本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种能够结合并降解冠状病毒的n蛋白的多肽，以及编码该多肽的基因，利用该基因和/或蛋白抑制冠状病毒复制和繁殖，治疗冠状病毒引起的疾病的药物。
背景技术：
新发和变异的冠状病毒经常出现并引起人类和动物的呼吸道和肠粘膜感染，严重威胁人和动物的健康，例如2002年sars-cov，2010年的变异pedv，2012年mers-cov和2019年sars-cov-2(也称为2019新型冠状病毒和2019-ncov、)等。暂无特效药物或疫苗可用于治疗或预防新发和变异冠状病毒。尤其是2019年12月以来，新型冠状病毒sars-cov-2严重威胁人类的健康，给人类带来巨大的公共卫生危害。
病毒是自然界中最微小的生物体，缺乏其增殖所需要的酶系统，只能借助宿主细胞编码的蛋白完成其复制周期。绝大多数病毒复制过程可分为下列六步：吸附、侵入、脱壳、生物合成、组装和释放。病毒复制过程中的每一步，都离不开宿主细胞蛋白的参与。宿主细胞针对入侵病毒，皆会调动细胞内的蛋白拮抗病毒的复制。病毒在细胞质内的“生物合成”是宿主细胞和病毒斗争最激烈、最复杂的过程：①病毒感染细胞将激活宿主的天然免疫系统和细胞凋亡机制拮抗病毒的复制；②病毒借助自身编码的蛋白和宿主的蛋白逃避天然免疫系统和拮抗细胞凋亡。
多聚腺苷酸结合蛋白[poly(a)-bindingprotein,pabp]是一类可以与mrna3′端poly(a)结合的高度保守的蛋白质,可通过与poly(a)的结合参与mrna的翻译并调节其稳定性。pabp在脊椎动物配子发生和早期胚胎发育中也发挥重要的作用。pabpc4基因编码的pabcp4蛋白为蛋白质翻译过程中重要的蛋白之一。pabcp4蛋白是否能够调控病毒增值的蛋白，目前并不十分清楚。pabpc4作为一种蛋白翻译因子，其功能和特性目前知之甚少。
近几年来，病毒严重危害我国人民安全和养猪业的健康持续发展。如何防控sars、mers、2019新型冠状病毒、变异pedv、a型冠状病毒和pdcov等冠状病毒疫病的发生，降低其造成的损失，提供疫病治疗的有效药物和方法，是科研人员致力追求的目标。
技术实现要素：
本发明经过实验发现pabpc4蛋白能够结合并降解多种冠状病毒的n蛋白，pabpc4基因的过表达能够抑制冠状病毒的复制和繁殖，发现sp1转录因子直接调控pabpc4基因的转录，还发现pabpc4蛋白与march8和ndp52相互作用从而通过pabpc4-march8-ndp52选择性自噬途径降解冠状病毒n蛋白。
基于上述发现，为抑制冠状病毒，治疗冠状病毒引起的疾病，本发明提供如下技术方案：
一种广谱抗冠状病毒药物，其特征在于：包含pabpc4蛋白或pabpc4蛋白的衍生多肽。
所述衍生多肽具有与pabpc4蛋白类似的抗冠状病毒的功能。
进一步的，所述pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.4或seqidno.5或seqidno.6所示。
另一方面，所述pabpc4蛋白的衍生多肽包括pabpc4蛋白截短肽、或在pabpc4蛋白氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸取代、缺失或添加而产生的多肽，所述衍生多肽与seqidno.4或seqidno.5或seqidno.6所示的多肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且具有类似的抑制冠状病毒的功能。
本发明的pabpc4蛋白可以来源于人、猴、猪等多种物种，其中来源于人的pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示；来源于猴的pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示；来源于猪的pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示。
另一方面，本发明提供一种广谱抗冠状病毒的药物，其特征在于包含能提高pabpc4基因表达的制剂，所述制剂选自sp1转录调控因子或通过调控sp1从而提高pabpc4基因表达的制剂，这种制剂包括sirna、抗体等。
另一方面，本发明还提供另外一种广谱抗冠状病毒药物，其特征在于包含基于pabpc4蛋白与march8和ndp52相互作用从而通过pabpc4-march8-ndp52选择性自噬途径降解冠状病毒n蛋白的机制的活性物质。
所述活性物质选自雷帕霉素、锌和tgf-β。
本发明所述的pabpc4蛋白、pabpc4蛋白的衍生多肽、或能提高pabpc4基因表达的制剂(如sp1转录调控因子)或通过调控sp1从而提高pabpc4基因表达的制剂，或基于pabpc4蛋白与march8和ndp52相互作用从而通过pabpc4-march8-ndp52选择性自噬途径降解冠状病毒n蛋白的机制的活性物质，都可以进一步的用于制备治疗由冠状病毒引起的疾病的药物。
本发明所述的冠状病毒包括alphacoronavirus属,betacoronavirus属,gammacoronavirus属和deltacoronavirus属的冠状病毒。
进一步的，本发明所述的冠状病毒至少包括pedv、hcov229e、tgev、sars-cov-2、sars、mers、mhv、phev、ibv、pdcov8。
本发明中，所述人、猴和猪的pabpc4基因序列分别如seqidno.1，seqidno.2和seqidno.3所示，所述序列包含编码seqidno.4，seqidno.5和seqidno.6所示的pabpc4蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
具体的，所述猪pabpc4基因序列的cds区域1881个核苷酸编码626个氨基酸。
所述人pabpc4基因序列的cds区域1983个核苷酸，包含一个开放阅读框，编码660个氨基酸。
所述猴pabpc4基因序列的cds区域1983个核苷酸，包含一个开放阅读框，编码660个氨基酸。
本发明有益的技术效果在于：
在本发明之前，还没有任何报道记载可以通过pabpc4的作用机制抑制冠状病毒并达到治疗冠状病毒导致的疾病，尤其是针对covid-2019(2019新型冠状病毒)。本发明提出pabpc4蛋白对冠状病毒n蛋白具有结合和降解作用，并且能够抑制病毒的繁殖，可以作为治疗药物，用于治疗冠状病毒感染。
本发明中的sars-cov-2、2019-ncov、covid-2019都指的是2019新型冠状病毒。
附图说明
图1：pabpc4抑制冠状病毒n蛋白的表达，(a)coip检测pabpc4和冠状病毒n蛋白(pedv-n,hcov229e-n,sars-cov-2-n,mers-n,sars-n,mhv-n,ibv-n和pdcov-n)互作，(b)pabpc4梯度降解pedv的n蛋白，(c)pabpc4梯度降解sars-cov-2的n蛋白(d)pabpc4降解冠状病毒n蛋白(hcov229e-n,mers-n,sars-n,mhv-n,ibv-n和pdcov-n)。
图2：pabpc4抑制冠状病毒复制，(a)westernblotting检测pabpc4抑制pedv增值，(b)荧光定量pcr检测pabpc4抑制pedv增值，(c)westernblotting检测pabpc4抑制mhv增值，(d)荧光定量pcr检测pabpc4抑制mhv增值，(e)westernblotting检测pabpc4抑制ibv增值，(f)荧光定量pcr检测pabpc4抑制ibv增值，(g)westernblotting检测pabpc4抑制pdcov增值，(h)荧光定量pcr检测pabpc4抑制pdcov增值。
图3：sp1直接调控pabpc4转录，(a)荧光定量pcr检测pedv感染细胞后下调pabpc4表达，(b)荧光定量pcr检测pedv感染细胞后转录因子egr1，egr2，sp1，hic2和zfx变化，(c)荧光定量pcr检测过表达sp1对pabpc4表达的影响，(d)荧光定量pcr检测过sirna干扰sp1对pabpc4表达的影响，(e)检测过表达sp1对pabpc4启动子下游荧光素酶表达的影响。
图4：pabpc4-march8-ndp52选择性自噬途径降解冠状病毒n蛋白，(a)抑制剂筛选降解pabpc4降解pedv的n蛋白途径,(b)抑制剂筛选降解pabpc4降解sars-cov-2的n蛋白途径，(c)coip试验验证pabpc4分别与marchf8和myc-ndp52互作，(d)sirna干扰ndp52，marchf8和atg5对pabpc4降解pedv的n蛋白的影响,(e)sirna干扰ndp52，marchf8和atg5对pabpc4降解sars-cov-2的n蛋白的影响，(f)pabpc4-march8-ndp52降解冠状病毒n蛋白抑制冠状病毒增值的模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
实施例1：pabpc4抑制冠状病毒n蛋白的表达
将冠状病毒alphacoronavirus属中的pedv和hcov229e,betacoronavirus属中的sars-cov-2，sars，mers和mhv，gammacoronavirus属中的ibv，以及deltacoronavirus属中的pdcov8种冠状病毒的n基因克隆到哺乳动物表达载体中，然后将8种n基因分别与pabpc4基因(人、猪和猴)共转染293t细胞24h，通过免疫共沉淀(coip)分析，结果显示：8个n蛋白分别与pabpc4蛋白相互作用(图1a)，并且分别降解上述几种冠状病毒的n蛋白(图1b-d)。
为了验证pabpc4降解n蛋白，将8种冠状病毒的n蛋白质表达质粒分别与pabpc4共转染293t细胞，通过westernblotting检测其蛋白质丰度，结果显示pabpc4的表达明显减少了n蛋白的产生，高水平的pabpc4对pedv的n蛋白和sars-cov-2的n蛋白有较强的抑制作用(图1b和c)。对于其他六种n蛋白，pabpc4也高效地降低了n蛋白的产量(图1d)。这些数据表明pabpc4蛋白能够广谱的与冠状病毒n蛋白互作，广谱的降解冠状病毒n蛋白。
实施例2：pabpc4抑制冠状病毒复制
为了分析pabpc4蛋白降解n蛋白对冠状病毒的影响，用pabpc4转染几种不同的细胞，使其过表达24h，然后用pedv感染vero细胞和llc-pk1细胞，用mhv感染的n2a细胞，用ibv感染的h1299细胞，用pdcov感染的st细胞，感染剂量为0.01moi。在不同时间点采集感染细胞和培养上清液，检测病毒载量。
结果显示：转染pabpc4的细胞中冠状病毒n蛋白水平明显低于转染对照空载体的细胞(参见图2a，2c,2e和2g)。进一步检测细胞上清液中冠状病毒的mrna显示：如预期结果，过表达pabpc4的细胞上清液中的冠状病毒mrnas明显低于空载体转染的细胞(参见图2b，2d,2f和2h)。
结果表明pabpc4基因在抑制冠状病毒复制中发挥作用，具有抑制冠状病毒复制和繁殖的作用。
实施例3：sp1直接调控pabpc4转录
转录因子结合启动子调节靶向基因的表达。了解pabpc4启动子结合的转录因子，可能有助于上调该基因，从而抑制冠状病毒。我们发现pedv感染llc-pk1细胞后，pabpc4表达下调(图3a)。为了研究pabpc4基因的启动子的边界，寻找启动子和转录因子，我们扩增了pabpc4启动子序列的1350个碱基，并将其克隆到荧光素酶载体中。将一系列截短型启动子克隆到荧光素酶载体中，检测其在293t细胞中直接表达荧光素酶的能力。
结果显示：含有-279到-1多核苷酸的启动子缺失突变体诱导了与全长启动子相似的荧光素酶表达.与此相反，缺乏pabpc44启动子-256-1序列的突变体导致基底荧光素酶活性非常低或检测不到。
这些结果表明：pabpc4核心启动子区位于-279-1位点。为了确定最小pabpc4启动子的边界，以pabpc4启动子核苷酸-279-1序列为基础，将一系列截短型启动子克隆到荧光素酶载体中，测定其荧光素酶活性。含-153至-1核苷酸的构建物显示荧光素酶表达增加。综合来看，这些结果表明，最小pabpc4核心启动子的边界位于-153至-1位置。
为了分析pabpc4基因的转录调控，我们使用jaspar脊椎动物数据库检测了该启动子潜在的转录因子结合位点(tfbs)。我们发现，最小的abpc4核心启动子区域，从核苷酸位置-153到-1，包含几个tfbs，包括zfx，hic2，egr1，egr2和sp1结合位点。为了研究不同转录因子对pabpc4启动子调控基因表达的影响，采用qrt-pcr方法分析这些转录因子在cov感染后的表达情况。结果表明，sp1、hic2和zfx在感染后均下调(图3b)。为了进一步评估转录因子是否参与调节pabpc4的表达，我们分别针对sp1，hic2和zfxmrna序列合成了sirnas。qrt-pcr分析表明：sp1sirna转染vero细胞后，pabpc4mrna水平显著降低(图3c)，但在转染hic2sirna或zfxsirna的vero细胞中保持稳定。我们接下来过度表达转录因子sp1对内源性pabpc4的诱导表达变化。结果显示(图3d)：sp1过表达显著激活转录的pabpc4基因。过量表达转录因子sp1的启动子含有核苷酸从-153到-1诱导更高的荧光素酶表达(图3e)。总之，这些结果表明sp1通过与pabpc4启动子结合，在诱导pabpc4表达中起直接作用。sp1蛋白是一种锌指转录因子上调的转化生长因子-和锌制剂。上调sp1蛋白可以促进pabpc44表达从而抑制冠状病毒。
实施例4：pabpc4-march8-ndp52选择性自噬途径降解冠状病毒n蛋白
泛素-蛋白酶体系统途径和自溶体途径是真核细胞内两种主要的蛋白质降解途径。因此，为了确定pabpc4通过哪种途径介导冠状病毒n蛋白的降解，将pedv和sars-cov-2的n蛋白质表达质粒分别共转染到293t细胞中，然后用蛋白酶抑制剂mg132或自噬抑制剂3-methyladenine(3ma)、氯喹(cq)或bafilomycina1处理这些细胞。
结果显示：pabpc4介导的n蛋白降解被33ma、cq和bafilomycina1阻断，而不被蛋白酶体抑制剂mg132阻断(图4，a和b)。
冠状病毒感染通过检测微管组织蛋白1轻链3(lc3)的水平来诱导自噬，这是自噬的标志。为了验证自噬是否由n蛋白和pabpc4诱导，我们在293t细胞中共转染编码flag-pabpc4和ha-n的质粒，发现在293t细胞中共表达的pabpc4和n蛋白以剂量依赖的方式增加了lc3-i向lc3-ii的转化，表达n蛋白的293t细胞的自噬活性增高。
在选择性自噬过程中，底物蛋白被一个e3泛素连接酶修饰泛素，然后被货物受体识别。最近的研究表明，bst2在rna病毒感染过程中，利用e3泛素连接酶march8将k27连接的泛素链附着在mavs和pedv的n蛋白上，从而引起ndp52依赖的自噬降解。在这项研究中，我们发现pabpc4通过自噬促进pedv的n蛋白的降解。为了证实pabpc44蛋白与march8和ndp52相互作用，我们在293t细胞中用转染编码pabpc4和march8或ndp52的质粒，进行了co-ip检测。结果表明pabpc4蛋白与march8和ndp52相互作用(图4c)。gst-pulldown实验表明pabpc4蛋白与ndp52直接结合。我们还研究了pabpc4-march8和pabpc4-ndp52的共定位，发现pabpc4蛋白与march8和ndp52相互作用。pedv的n蛋白结合march8和ndp52已被报道。这些数据表明pabpc4将pedv的n蛋白和march8与货物受体ndp52连接起来，用于自噬降解。
为了验证march8-ndp52触发的自噬途径是否是pabpc4诱导n蛋白降解所必需的，我们分别用pedv和sars-cov-2和flag-pabpc4的ha-n蛋白质表达质粒转染293t细胞，并分别与几种sirna(ndp52sirna,march8sirna,atg5sirna,或对照sirna)一起转染。24h后，我们用westernblotting分析细胞裂解物，发现干扰ndp52、march8或atg5的表达可以有效地阻止pabpc4诱导的n蛋白的降解(图4,d和e)。我们还发现，它们各自的sirna抑制ndp52、march8或atg5蛋白的表达，有效地阻止pabpc4抑制vero细胞pedv复制。
这些结果表明，pedv和sars-cov-2的n蛋白是通过pabpc4-march8-ndp52-自噬体途径自噬被降解。hcov229e、mers、sars、mhv、ibv和pdcov的n蛋白质通过自噬体途径被自噬降解。结果表明：pabpc4-march8-ndp52-自噬体途径普遍降解核衣壳蛋白，抑制冠状病毒复制。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>广谱抗冠状病毒的多肽及其用途
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1983
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>1
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<213>猕猴(macacamulatta)
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<213>家猪(susscrofa)
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thrser
625
1.一种广谱抗冠状病毒药物，其特征在于：包含pabpc4蛋白或pabpc4蛋白的衍生多肽，所述衍生多肽具有与pabpc4蛋白类似的抗冠状病毒的功能。
2.根据权利要求1所述的药物，所述冠状病毒选自alphacoronavirus属、betacoronavirus属、gammacoronavirus属、或deltacoronavirus属。
3.根据权利要求2所述的药物，所述冠状病毒选自：pedv、hcov229e、tgev、sars-cov-2、sars、mers、mhv、phev、ibv、pdcov8。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物，所述pabpc4蛋白来源于人、猴、猪等多种物种，其中来源于人的pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示；来源于猴的pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示；来源于猪的pabpc4蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示。
5.根据权利要求1-3任一项所述的药物，其特征在于所述pabpc4蛋白的衍生多肽包括pabpc4蛋白截短肽、或在pabpc4蛋白氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸取代、缺失或添加而产生的多肽，所述衍生多肽与seqidno.4或seqidno.5或seqidno.6所示的多肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且具有类似的抑制冠状病毒的功能。
6.一种广谱抗冠状病毒的药物，其特征在于包含能提高pabpc4基因表达的制剂，所述制剂选自sp1转录调控因子或通过调控sp1从而提高pabpc4基因表达的制剂，所述制剂包括sirna等。
7.一种广谱抗冠状病毒药物，其特征在于包含基于pabpc4蛋白与march8和ndp52相互作用从而通过pabpc4-march8-ndp52选择性自噬途径降解冠状病毒n蛋白的机制的活性物质。
8.所述活性物质选自雷帕霉素、锌和tgf-β。
9.权利要求1-5中任一项所述的pabpc4蛋白、pabpc4蛋白的衍生多肽、权利要求6或7或8所述药物用于制备治疗冠状病毒引起的疾病的药物的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述的冠状病毒选自：pedv、hcov229e、tgev、sars-cov-2、sars、mers、mhv、phev、ibv、pdcov8。
技术总结