本发明涉及一种具有抗病毒活性的中药提取物，具体地说涉及白鲜皮中抗病毒活性部位、制备方法、含量测定及其应用。
背景技术：
流感不仅给人类和动物的健康带来极大的威胁，同时也造成巨大的经济损失及社会秩序的扰乱。季节性流感每年可引发300万到500万例重症，导致25万到50万人死亡。流感病毒可分为甲、乙、丙三种类型，甲型流感病毒是引起人的季节性流感的主要影响因素，同时它也能感染包括家禽、猪、马在内的多种动物。甲型流感病毒可根据其表面血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)抗原结构的不同分成很多亚型。至今发现不同的ha亚型有18种，其中h1和h3要引起人类的大多数流感，而na亚型有11种，目前在人类流感中主要的亚型是n1、n2和n9。
目前对于流感病毒的主要防治措施是接种疫苗，但是疫苗本身具有一定的局限性：免疫接种率低，很难产生有效的群体免疫；对高危人群很难产生有效的免疫力；并且由于流感病毒易突变，所以在新突变的病毒快速流行的早期较难在短时间内生产出相应的疫苗。因此，抗病毒药物在流感的预防和治疗中具有重要作用。
中药具有多成分、多环节的作用特点，不仅具有直接抗病毒作用，还能调节病毒引起免疫病理损伤的复杂过程，在流感的治疗中具有独特的优势。我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗抗病毒药物、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗病毒疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。
白鲜皮白鲜皮，别名：白藓皮、八股牛、山牡丹、羊鲜草，为芸香科多年生草本植物白鲜和狭叶白鲜的根皮。主产于辽宁、河北、四川、江苏等地。主要成分：白鲜内酯、黄柏酮酸、胡芦巴碱、胆碱、白鲜碱、黄柏酮、崖椒碱、前黄柏酮、异斑沸林草碱、柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、菜油甾醇、梣皮酮以及谷甾醇、酸性物质和皂甙等。
功能主治：1，清热解毒，除湿止痒：用于湿热疮疹，多脓或黄水淋漓，肌肤湿烂，皮肤瘙痒及风疹疥癣。2，清热解毒除湿：用于治湿热黄疸及湿热痹证。
技术实现要素：
本发明旨在对白鲜皮抗病毒作用进行研究，进而发现白鲜皮抗病毒作用的活性部位，并对白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法进行优化，得到具有较好抗病毒活性的部位，并对该抗病毒活性部位的主成分进行了含量测定。
有鉴于此，本发明提供了一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
进一步的，该活性部位总柠檬苦素类含量为80％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
本发明提供了还提供了所述的活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
进一步的，该活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
本发明提供了还提供了所述一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包含以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入6～10倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入6～10倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用1～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～6倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段5-15分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位。
具体的，除杂步骤中大孔树脂柱型号可以是dh101、dm-130、ab-8。
本发明提供了还提供了一种白鲜皮中抗病毒活性部位的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品制备：精密称取10.0mg白鲜皮中抗病毒活性部位，用色谱纯甲醇溶解且定容至10ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到白鲜皮抗病毒活性部位供试品；
(2)：对照品溶液制备：精密称定经干燥过的柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮对照品各5.0mg，置10ml的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成白鲜皮柠檬苦素类混合对照品储备液，-4℃冰箱放置，备用。
(3)：对步骤(1)制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以步骤(2)制备柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮对照品进行含量测定；hplc条件为：色谱柱填料为aglientc18，规格为250mm×4.6mm5μm，波长为210nm，流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱为：0-30min，甲醇相从10％升为65％，30-35min，甲醇相保持65％，35-40min，甲醇相从65％升为95％，40-60min，甲醇相95％等度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃。
本发明的有益效果为：1.本发明的提取分离工艺能有效地除去低极性的杂质，提高有效成分的含量，能快速准确的得到有效成分。2.本发明提供的白鲜皮有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。3.本发明提供的方法从白鲜皮药材中得到含柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮等柠檬苦素类化合物部位，并首次对其的抗病毒药效进行了筛选，成分确切，含量明确，制备工艺便捷，活性好，适宜开发成抗病毒中药新药。
附图说明
图1为本发明白鲜皮纯化步骤75％的乙醇水溶液洗脱部位制备液相图谱；
图2为本发明白鲜皮抗病毒活性部位的hplc分析图；其中，1:柠檬苦素；2:前黄柏酮3：黄柏酮4:梣酮5：梣皮酮。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种白鲜皮中抗病毒活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用。以下将结合实施例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为80％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
一种白鲜皮抗病毒活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
如图1所示，一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入10倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入10倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:1的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用2倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用6倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。所用大孔树脂型号为dh101。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-13分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位，其白鲜皮柠檬苦素类化合物总含量为82.1％，液相图谱见图1。
实施例2
一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
一种白鲜皮抗病毒活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入6倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入8倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用1倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用6倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。所用大孔树脂型号为ab-8。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-13分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位。其白鲜皮柠檬苦素类化合物总含量为76.8％。
实施例3
一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
一种白鲜皮抗病毒活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入6倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入6倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1倍柱体积的体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。所用大孔树脂型号为dm-130。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段5-15分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位，其白鲜皮柠檬苦素类化合物总含量为56.3％。
实施例4
一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
一种白鲜皮抗病毒活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入8倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入8倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:15的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用2倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用3倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。具体的，除杂步骤中大孔树脂柱型号可以是dh101。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7-15分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位，其白鲜皮柠檬苦素类化合物总含量为63.4％。
实施例5
一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
一种白鲜皮抗病毒活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入10倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入8倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用2倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用4倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。具体的，除杂步骤中大孔树脂柱型号可以是ab-8。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段5-15分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位，其白鲜皮柠檬苦素类化合物总含量为71.3％。
实施例6
一种白鲜皮抗病毒活性部位，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
一种白鲜皮抗病毒活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入8倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入8倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:1的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用4倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用5倍柱体积的体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。具体的，除杂步骤中大孔树脂柱型号可以是dm-130。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段5-15分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位，其白鲜皮柠檬苦素类化合物总含量为65.9％。
可见，上述提取物的制备方法，其工艺简单，采用有机溶剂充分提取后进行除杂与纯化，易于操作，质量可控，易重现，得到的白鲜皮抗病毒活性部位中总柠檬苦素类含量在50％以上，最高能达到82.1％％。
白鲜皮抗病毒活性部位中柠檬苦素类成分及主成分的含量测定方法
1.仪器与试剂
uv-300型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；恒温水浴锅，电子分析天平，柠檬苦素对照品，四川维克奇生物科技有限公司；对-二甲氨基苯甲醛，南京化学试剂有限公司；硫酸，南京化学试剂有限公司；95％乙醇、无水乙醇，南京化学试剂有限公司；三氯化铁，南京化学试剂有限公司。
2.柠檬苦素类物质的含量测定
2.1溶液配制：
2.1.1对照品溶液的制备
精密称取柠檬苦素对照品8.119mg于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.2供试品溶液的制备
称取一定量白鲜皮抗病毒活性部位粉末加6倍量50％乙醇于60℃水浴提取2h，抽滤，滤液浓缩，备用。
显色剂a液：称取对-二甲氨基苯甲醛125mg溶于100ml的65％硫酸乙醇溶液中，放冷，备用。
显色剂b液：取三氯化铁0.9g加水溶解并定容于100ml量瓶中。
3.最大吸收波长及标准曲线确定
精密量取对照品溶液0.4ml，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min，另取供试品溶液1ml，同法操作。进行全波长扫描，对照品和供试品吸收曲线均在500nm处有最大吸收，故本实验用500nm作为测定波长。
在6支试管中分别加入柠檬苦素对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min，于500nm处测定吸光度(a)，以a为横坐标，质量浓度(c)为纵坐标，得回归方程c＝0.803a-0.0003(r＝0.9996)，对照品溶液在0.08119～0.48714mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。
4.供试品溶液的制备
取上述各实施例所得的白鲜皮抗病毒活性部位待测成分适量，精密称定，50％乙醇于60℃水浴提取2h，抽滤，滤液浓缩，转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度线。
5.纯度测定方法
精密吸取供试品溶液1ml，精密量取对照品溶液0.4ml，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min。于500nm下测定吸光度，根据标准曲线计算得出样品中柠檬苦素类化合物的总含量。
6.测定方法考察
精密度考察：精密吸取2项下制得的对照品溶液0.4ml，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min。摇匀后于500nm处重复测定5次，记录吸光度值，计算rsd值。结果rsd为0.89％，表明仪器精密度良好。
稳定性考察：精密吸取2项下制得的对照品溶液0.4ml，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min。分别于0，15，30，60，120min在500nm下进行测定，记录吸光度值，计算rsd值。结果rsd为1.54％，表明供试品溶液在2h内稳定性良好。
重复性考察：精密称取制备例2所得白鲜皮活性部位5份，溶解后转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度线，精密吸取1ml供试品溶液，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min。于500nm下测定吸光度，计算rsd。结果总柠檬苦素平均含量为76.8％，rsd为1.05％，表明本方法重现性良好。
加样回收率考察：采用加样回收法，精密称取精密称取制备例2所得白鲜皮活性部位5份，分别按照1∶0.8，1∶1.0，1∶1.2加入柠檬苦素对照品，加无水乙醇稀释至2ml，加入显色剂a5ml和显色剂b0.5ml，静置30min，于500nm下测定吸光度。
该法专属性好，空白溶剂在500nm下对白鲜皮中的柠檬苦素类成分吸光度无干扰；在0.08119～0.48714mg/ml范围内线性关系良好，相关系数大于0.999；回收率良好，在98％～102％之间，rsd值低于2.0％；精密度符合规定，rsd小于1％；溶液在2h内稳定性好，供试品溶液与对照品溶液于室温下放置2h，吸光度均无明显变化。
白鲜皮抗病毒活性部位主要成分含量测定方法
1溶液的制备
1.1混合对照品溶液
分别精密称取对照品，置50ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为柠檬苦素0.2013mg/ml、黄柏酮0.1502mg/ml、梣酮0.1002mg/ml、梣皮酮0.1012mg/ml和前黄柏酮0.2009mg/ml的混合对照品溶液,备用。
1.2供试品溶液
取白鲜皮抗病毒活性部位10mg,精密称定,用甲醇溶解并定容到10ml量瓶中,摇匀，微孔滤膜滤过后,取续滤液为供试品溶液。
2色谱条件系统适用性试验
色谱柱:diamonsilc18柱(200mm×4.6mm),流动相：甲醇-水,按以下梯度，流速:1.0mlmin·-1,检测波长:210nm,进样量:10μl。
在此条件下以柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮计,理论塔板数不低于3000,且柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮、前黄柏酮与其他峰达到基线分离，色谱图见图2：
3线性关系考察
精密量取混合对照品溶液0.3、1.0、1.5、1.0、1.5、3.0、6.0、9.0ml分别置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制得系列对照溶液。以色谱峰面积(y)为纵坐标,以质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线并计算回归方程。
4.方法学考察
4.1精密度试验
精密吸取混合对照品溶液3.0ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。按2所述色谱条件进样测定,重复6次。柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮色谱峰面积的rsd均小于3.0％(n＝6),表明仪器精密度良好。
4.2重复性试验
取白鲜皮供试品6份,按1.2所述方法制备供试品溶液,按2所述色谱条件进样测定。柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮色谱峰面积的rsd均小于2.0％(n＝6),表明方法重复性良好。
4.3稳定性试验
取白鲜皮供试品1份,按1.2所述方法制备供试品溶液,按2所述色谱条件于12h内重复进样6次进样测定。柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮色谱峰面积的rsd均小于3.0％，表明柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮在12h内稳定。
4.4加样回收率试验
取已知含量的白鲜皮抗病毒活性部位6份各10mg,精密称定,分别加入质量浓度为80.0mg·l-1和240.0mg·l-1对照品溶液1、1.3、1.6ml,用甲醇稀释至刻度，摇匀，制备低、中、高3种质量浓度的供试溶液,每个质量浓度制备3份样品。按1.2所述方法制备供试品溶液,按2所述色谱条件测定，计算回收率，rds值均小于3％。
5.供试品含量测定
取各制备例中白鲜皮抗病毒活性部位10mg,精密称定,用甲醇溶解并定容至10ml，按3所述条方法操作,在2所述色谱条件下测定,计算5种柠檬苦素类的含量，测定结果见下表。
表1：制备例中5种柠檬苦素类的含量测定
白鲜皮抗病毒活性部位的活性检测
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。
实验一：白鲜皮活性部位细胞毒性实验
1.实验材料
白鲜皮抗病毒活性有效部位：样品1(制备例1的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为82.1％)；样品2(制备例2的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为76.8％)；样品3(制备例3的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为56.3％)；样品4(制备例4的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为63.4％)；样品5(制备例5的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为71.3％)；样品6(制备例6的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为65.9％)。狗肾细胞系mdck，来源于atcc，中国科学院武汉病毒研究所传代保存。
仪器：co2培养箱，美国thermofisherscientific；酶标仪，moleculardevices；生物安全柜，购自healforce公司。
2.实验原理及方法
2.1样品对mdck细胞的毒性检测
实验原理：实验采用alamar
样品分组：样品1(制备例1的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为82.1％)；样品2(制备例2的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为76.8％)；样品3(制备例3的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为56.3％)；样品4(制备例4的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为63.4％)；样品5(制备例5的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为71.3％)；样品6(制备例6的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为65.9％)。
实验步骤：将mdck细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。药物用dmem培养基从2倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度。将药物加入到细胞中，于37℃的co2培养箱中培养。加药培养24h后，显微镜下观察药物引起的细胞病变效应(cpe)，加入alamarblue检测细胞存活率。药物对细胞的毒性的大小与细胞的活性呈反比，并以细胞活性来反映。
计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)*100
表2白鲜皮柠檬苦素细胞毒性实验数据
结果如表1所示，在250μg/ml浓度下各样品组均对mdck细胞无细胞毒性。
实验二：白鲜皮活性部位体外抗甲型流感病毒h3n2活性实验
1.实验材料
白鲜皮抗病毒活性有效部位：样品1(制备例1的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为82.1％)；样品2(制备例2的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为76.8％)；样品3(制备例3的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为56.3％)；样品4(制备例4的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为63.4％)；样品5(制备例5的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为71.3％)；样品6(制备例6的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为65.9％)。
病毒株：甲型流感病毒(h3n2，a/hongkong/498/97)，由中国科学院武汉病毒研究所扩增保存。
培养条件：dmem 10％胎牛血清、37℃、5％co2。
仪器：co2培养箱，美国thermofisherscientific；酶标仪，moleculardevices；生物安全柜，购自healforce公司。
2.样品的抗h3n2活性检测
实验原理：由于流感病毒的结构蛋白的表达水平与病毒的复制成正比，实验通过测定流感病毒蛋白表达水平来反映病毒的复制水平。本实验室采用灵敏度高的试剂，检测荧光强度的变化，反应流感病毒蛋白的表达。
样品分组：组1(制备例1的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为82.1％)；组2(制备例2的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为76.8％)；组3(制备例3的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为56.3％)；组4(制备例4的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为63.4％)；组5(制备例5的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为71.3％)；组6(制备例6的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为65.9％)。组7为阳性药ribavirin。上述各分组初始浓度均为160μg/ml。
方法步骤：实验同时设空白对照孔(正常细胞)，病毒对照孔(病毒感染后未加药物)，阳性药物对照孔(感染后加利巴韦林)，根据细胞毒性实验的结果，在浓度为250μg/ml以内时，药物对细胞无毒性。
mdck细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养过夜后备用。mdck细胞用pbs洗两遍后，同时加入流感病毒液及逐级稀释浓度的药物。置于37℃细胞培养箱培养24h后，显微镜观察细胞病变(cpe)；取培养液上清检测病毒蛋白表达水平。
抑制率(％)＝100-(样品孔-空白对照)/(病毒对照-空白对照)*1003.样品抗h3n2活性检测结果
阳性药物利巴韦林及样品对流感病毒h3n2的具体抑制作用和对mdck细胞的毒性结果下。
表3样品对流感病毒h3n2的抑制作用和细胞毒性
在此次实验中通过检测流感病毒的复制水平，结果表明阳性药物利巴韦林对流感病毒h3n2有很强的呈剂量依赖的抑制作用，引起50％抑制效应的浓度ec50约为21.992μg/ml。受检测样品白鲜皮活性部位对流感病毒h3n2有抗病毒活性，含量为82.1％的白鲜皮活性部位在250μg/ml浓度下对mdck无毒性，对h3n2的ec50约为18.818μg/ml，其抗病毒活性优于阳性药利巴韦林。该实验结果表明白鲜皮活性部位对流感病毒h3n2具有很好的抑制作用，并且随着白鲜皮活性部位中总柠檬苦素的含量增加，其对流感病毒的抑制作用明显提高，表明总柠檬苦素为白鲜皮中抗病毒的主要活性物质。
实验三：白鲜皮活性部位体外抗甲型流感病毒h1n1活性实验
1、实验材料
白鲜皮抗病毒活性有效部位：样品1(制备例1的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为82.1％)；样品2(制备例2的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为76.8％)；样品3(制备例3的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为56.3％)；样品4(制备例4的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为63.4％)；样品5(制备例5的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为71.3％)；样品6(制备例6的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为65.9％)。
病毒株：甲型流感病毒(h1n1，a/puertorico/8/1934)，由中国科学院武汉病毒研究所扩增保存。
培养条件：dmem 10％胎牛血清、37℃、5％co2。
2.样品的抗h1n1活性检测
实验原理：由于流感病毒的结构蛋白的表达水平与病毒的复制成正比，实验通过测定流感病毒蛋白表达水平来反映病毒的复制水平。本实验室采用灵敏度高的试剂，检测荧光强度的变化，反应流感病毒蛋白的表达。
样品分组：组1(制备例1的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为82.1％)；组2(制备例2的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为76.8％)；组3(制备例3的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为56.3％)；组4(制备例4的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为63.4％)；组5(制备例5的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为71.3％)；组6(制备例6的制备方法所得，白鲜皮总柠檬苦素含量为65.9％)。组7为阳性药ribavirin。上述各分组初始浓度均为160μg/ml。
方法步骤：mdck细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养过夜后备用。mdck细胞中同时加入药物及流感病毒液。置于37℃细胞培养箱培养24h后，显微镜观察细胞病变(cpe)；取培养液上清检测病毒蛋白表达水平。
实验设空白对照孔(正常细胞)，病毒对照孔(病毒感染后未加药物)，阳性药物对照孔(感染后加利巴韦林)。
抑制率(％)＝100-(样品孔-空白对照)/(病毒对照-空白对照)*100
3.样品抗h1n1活性检测结果
阳性药物利巴韦林及样品对流感病毒h1n1的具体抑制作用和对mdck细胞的毒性结果如下所示：
表4样品对流感病毒h1n1的抑制作用和细胞毒性
在此次实验中通过检测流感病毒的复制水平，结果表明阳性药物利巴韦林对流感病毒h1n1有很强的呈剂量依赖的抑制作用，引起50％抑制效应的浓度ec50约为25.887μg/ml。受检测样品含量为82.1％的白鲜皮活性部位对流感病毒h1n1有抗病毒活性，在250μg/ml浓度下对mdck无毒性，对h1n1的ec50约为27.367μg/ml，其抗病毒活性与利巴韦林组相当。该实验结果表明白鲜皮活性部位对流感病毒h3n2具有很好的抑制作用，并且随着白鲜皮活性部位中总柠檬苦素的含量增加，其对流感病毒的抑制作用明显提高，表明总柠檬苦素为白鲜皮中抗病毒的主要活性物质。
基于以上药效试验可知，该方法获得的白鲜皮活性部位有非常好的抗病毒效果，总柠檬苦素含量越高，其抗病毒效果越强，显示出白鲜皮柠檬苦素类物质有较强的抗病毒活性，其中，白鲜皮活性部位中的总柠檬苦素含量在80％以上时，其抗病毒活性高于或与利巴韦林组相当。提示了本发明制备的白鲜皮活性部位可以用于制备抗病毒药物，尤其是用于制备抗流感病毒的药物。
包含白鲜皮抗病毒活性部位的组合物制备
片剂
取白鲜皮抗病毒活性部位10.5g，研成细粉，加入10％淀粉糊约8g，药用淀粉7g，微粉硅胶0.8g，混合，14目筛制粒，于80℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁0.05g，混匀，压制成100片，即得。每片重0.2g，口服，每次1片，一日三次。
硬胶囊
取白鲜皮抗病毒活性部位15.5g，研成细粉，药用淀粉3.5g，硬脂酸镁0.01g，混合均匀，过筛，装入胶囊，制成100粒，即得。每粒内容物重0.2g，口服，每次1粒，一日两次。
软胶囊
取白鲜皮抗病毒活性部位10.5g，加入丙二醇0.2g，卵磷脂0.9g，大豆油18g，振动磨超微20分钟，使混匀，制成软胶囊100粒，即得。每粒内容物重0.3g，口服，每次1粒，一日三次。
颗粒剂
取白鲜皮抗病毒活性部位15.5g，研成细粉，加入糊精25g，乳糖458g，混合均匀，制粒，于80℃干燥，整粒，分装，制100包，即得。每包重5g，口服，每次1包，一日两次。
缓释片
取白鲜皮抗病毒活性部位25.5g，研成细粉，过100目筛，hpmc10.3g，乳糖16g，十二烷基硫酸钠1g，过100目筛，混合均匀，加入2％聚维酮(95％乙醇)黏合剂制软材，过20目筛制粒，于50℃干燥，过18目筛整粒，干颗粒采用外加法加入2％硬脂酸镁，混匀，压片，制成缓释片100片，即得。每片重0.5g。口服，每次1片，一日一次。
滴丸
取白鲜皮抗病毒活性部位10.5g，研成细粉，另取24.8g聚乙二醇4000加热熔融，加入白鲜皮抗病毒活性部位，振动磨超微20分钟，使混合均匀，滴制成滴丸，即得。每丸重0.35g，口服，每次1粒，一日三次。
注射剂
取上白鲜皮抗病毒活性部位10.5g，研成细粉，加入β环糊精4.5g，蔗糖500g，纯水适量(约390g)搅拌加热溶解，煮沸10分钟，稍冷后加入10％(w/v)尼泊金乙酯乙醇溶液搅匀，用水调整至100ml，过滤，分装，灭菌，即得。每支10ml。口服，每次1支，一日三次。
需要指出的是，上述包含白鲜皮有效部位的药物组合物，可根据药剂学领域的常用辅料，根据剂型和实际情况进行恰当选择，例如常见的辅料有淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油等；制备所需药物的各种剂型时，可以按照药剂学领域的常规生产方法制备，如将该化合物与一种或多种载体混合，然后制成相应的剂型。作为优选，所述药物制剂的剂型包括注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂与合剂等等。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种白鲜皮抗病毒活性部位，其特征在于，该活性部位总柠檬苦素类含量为50％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
2.根据权利要求1所述的活性部位，其特征在于，该活性部位总柠檬苦素类含量为80％以上，并含有柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮。
3.根据权利要求1-2任一项所述的活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的活性部位，其特征在于，该活性部位在制备抗病毒药物中的应用。
5.根据权利要求1-2任一项所述一种白鲜皮抗病毒活性部位的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入6～10倍量石油醚，于70℃水浴回流提取2次，每次1h，合并滤液。过滤，药渣加入6～10倍量二氯甲烷，于85℃水浴回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)除杂：大孔树脂柱层析，将上述提取所得浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用1～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～6倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(3)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为agilent制备柱zorbaxsb-c18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从10％升为40％，40-60min，甲醇相从40％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段5-15分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗病毒活性部位。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，除杂步骤中大孔树脂柱型号可以是dh101、dm-130、ab-8。
7.一种白鲜皮中抗病毒活性部位的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品制备：精密称取10.0mg白鲜皮中抗病毒活性部位，用色谱纯甲醇溶解且定容至10ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到白鲜皮抗病毒活性部位供试品；
(2)：对照品溶液制备：精密称定经干燥过的柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮对照品各5.0mg，置10ml的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成白鲜皮柠檬苦素类混合对照品储备液，-4℃冰箱放置，备用。
(3)：对步骤(1)制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以步骤(2)制备柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、梣皮酮和前黄柏酮对照品进行含量测定；hplc条件为：色谱柱填料为aglientc18，规格为250mm×4.6mm5μm，波长为210nm，流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱为：0-30min，甲醇相从10％升为65％，30-35min，甲醇相保持65％，35-40min，甲醇相从65％升为95％，40-60min，甲醇相95％等度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃。
技术总结