本发明属于微生物学与免疫学领域，具体涉及rhtsg-6在鸡胚-h2n9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用。
背景技术：
肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumornecrosisfactor-αstimulatedgene6，tsg-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白。大量研究表明，tsg-6是一种效果明显的抗炎因子，在肝炎、关节炎、视网膜炎、组织损伤、瘢痕疙瘩等炎症过程中，tsg-6均能够抑制炎症因子tnf-α、il-1β、il-6等的表达，并且具有抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。在机体遭受感染、创伤等侵害时，适度的炎症反应会有利于机体清除病原体，修复损伤。虽然tsg-6的研究及其生物学功能得到日益重视，但至今尚未见到该重组蛋白在鸡胚-h2n9亚型禽流感病毒血凝试验模型体系上检测其具有抗病毒活性等报告。本发明首次发现，重组人tsg-6(recombinanthumantsg-6，rhtsg-6)在体内外均具有抗病毒活性，填补了此领域的空白。
技术实现要素：
本发明公开了rhtsg-6在鸡胚-h2n9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用，h9n2亚型禽流感病毒主要通过其表面的血凝素蛋白感染宿主易感细胞；而血凝素蛋白可以与脊椎动物红细胞表面的唾液酸受体结合，从而使红细胞之间发生凝集，此现象称为血凝反应(hemagglutinationassay，ha)。当与一定量的特异性抗体与病毒预先处理后，病毒表面的血凝素蛋白被特异的抗体封闭，便失去ha活性，此种现象称之为血凝抑制(hemagglutinationinhibitionassay，hi)现象。
依据此原理，本发明发现，rhtsg-6在鸡胚-h2n9亚型禽流感病毒血凝体系上具有与特异性抗体类似的抗病毒活性现象，即能抑制h9n2亚型禽流感病毒在鸡胚尿囊中的复制增殖。此活性可以一定量的rhtsg-6能使h9n2亚型禽流感病毒血凝现象被抑制的程度(半数抑制或全抑制)作为检测其活性的结果，即以每毫升rhtsg-6检品的最高稀释度仍能保护半数鸡胚(50％)免受病毒的攻击使之出现hi现象的稀释度的倒数定为rhtsg-6单位(或称效价)，常以单位(u)表示。该结果经hi现象观察后，按reed-muench公式计算出所测rhtsg-6抗病毒活性的效价，约为1.0×103u～1.0×105u/ml/ml；通过spss16.0对各组鸡胚尿囊液中被抑制病毒增殖的数据进行统计分析，结果如图5所示。从图5中可以看出，相比病毒对照组和阴性对照组，rhtsg-6各组的ha效价有明显下降，随着rhtsg-6浓度下降，ha效价下降幅度随之降低，则判断rhtsg-6具有明显抗病毒效果，同时低剂量组、中剂量、较高剂量和高剂量组均表现出非常显著的抑制病毒增殖效力(p<0.01)。该方法能准确客观地观察与检测rhtsg-6抗病毒活性，填补了相关领域空白。
本发明采取的技术方案为：
本发明提供了重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6在抗h9n2亚型禽流感病毒药物中的应用。通过鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系，rhtsg-6能有效抑制h9n2亚型禽流感病毒在鸡胚中的增殖，可明显降低鸡胚尿囊液中h9n2病毒的血凝效价。验证了rhtsg-6具有抗病毒的作用。
本法还提供了一种检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的血凝抑制体系，所述血凝抑制体系为重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6/鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝抑制体系。
本发明还提供了基于重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6/鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝抑制体系检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，所述方法以9～10日龄鸡胚作为测试载体，h9n2亚型禽流感病毒作为攻击病毒。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
(1)鸡胚处理；
(2)将rhtsg-6稀释至不同浓度分别接种于步骤(1)的鸡胚尿囊腔内，然后再在相同部位接种100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液于各试验组各相应鸡胚尿囊腔内，并设置阴性对照组、病毒对照组和rhtsg-6阳性血清对照组；
(3)将接种后的各组鸡胚进行孵育，孵育72h后收集各组鸡胚的尿囊液，分别测定各组鸡胚中尿囊液的ha效价，同时利用rhtsg-6阳性血清进行血凝抑制(hi)试验，记录并统计结果。
进一步地，所述步骤(1)具体包括：取9～10日龄的spf鸡胚，暗室里用检卵灯照射鸡胚表面，观察鸡胚存活状态，去除已死亡的鸡胚；用铅笔或蜡笔在血管分布较少处的气室线进行标记，并在气室线上方约0.3cm处标记作为注射点。
步骤(2)中，rhtsg-6稀释后的浓度分别为105u/ml、104u/ml、103u/ml、102u/ml，各浓度的接种剂量均为0.1ml/胚。
步骤(2)中，所述100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液的使用量为0.1ml/胚。
步骤(2)中，阴性对照组为鸡胚中接种无菌pbs缓冲液；病毒对照组为鸡胚中接种0.1ml/胚100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液。
步骤(3)中，所述孵育的温度为34～38℃。
本发明提供的基于鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系检测rhtsg-6抗病毒活性的方法，现象显著易观察、能最大程度降低主观评判带来的误差；检测的rhtsg-6能通过明显抗病毒活性而被检测到，检测的rhtsg-6生物学活性高、敏感性强、更能反映rhtsg-6的试剂抗病毒活性。
本发明提供的方法对观察与检测rhtsg-6抗病毒活性结果显示，rhtsg-6可抑制鸡胚尿囊中h2n9亚型禽流感病毒的复制增殖，发生血凝现象降低或全无现象。以此为评价结果的标准，可使不同批次测定的rhtsg-6蛋白效价检测结果更为可靠可信。该方法结果明确，重复性及准确度均高。经本方法验证，rhtsg-6抗h2n9亚型禽流感病毒的效价高达约为1.0×103～1.0×105u/ml以上。填补了相关领域空白。
附图说明
图1为westernblot鉴定rhtsg-6蛋白结果；其中m为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为rhtsg-6样品；
图2为实施例1中的rhtsg-6抗病毒活性的检测方法操作流程图；
图3为实施例2中的基于鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系检测rhtsg-6抗病毒活性的特异性微量ha试验的流程图；
图4为不同剂量rhtsg-6组鸡胚尿囊液中h9n2hi滴定结果，其中试验孔的尿囊液从第1孔往第9孔稀释，每个稀释度设置相应复孔；第10孔为病毒对照；第11孔为阳性对照组(即加有rhtsg-6抗血清)；第12孔为阴性对照组(即无rhtsg-6)鸡胚尿囊液；
图5为不同剂量组的rhtsg-6与相应抗血清先等量混匀置37℃孵育1h后再接种于鸡胚的各尿囊液h9n2ha滴定结果；其中试验孔的尿囊液从第1孔往第6孔稀释，每个稀释度设置相应复孔；第7～8孔为病毒对照孔；第9～10孔为rhtsg-6阳性对照孔；第11孔为阴性血清对照(即无rhtsg-6抗血清)；第12孔为阴性对照鸡胚尿囊液；
图6为各组鸡胚尿囊液中h9n2亚型禽流感病毒ha效价比较结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明中rhtsg-6冻干粉针剂为参照下述的方法自制(批号：20180924)，经鸡胚-h9n2亚型禽流感病毒系列检测效价为1.0×105u/ml；h9n2亚型禽流感病毒及阳性血清由扬州大学兽医学院惠赠。
rhtsg-6冻干粉针剂的制备方法如下：
(1)对根据genebank中已报道的如sequencelisting400〈1〉所示的重组人tsg-6基因进行密码子优化，使用化学合成的方法获得如sequencelisting400〈2〉所示重组人tsg-6基因，优化前密码子适应指数(cai)为0.73，优化后cai为0.97。
(2)将步骤(1)所得的重组人tsg-6基因亚克隆至pet-32a表达载体中并转化至bl21大肠杆菌中，涂布含氨苄青霉素的lb平板培养过夜，挑取lb平板上单菌落进行pcr及bamhⅰ和hindⅲ双酶切鉴定，阳性即表示该表达载体构建成功，得到重组人tsg-6重组菌；pcr扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳1号泳道在800bp附近出现单一条带；
pcr鉴定引物为：
f1：ggatcctggggttttaaagatggc(bamhⅰ)；
r1：aagcttttacagatgactaaagcgac(hindⅲ)。
(3)挑取重组人tsg-6重组菌于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中震荡培养，后在含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中放大培养2～3h后，测od值在0.6-0.8时，加入终浓度1.0mmiptg，30℃诱导表达5h，收集菌体；经sds-page电泳分析，经iptg诱导表达5h后的菌体蛋白在45.0kd处可见优势表达条带，表达量达到60％；经westernblot鉴定，经iptg诱导表达5h后的菌体蛋白能与兔抗人tsg-6多克隆抗体发生特异性反应，在45kd左右处出现特异性条带，且特异性高；
(4)将步骤(3)收集的菌体，使用200ml的pbs重悬菌体，4℃超声破碎细菌沉淀，超声的条件为：功率：400w，工作3s，间隔3s，超声6min，重复3～4次；12000r/min离心20min分离上清和沉淀，分离出的包涵体沉淀经过含、洗涤、变性和复性，复性产物即为重组人tsg-6蛋白粗制品。分别取沉淀和上清及菌体经sds-page电泳检测。经sds-page电泳分析，该重组蛋白为包涵体表达。
所述洗涤、变性和复性的方法为：
①洗涤：使用洗涤缓冲液(50mmol/ltris，100mmol/lnacl，2mol/l尿素，1mmol/ledta，0.5％tritonx-100，ph为8.0)以1∶20的湿重体积比对包涵体(10g)进行重悬，洗涤2h，12000r/min离心20min取沉淀，再重复洗涤一次；
②变性：称量洗涤后沉淀湿重(4.8g)，再用溶解缓冲液(50mmol/ltris，100mmol/lnacl，7mol/l盐酸胍，0.1％β-巯基乙醇，ph为8.45)以1∶50的湿重体积比重悬沉淀(240ml)，置于磁力搅拌器上过夜，充分溶解；
③稀释复性：配制复性缓冲液(50mmol/ltris，100mmol/lnacl，1mmol/lgsh，0.2mmol/lgssg，ph8.0)进行复性。取溶解后的蛋白溶液，12000r/min离心20min取上清，加入等体积的复性缓冲液(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h；再加入复性缓冲液稀释至原体积的4倍(加500ml复性缓冲液)，4℃静置3h；最后加入复性缓冲液稀释至原体积的5倍(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h。
(5)重组人tsg-6蛋白粗制品过滤处理后过his-tag亲和层析柱，用elutionbuffer(50mmtris-cl、500mm咪唑ph8.0)梯度洗脱，收集显示出重组人tsg-6蛋白紫外吸收峰的蛋白，置于10倍体积的tris-hcl缓冲液中4℃透析6h以上，透析两次去除高浓度咪唑，调节ph至5.0，使用1mnacl洗脱液过阴离子交换层析柱收集流穿液即为重组人tsg-6蛋白纯品，经sds-page检测，制备的目的蛋白纯度达到90％以上。通过特异性单克隆抗体进行westernblot鉴定，结果如图1所示。
(6)将步骤(5)得到的重组人tsg-6蛋白纯品与冻干保护剂按照1∶1等体积混合后，经冷冻干燥，即可得到所述rhtsg-6冻干粉针剂，其规格为40μg/支(即每支重组人tsg-6蛋白标准品中含有rhtsg-6完全抗原的量为40μg)；所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖的pbs混合液，三者在10mmol/lpbs缓冲液中的终浓度为甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。
实施例1
基于重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6/鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，包括以下步骤：
(1)鸡胚处理
将spf级10日龄鸡胚放于暗室之中，用照蛋灯从气室向下照射，可见活鸡胚血管清晰，鸡胚在其中自主运动，则为存活。若血管消失、鸡胚在多次轻微震荡后仍无活动迹象，则判定为死胚，应剔除。并用蜡笔在活鸡胚上划出气室线，在气室线避开血管处上方约0.3cm处标记注射点。随后用碘伏和酒精消毒鸡胚气室处表面，用采血针刺破注射点。
(2)分别测试rhtsg-6对鸡胚的毒性反应
将rhtsg-6从原液浓度开始进行十倍递增梯度稀释，分别设置为分为高剂量组、较高剂量组、中剂量组和低剂量组；rhtsg-6的效价分别为：105u/ml、104u/ml、103u/ml和102u/ml。将不同剂量的rhtsg-6分别接种于鸡胚尿囊腔内，每枚鸡胚接种0.1ml，每个稀释度接种4只鸡胚。同时同样设置注射等体积pbs的阴性对照组。接种后用石蜡封闭注射口，放置温箱中孵育72h。每隔12h观察一次各鸡胚是否正常存活。
阴性对照组鸡胚应全部正常存活，注射rhtsg-6的实验组如与阴性对照组一样正常存活，则判定本次实验所有剂量组浓度下的rhtsg-6对鸡胚无毒性作用。
(3)rhtsg-6抗病毒活性测试操作方法
该操作要求在ⅱ级生物安全柜内进行。具体操作流程详见图2。
即将rhtsg-6分别设置为高剂量组、较高剂量组、中剂量组和低剂量组，对rhtsg-6进行十倍递增梯度稀释至不同浓度；rhtsg-6的效价分别为：105u/ml、104u/ml、103u/ml和102u/ml。先将稀释后各组不同浓度的rhtsg-6按照每胚0.1ml剂量接种于鸡胚尿囊腔内，随后再在同一部位以每胚0.1ml剂量注射100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液。置于37℃温箱孵育72h。同时设置注入等体积pbs的阴性对照组、仅注入等体积病毒悬液的病毒对照组和注入rhtsg-6悬液做1:640稀释后与1︰512稀释后的rhtsg-6抗血清等体积混合液的阳性对照组。
将各组接种后的鸡胚常规密封针孔后，置37℃孵育。鸡胚接种后，每日检卵照室观察2次。
将已孵育72小时鸡胚放于暗室之中，用照蛋灯从气室向下照射下观察，记录各组鸡胚的存活情况，随后收获各鸡胚尿囊液进行血凝试验。首先检测“阴性对照组”和“病毒对照组”；无病毒致鸡胚尿囊液出现血凝现象异常改变的用“－”表示，若出现病毒致鸡胚尿囊液血凝现象异常改变的用“ ”表示。当病毒对照组出现病毒致鸡胚尿囊液血凝现象“ 或 ”，即病毒对照组中的鸡胚全部被感染，根据本实验室的试验结果，尿囊液血凝现象测定效价不低于1：1000，而阴性对照组中的鸡胚全部生长良好，尿囊液无血凝现象时，则表明本次实验对照系统合格，即可进行结果判定。
—尿囊液无血凝现象；此为阴性对照组结果。
尿囊液血凝现象测定结果为病毒对照组尿囊液结果的75％以上。
rhtsg-6各实验组尿囊液检测结果判断为：
尿囊液出现血凝现象，平均效价为抑制病毒对照组鸡胚尿囊液的25％以下；
尿囊液出现血凝现象，平均效价为抑制病毒对照组鸡胚尿囊液的50％以下；
尿囊液出现血凝现象，平均效价为抑制病毒对照组尿囊液的75％以下；
尿囊液血凝现象效价为抑制病毒对照组尿囊液的75％以上。
rhtsg-6效价判定以能抑制50％鸡胚尿囊液血凝现象的最高稀释度作为1个rhtsg-6单位，即以每毫升rhtsg-6检品的最高稀释度仍能保护50％鸡胚免受病毒攻击，该稀释度的倒数定为1个rhtsg-6单位(或称效价)，按reed-muench公式计算。通过reed-muench法，可通过对各试验组中h9n2亚型禽流感病毒感染鸡胚发生的hi现象程度计算出各检品中rhtsg-6效价。
(4)检测各试验组鸡胚尿囊液中的血凝抑制(hi)现象
于96孔v形微量血凝板每孔中滴加磷酸盐缓冲液(pbs)50μl，共滴2排。将各组鸡胚尿囊液1︰5稀释后加于第1列孔，每孔50μl，试验孔的尿囊液从第1孔往第9孔稀释，每个稀释度设置相应复孔；第10孔为h9n2亚型禽流感病毒对照；第11孔为特异性抗体阳性对照(即加有rhtsg-6抗血清)对照；第12孔为阴性组鸡胚尿囊液对照。于每孔加入0.5％鸡红细胞悬液50μl，轻微震荡混匀后，室温静置40min，观察结果。以出现鸡红细胞凝集完全被抑制(呈红色圆点状)的现象即为该rhtsg-6组的最大稀释度血凝抑制效价。结果详见图4。
记录并通过spss16.0对各组鸡胚尿囊液中被抑制病毒增殖的数据进行统计分析，结果如图6所示。从图6中可以看出，相比病毒对照组和阴性对照组，rhtsg-6各组的ha效价有明显下降，随着rhtsg-6浓度下降，ha效价下降幅度随之降低，则判断rhtsg-6具有明显抗病毒效果，同时低剂量组、中剂量、较高剂量和高剂量组均表现出非常显著的抑制病毒增殖效力(p<0.01)。
实施例2
基于鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系检测rhtsg-6抗病毒活性的特异性微量ha试验
所述方法的原理基于rhtsg-6具有抗病毒活性，但若将一定量的rhtsg-6重组蛋白与rhtsg-6抗血清先加在一起，混匀后置37℃温箱作用1h后再接种于各试验组鸡胚，鸡胚内的h9n2亚型禽流感病毒增殖不受影响。经鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系检测可见试验组鸡胚尿囊液出现明显的血凝(ha)现象。该试验具有高度特异性。
rhtsg-6抗血清的制备方法包括以下步骤：
(1)免疫动物的选择：选用5月龄来航公鸡、体重2～2.5kg/只、健壮无感染疾患10只，由安徽医科大学动物中心提供[syxk(皖)2017-006]，分笼饲养。
(2)免疫动物的方法：所述rhtsg-6抗血清的制备方法为，使用0.01mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)将rhtsg-6冻干粉针剂的蛋白浓度稀释至2.0mg/ml，免疫来航公鸡。首次免疫采用弗氏完全佐剂免疫1次，继之采用弗氏不完全佐剂免疫2次，后续无佐剂免疫2次。具体为每周肌注免疫1次，每次1ml，共免疫5w后，心脏抽血，离心、分离血清。
(3)收获得到的特异性抗血清免疫双扩散法检测效价应不低于1:16。对抗血清依次使用饱和硫酸铵法粗纯，再使用亲和层析法精纯获得精制rhtsg-6抗血清，过滤除菌后添加体积50％无菌甘油，-20℃备用。
基于鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝体系检测rhtsg-6抗病毒活性的特异性微量ha试验，具体操作包括以下步骤：
(1)制备rhtsg-6重组蛋白与相应抗血清混合液：将rhtsg-6悬液做1:640稀释后与1︰512稀释后的rhtsg-6抗血清等体积混匀后，置37℃温箱作用1h，得到抗血清混合液，备用。
(2)鸡胚接种：先将抗血清混合液按照每胚0.1ml剂量接种于鸡胚内，随后再以每胚0.1ml剂量注射100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液。置于37℃温箱孵育72h。同时设置仅注入等体积pbs的阴性对照组、仅注入等体积病毒悬液的病毒对照组、rhtsg-6阳性对照组及阴性血清对照组(即无rhtsg-6抗血清)。
(3)鸡胚观察：将各组接种后的鸡胚常规密封针孔后，置37℃孵育。鸡胚接种后，每日检卵照室观察2次。72h后暗室中观察鸡胚存活情况并收获鸡胚尿囊液。
(4)尿囊液的检测试验：于96孔v形微量血凝板每孔中滴加磷酸盐缓冲液(pbs)50μl，共滴2排。试验孔的尿囊液从第1孔往第6孔稀释，每个稀释度设置相应复孔；第7～8孔为病毒对照孔；第9～10孔为rhtsg-6阳性对照孔；第11孔为阴性血清对照(即无rhtsg-6抗血清)；第12孔为阴性鸡胚尿囊液。于每孔加入0.5％鸡红细胞悬液50μl，轻微震荡混匀后，室温静置40min，观察结果。
(5)结果的判读：在病毒对照孔的鸡红细胞出现完全凝集的情况下，判读该抗血清的效价，即以出现鸡红细胞完全凝集的现象即为该抗血清的最大稀释度的效价。结果详见图5。
从图5中可以看出，相比病毒对照组和阳性、阴性对照组结果，各试验组尿囊液中的rhtsg-6抗血清与等量rhtsg-6相互作用后，可使相应rhtsg-6抗病毒效果完全丧失。可以确认该现象具有高度特异性。
上述参照实施例对rhtsg-6在鸡胚-h2n9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>芜湖天明生物技术有限公司
<120>rhtsg-6在鸡胚-h2n9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用
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<213>优化前的tsg-6基因
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<213>优化后的tsg-6基因
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<213>重组人tsg-6的氨基酸序列
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1.重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6在抗h9n2亚型禽流感病毒药物中的应用。
2.一种检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的血凝抑制体系，其特征在于，所述血凝抑制体系为重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6/鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝抑制体系。
3.基于重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6/鸡胚/h9n2亚型禽流感病毒血凝抑制体系检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的方法，其特征在于，所述方法以9～10日龄鸡胚作为测试载体，h9n2亚型禽流感病毒作为攻击病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)鸡胚处理；
(2)将rhtsg-6稀释至不同浓度分别接种于步骤(1)的鸡胚尿囊腔内，然后再在相同部位接种100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液于各试验组各相应鸡胚尿囊腔内，并设置阴性对照组、病毒对照组和rhtsg-6阳性血清对照组；
(3)将接种后的各组鸡胚进行孵育，孵育72h后收集各组鸡胚的尿囊液，分别测定各组鸡胚中尿囊液的ha效价，同时利用rhtsg-6阳性血清进行血凝抑制(hi)试验，记录并统计结果。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，rhtsg-6稀释后的浓度分别为105u/ml、104u/ml、103u/ml、102u/ml，各浓度的接种剂量均为0.1ml/胚。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述100eid50h9n2亚型禽流感病毒悬液的使用量为0.1ml/胚。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育的温度为34～38℃。
技术总结