本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤即癌症，是全球面临的重大疾病之一，现有的癌症治疗手段，如放疗、手术、靶向治疗等，具有一定的疗效，但也存在较大的局限性。肿瘤疫苗作为近年来肿瘤治疗研究热点之一，通过将肿瘤疫苗导入患者体内，进而增强免疫原性，激活免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而控制肿瘤生长转移或清除肿瘤。肿瘤疫苗主要包括四种类型：细胞疫苗，多肽疫苗、基因工程疫苗、抗体肿瘤疫苗。目前，肿瘤细胞疫苗的获取手段主要是通过物理、化学或生物方法(紫外线照射、加热等)处理自体或同种异体来源的肿瘤细胞，进而获取保留了免疫原性，无致瘤性的细胞疫苗。
低温等离子体(non-thermalplasma，ntp)，作为物质的第四态，主要包含电子、离子和中性粒子等多种自由基，被广泛的应用于生物医学领域，如灭菌、美白、促进伤口愈合等。近年来，研究证明，在体外细胞模型中，低温等离子体可以显著的杀死多种癌细胞。同时，在荷瘤小鼠模型中发现，低温等离子体能够抑制瘤体的生长速度。作为一种新型技术，低温等离子体具有较强的可操控性，精确的作用范围、接近人体的温度等优点，正在被开发成为一种新的癌症治疗手段。因此，基于低温等离子体技术制备肿瘤细胞疫苗及开发新型的低温等离子体癌症治疗手段具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法。
发明人长期致力于低温等离子体杀伤肿瘤细胞等相关研究。研究发现，在体外细胞实验中，低温等离子体能够有效的杀死多种肿瘤细胞；在荷瘤小鼠模型中，低温等离子体可以抑制体内瘤体的生长。在前期基础上，本申请主要开发了相关的肿瘤细胞疫苗，通过注射低温等离子体灭活的肿瘤细胞，抑制瘤体的形成率和生长速度，开拓了低温等离子体在肿瘤免疫治疗中的应用范围。
第一方面，本发明提供低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)以肿瘤细胞为对象，进行培养并调整细胞状态至生长对数期；
2)收集步骤1)中处于对数生长期的肿瘤细胞并洗涤细胞，蛋白酶酶解细胞后离心收集，并调整细胞浓度至3*105～5*105细胞/毫升；
3)步骤2)处理后的肿瘤细胞低温等离子体直接或间接处理30秒～30分钟；
4)将步骤3)低温等离子处理获得的肿瘤细胞继续培养4～48小时，蛋白酶酶解后离心收集灭活细胞，即获得肿瘤细胞疫苗。
优选地，步骤1)中肿瘤细胞在37℃，5％co2条件下，于含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的dmem高糖培养基中进行培养，待细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。
优选地，步骤2)使用预热pbs洗涤细胞，蛋白酶优选胰蛋白酶，使用预热pbs或dmdm高糖培养基调整细胞浓度至3*105～5*105细胞/毫升。
优选地，步骤3)中低温等离子体可以选自选自射流低温等离子体、介质阻挡放电低温等离子体、空气多针低温等离子体中的一种或多种。
在一具体实施方式中，所述低温等离子体为介质阻挡放电低温等离子体。
优选地，步骤3)中低温等离子体的工作气体为空气和/或惰性气体。
所述惰性气体包括氦气、氩气和氮气中的一种或多种，优选地，所述惰性气体为氦气。
优选地，步骤3)中所述低温等离子体的功率为0.5w/cm2～5w/cm2；所述低温等离子体的工作时间为30秒～30分钟。
在一具体实施方式中，所述低温等离子体的功率为0.9w/cm2；所述低温等离子体的工作时间为120秒。
优选地，对步骤3)获得肿瘤细胞继续培养12小时，蛋白酶优选胰蛋白酶。
优选地，所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、头颈癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞，优选为黑色素瘤细胞。
第二方面，本发明提供基于第一方面制备的肿瘤细胞疫苗的应用。
本发明有益效果：
本发明发现低温等离子体能够显著杀伤肿瘤细胞，如小鼠黑色素瘤细胞；以低温等离子体处理的肿瘤细胞作为肿瘤细胞疫苗，可以有效抑制肿瘤的形成率和生长速度，为后续低温等离子体在肿瘤免疫治疗方面的应用提供了新思路。
附图说明
图1为低温等离子体处理后小鼠黑色素瘤细胞b16-f10-ova的细胞活力变化，ctrl代表对照组。
图2为低温等离子体制备的肿瘤细胞疫苗对b16-f10-ova细胞成瘤率和瘤体生长速度的影响。a&b，荷瘤小鼠与瘤体的示意图；c，瘤体体积变化示意图。
具体实施方式
以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1cellcountingkit-8(cck-8试剂盒)检测低温等离子体对癌细胞的杀伤作用
采用介质阻挡放电低温等离子体装置，该装置主要包含2个部分：高压电源、等离子体反应室。其中，等离子体反应室由4对电极组成，本申请的所有实施例均选择氦气作为工作气体。
以小鼠黑色素瘤细胞b16-f10-ova作为试验对象(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，将冻存的小鼠黑色素瘤细胞b16-f10-ova复苏后，在37℃，5％co2条件下，培养于含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的dmem高糖培养基中，待细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。
取对数期生长的细胞，预热pbs洗涤，加入1.0ml的胰蛋白酶，2000rpm,离心5分钟，收集细胞。使用dmem重悬细胞，计数，按照每皿3×105细胞接种于直径为35mm的细胞培养皿中，每皿1.5mldmem培养基，随后进行低温等离子体处理。处理前通入氦气5分钟，用于排出等离子体反应室内的空气，氦气流速为120l/h。低温等离子体装置参数设置如下：实验电源为12kv，24khz，放电功率为0.9w/cm2，电极和培养基液面间距5mm。将步骤1接种的细胞培养皿置于介质阻挡放电低温等离子体装置的反应室中，通氦气5分钟，采用不同的低温等离子体处理剂量，分别为0、60、90、120秒；低温等离子体处理后将各组细胞置于37℃、5％co2条件下，继续培养24小时，弃培养基，每皿加入cck-8工作液(800～1000μl)，继续培养0.5～1小时，分别取100μl上清置于96孔板中，用酶标仪检测450nm处吸光值(od值)。将仅有培养基和cck-8溶液，无细胞的孔作为空白组；将未进行低温等离体处理的孔作为对照组。根据以下公式计算细胞活力：
细胞活力＝[(od处理组–od空白组)/(od对照组-od空白组)]×100％。
结果如图1所示，低温等离子体处理可有效地杀伤小鼠黑色素瘤细胞b16-f10-ova，且效率与剂量呈现正相关性。低温等离子体处理120秒后，细胞活力低于10％，被认定为本申请中合适的制作肿瘤细胞疫苗的剂量。
实施例2体内实验验证肿瘤细胞疫苗的有效性
低温等离子体装置、实验材料和低温等离子体处理方法同实施例1。低温等离子体处理120秒后，将小鼠黑色素瘤细胞b16-f10-ova继续培养12小时，胰蛋白酶酶解，2000rpm，离心5分钟，收集细胞。预冷pbs洗涤细胞，重悬计数，将浓度调整为107细胞每毫升。取周龄为6-8周的c57bl/6小鼠20只，分为2组，每组10只，分别为对照组和实验组。第1天，对照组小鼠腹腔注射pbs组(100ul)，实验组小鼠腹腔注射低温等离子体灭活的肿瘤细胞(100ul，约1-3×106细胞)。第3天，将实验小鼠麻醉，剃毛，右侧背部皮下造瘤，即注射未处理的b16-f10-ova细胞5×105(100ul)。继续饲养小鼠30天左右，并不断监测背部移植瘤的成瘤率及瘤体的体积变化。使用游标卡尺测量瘤体的长、宽，根据公式：v＝0.52*长*宽2，计算瘤体的体积。当瘤体体积达到50mm3后，每周测量瘤体体积3次，并绘制瘤体生长速度。
如图2所示，注射低温等离子体制备的肿瘤疫苗能够有效的抑制黑色素瘤瘤体的生长速度(图2a,c)。在实验结束后，剖出瘤体，发现注射肿瘤疫苗的实验组，瘤体体积明显小于未注射的对照组(图2b)。
综上所述，低温等离子体处理可以显著的杀死小鼠黑色素瘤细胞；通过腹腔注射低温等离子致死的肿瘤细胞即肿瘤细胞疫苗可以抑制黑色素瘤的成瘤率及瘤体生长速度。采用低温等离子体技术灭活肿瘤细胞进而获取肿瘤细胞疫苗，为低温等离子体在未来临床应用提供了新思路和方法。
本发明以小鼠的黑色素瘤肿瘤模型为例，证明腹腔注射低温等离子体灭活的肿瘤细胞疫苗，可以有效的抑制黑色素瘤皮下移植瘤的成瘤率和瘤体的生长速度。但是，本领域技术人员应该理解，低温等离子体的设备是多样化的，且疫苗的注射方式是多部位的，所有低温等离子体制备肿瘤细胞疫苗的各种注射方式，均在本发明的保护范围内。
1.一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)以肿瘤细胞为对象，进行培养并调整细胞状态至生长对数期；
2)收集步骤1)中处于对数生长期的肿瘤细胞并洗涤细胞，蛋白酶酶解细胞后离心收集，并调整细胞浓度至3*105～5*105细胞/毫升；
3)步骤2)处理后的肿瘤细胞低温等离子体直接或间接处理30秒～30分钟；
4)将步骤3)低温等离子处理获得的肿瘤细胞继续培养4～48小时，蛋白酶酶解后离心收集灭活细胞，即获得肿瘤细胞疫苗。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)中肿瘤细胞在37℃，5％co2条件下，于含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的dmem高糖培养基中进行培养，待细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)使用预热pbs洗涤细胞，蛋白酶优选胰蛋白酶，使用预热pbs或dmdm高糖培养基调整细胞浓度至3*105～5*105细胞/毫升。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中低温等离子体可以选自射流低温等离子体、介质阻挡放电低温等离子体、空气多针低温等离子体中的一种或多种；优选地，所述低温等离子体为介质阻挡放电低温等离子体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述低温等离子体的工作气体为空气和/或惰性气体，低温等离子体的功率为0.5w/cm2～5w/cm2。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述惰性气体包括氦气、氩气和氮气中的一种或多种，优选地，所述惰性气体为氦气。
7.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述低温等离子体的功率为0.9w/cm2，所述低温等离子体的处理时间为120秒。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中肿瘤细胞继续培养的时间为12小时，蛋白酶优选胰蛋白酶。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、头颈癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞，优选为黑色素瘤细胞。
10.权利要求1-9任一所述方法制备获得的肿瘤细胞疫苗的应用。
技术总结