果如图2(b)所示：甘草生物碱在50μm浓度下在m3受体仍具有明显的激动活性，并且可以被m3受体拮抗剂scopolamine抑制。
甘草可被用于治疗肌肉痉挛和肿胀、风湿性关节炎、咳嗽、哮喘和其他胸部感染和增加胆汁。已确定五种类型的毒蕈碱受体(m1-m5)广泛分布在平滑肌和胃肠道细胞膜表面。毒蕈碱受体m3在收缩中的作用大于m2的作用。有研究表明甘草生物碱可以控制乙酰胆碱引起的兔和豚鼠回肠收缩。这些暗示着甘草生物碱在毒蕈碱受体的潜在活性。实验结果表明，甘草生物碱在m3受体上具有激动活性且可以发生脱敏反应以及被东莨菪碱抑制，表明其在m3受体上具有特异性的激动活性。
该方法首次实现了甘草中生物碱类化合物的制备，并进行了活性筛选实验，结果表明了甘草生物碱类化合物作用于m3受体。而，目前研究表明，m3受体与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合征、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，据此说明甘草生物碱具有一定的临床应用。为该类化合物生物的制备、活性研究和新药研发的深入研究提供技术支撑。
1.一种甘草中生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：
1)原料处理：甘草根阴干至含水量为3-8％后，粉碎，过20～80目筛，得药粉，备用；
2)甘草提取物的制备：30％～95％醇-水溶液作提取溶剂，浸泡，回流提取法进行甘草样品的提取，经过滤，浓缩，得甘草提取液；
3)甘草生物碱类化合物的制备：将得到的甘草提取液经液液萃取处理，得到甘草生物碱类化合物；
4)以甘草生物碱类化合物为活性成分，研究了m受体活性及其用途。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中醇-水溶液的质量为甘草药材粉5-30倍，回流提取1-5次，每次回流提取时间为1-6小时，合并提取液、抽滤，得到样品溶液，经浓缩得到甘草提取液。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的醇-水溶液为甲醇-水、乙醇-水、正丁醇-水或异丙醇水中的任一种，其中醇和水的比例为30％-95％(v:v)。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的甘草生物碱类化合物的液液萃取方法为：样品量为5g～1000g，用50ml～5000ml的磷酸、硫酸、或盐酸-水溶液溶解，ph值保持在1-4，用50ml-5000ml的有机溶剂进行萃取1～6次；碱沉，采用0.2-2mol/l的氢氧化钠、0.2-2mol/l氢氧化钾、或氨水进行调节，ph值保持在8-12，之后，用0.5-5倍体积的有机溶剂进行萃取1-6次，得到萃取溶液。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷中的任一种。
6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：将得到的萃取溶液用旋转蒸浓缩、或离心浓缩进行浓缩，即得甘草生物碱类化合物粗碱，浓缩过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-1000pa。
7.按照权利要求1-6任一制备方法得到的甘草生物碱类化合物的用途，其特征在于：所述的甘草生物碱类化合物作用于m受体，所述的m受体可能是m1,m2,或m3中的任一种或多种。
技术总结