本发明属于免疫细胞疗法技术领域，具体的说是涉及一种通过til免疫细胞改善胃癌的方法。
背景技术：
胃癌（gastriccarcinoma）是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部、胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。
胃癌的病因有：1、地域环境及饮食生活因素：胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。长期食用熏烤、盐腌食品的人群中胃远端癌发病率高，与食品中亚硝酸盐、真菌毒素、多环芳烃化合物等致癌物或前致癌物含量高有关；吸烟者的胃癌发病危险较不吸烟者高50％。2、幽门螺杆菌(hp)感染：我国胃癌高发区成人hp感染率在60％以上。幽门螺杆菌能促使硝酸盐转化成亚硝酸盐及亚硝胺而致癌；hp感染引起胃黏膜慢性炎症加上环境致病因素加速黏膜上皮细胞的过度增殖，导致畸变致癌；幽门螺杆菌的毒性产物caga、vaca可能具有促癌作用，胃癌患者中抗caga抗体检出率较一般人群明显为高。3、癌前病变：胃疾病包括胃息肉、慢性萎缩性胃炎及胃部分切除后的残胃，这些病变都可能伴有不同程度的慢性炎症过程、胃黏膜肠上皮化生或非典型增生，有可能转变为癌。癌前病变系指容易发生癌变的胃黏膜病理组织学改变，是从良性上皮组织转变成癌过程中的交界性病理变化。胃黏膜上皮的异型增生属于癌前病变，根据细胞的异型程度，可分为轻、中、重三度，重度异型增生与分化较好的早期胃癌有时很难区分。4、遗传和基因：遗传与分子生物学研究表明，胃癌患者有血缘关系的亲属其胃癌发病率较对照组高4倍。胃癌的癌变是一个多因素、多步骤、多阶段发展的过程，涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因等的改变，而基因改变的形式也是多种多样的。
胃癌的预防措施有：1、改变饮食结构，多食蔬菜、水果、豆类食物和牛奶，鲜鱼、肉、蛋，提倡食用大蒜、绿茶。2、改变不良饮食习惯，避免暴饮暴食，三餐不定时；进食不宜过快、过烫、过硬；少食熏腌食品，避免高盐饮食。3、少饮烈性酒，不吸烟。4、做好粮食的防霉去霉工作，保护食用水的卫生。5、积极治疗胃溃疡、慢性胃炎，治疗胃内幽门螺杆菌感染。6、对高发区及高危人群进行胃癌的普查。
胃癌按大体形态分类：1、早期胃癌：是指癌组织局限于胃黏膜和黏膜下层的胃癌，按肉眼形态可分为隆起型、平坦型和凹陷型。2、进展期胃癌：是指癌组织浸润深度已超越黏膜下层的胃癌，又可分为息肉型、局限溃疡型、浸润溃疡型和弥漫浸润型四类。胃癌按组织病理学分类：可分为腺癌、腺鳞癌、鳞癌和类癌等，绝大多数是胃腺癌。按组织结构不同，腺癌还可分为乳头状癌、管状腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和印戒细胞癌。按细胞分化程度不同，可分为高分化、中分化、低分化3种。按组织起源可分为肠型和胃型。胃癌按发病部位分类：可分为胃底贲门癌、胃体癌、胃窦癌等，不同部位的胃癌决定手术术式的不同。
早期胃癌多数患者无明显症状，少数人有恶心、呕吐或是类似溃疡病的上消化道症状，难以引起足够的重视。随着肿瘤的生长，影响胃功能时才出现较为明显的症状，但均缺乏特异性。疼痛与体重减轻是进展期胃癌最常见的临床症状。患者常有较为明确的上消化道症状，如上腹不适、进食后饱胀，随着病情进展上腹疼痛加重，食欲下降、乏力。根据肿瘤的部位不同，也有其特殊表现。贲门胃底癌可有胸骨后疼痛和进行性吞咽困难；幽门附近的胃癌有幽门梗阻表现。当肿瘤破坏血管后，可有呕血、黑便等消化道出血症状；如肿瘤侵犯胰腺被膜，可出现向腰背部放射的持续性疼痛；如肿瘤溃疡穿孔则可引起剧烈疼痛甚至腹膜刺激征象；肿瘤出现肝门淋巴结转移或压迫胆总管时，可出现黄疸；远处淋巴结转移时，可在左锁骨上触及肿大的淋巴结。晚期胃癌患者常可出现贫血、消瘦、营养不良甚至恶病质等表现。
胃癌的扩散和转移有以下途径：1、直接浸润：贲门胃底癌易侵及食管下端，胃窦癌可向十二指肠浸润。分化差浸润性生长的胃癌突破浆膜后，易扩散至网膜、结肠、肝、胰腺等邻近器官。2、血行转移：发生在晚期，癌细胞进入门静脉或体循环向身体其他部位播散，形成转移灶。常见转移的器官有肝、肺、胰、骨骼等处，以肝转移为多。3、腹膜种植转移：当胃癌组织浸润至浆膜外后，肿瘤细胞脱落并种植在腹膜和脏器浆膜上，形成转移结节。腹膜种植最易发生于上腹部，肠系膜上。直肠、膀胱处的种植是胃癌晚期的征象。直肠前凹的转移癌，直肠指检可以发现；女性胃癌患者可发生卵巢转移性肿瘤。4、淋巴转移：淋巴转移是胃癌的主要转移途径，进展期胃癌的淋巴转移率高达70％左右，早期胃癌也可有淋巴转移。胃癌的淋巴结转移率和癌灶的浸润深度呈正相关。胃癌的淋巴结转移通常是循序逐步渐进，但也可发生跳跃式淋巴转移，即第一站无转移而第二站有转移。终末期胃癌可经胸导管向左锁骨上淋巴结转移，或经肝圆韧带转移至脐部。
病史、体格检查及实验室检查符合胃癌特点，且x线气钡双重造影或内镜发现占位性病变，即可临床诊断胃癌，但最终确诊胃癌还须根据活组织检查或细胞学检查结果。凡有下列情况者，需及时进行全面检查：1、胃溃疡患者经严格内科治疗而症状仍无好转者；2、40岁以后出现中上腹不适或疼痛，无明显节律性并伴有明显食欲缺乏和消瘦者；3、年龄40岁以上，既往有慢性萎缩性胃炎或不典型增生，近期症状加重者；4、既往有慢性胃病史，大便潜血检查，发现便潜血阳性，持续2周以上者；5、胃息肉大于2cm者。通过胃镜检查及活检获得胃癌定性诊断后，还需进行一系列影像学检查，进行胃癌的分期诊断。准确的分期对制定合理的治疗方案、判断预后、评价疗效甚为重要。分期越高，病情越晚、生存期越短。
现有技术中胃癌的治疗方法有以下几种：1、手术治疗：根治性手术，原则为整块切除包括癌灶和可能受浸润胃壁在内的胃的部分或全部，按临床分期标准整块清除胃周围的淋巴结，重建消化道。姑息性手术，原发灶无法切除，为了减轻由于梗阻、穿孔、出血等并发症引起的症状而作的手术，如胃空肠吻合术、空肠造口、穿孔修补术等。2、化疗：用于根治性手术的术前、术中和术后，延长生存期。晚期胃癌患者采用适量化疗，能减缓肿瘤的发展速度，改善症状，有一定的近期效果。早期胃癌根治术后原则上不必辅助化疗，有下列情况者应行辅助化疗：病理类型恶性程度高；癌灶面积大于5厘米；多发癌灶；年龄低于40岁。进展期胃癌根治术后、姑息手术后、根治术后复发者需要化疗。常用的胃癌化疗给药途径有口服给药、静脉、腹膜腔给药、动脉插管区域灌注给药等。常用的口服化疗药有替加氟、优福定、氟铁龙等。常用的静脉化疗药有氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、阿霉、依托泊苷、甲酰四氢叶酸钙等。近年来紫杉醇、草酸铂、拓扑酶抑制剂、希罗达等新的化疗药物用于胃癌治疗。3、靶向治疗：靶向治疗可针对性地损伤癌细胞，减轻正常细胞损害。目前胃癌靶向治疗药物种类及作用均有限。靶向治疗药物主要有表皮生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、细胞凋亡促进剂、基质金属蛋白酶抑制剂等。4、其他治疗：胃癌的免疫治疗包括非特异生物反应调节剂如卡介苗、香菇多糖等；细胞因子如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等；以及过继性免疫治疗如淋巴细胞激活后杀伤细胞（lak）等的临床应用。抗血管形成基因是研究较多的基因治疗方法，可能在胃癌的治疗中发挥作用。5、支持治疗：旨在减轻患者痛苦，改善生活质量，延长生存期。包括镇痛、纠正贫血、改善食欲、改善营养状态、缓解梗阻、控制腹水和心理治疗等。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。早期胃癌经治疗后预后较好。贲门癌与胃上1/3的近端胃癌比胃体及胃远端癌的预后要差。女性较男性预后要好。60岁以上胃癌患者术后效果较好，30岁以下预后很差。
肿瘤免疫治疗，是这几年比较热门，甚至是最热门的癌症治疗手段。说起肿瘤免疫治疗，大家可能立马想到pd-1/pd-l1抗体，k药、o药、国产pd-1抗体，不少晚期癌症患者可以获益。不过，除了pd-1/pd-l1，肿瘤免疫治疗还包括免疫细胞疗法，比如大家熟知的car-t技术，是通过给癌症患者回输特殊的car-t细胞达到控制肿瘤的目的。基于胃癌的难治性，胃癌通常都是控制疾病发展，防止病情进一步恶化，尽量延长患者寿命。除了car-t，免疫细胞疗法还包括tcrt疗法/til细胞疗法，如果能够发明出一种采用免疫细胞疗法中的til细胞技术来改善胃癌患者的生活质量将成为胃癌患者的福音。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种通过til免疫细胞改善胃癌的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开了一种通过til免疫细胞改善胃癌的方法，其具体操作流程为：
（1）首先从患者体内切除肿瘤，将肿瘤组织在无菌、冷链条件下运输至gmp实验室，并分离获得104～106个起始肿瘤浸润淋巴细胞；
（2）起始肿瘤浸润淋巴细胞在适宜条件下培养、扩增一万倍并进一步纯化，达到108个初代种子细胞，然后进行冻存，冻存条件为每组10支，107个细胞/支，液氮-196℃温度条件下保存；
（3）肿瘤浸润淋巴细胞复苏、扩增至8×107个，以慢病毒载体rnai技术敲低pd-1；
（4）肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至一千至一万倍，使肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至1010个以上；
（5）最后肿瘤浸润淋巴细胞回输至患者，平均每次注射肿瘤浸润淋巴细胞的细胞量为7.3×108个。
t细胞因成书于凶险而得名，属于重要的免疫细胞，t细胞的主要功能是介导细胞免疫，调节机体的免疫应答。t细胞来源于造血干细胞，在胸腺中发育和分化，成熟后迁移至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，外周血中t细胞占淋巴细胞总数的65％～70％。胸腺依赖淋巴细胞简称t细胞，是骨髓来源的淋巴干细胞在胸腺内分化而成的，胸腺发育成熟的t细胞转移到外周淋巴器官或淋巴组织，在没有接触特异性抗原分子刺激前，保持相对静息状态，称初始t细胞。一旦接受相应抗原的刺激，它们便转化为代谢活跃、直径为15～20μm的大淋巴细胞，并增殖分化。大部分分化为效应性t细胞，获得了迁移、产生细胞因子和其他效应的功能，小部分形成记忆性t细胞。效应性t细胞寿命较短，具有杀伤靶细胞的功能。记忆性t细胞寿命可长达数年，甚至终身，当机体再次遇到相同抗原刺激时，能迅速转化增殖，形成大量效应性t细胞，启动更大强度的免疫应答，并使机体较长时期保持对该抗原的免疫力。由于效应性t细胞可直接杀灭靶细胞，故t细胞参与的免疫称为细胞免疫。
美国国家癌症研究所外科部主任罗森伯格（steverosenberg）博士开创了使用肿瘤浸润淋巴细胞的先河。til肿瘤浸润淋巴细胞是来源于浸润在肿瘤组织里的细胞，是已知的能够特异性识别和攻击癌症的免疫细胞。本发明肿瘤浸润淋巴细胞在改善胃癌中的应用是把乳腺肿瘤组织中的淋巴细胞分离出来并扩增，再回输给患者，就能够起到改善胃癌患者生活质量的目的。
肿瘤浸润淋巴细胞，是一种浸润在肿瘤组织里面，能够有效识别肿瘤细胞新抗原的t细胞，这种能够识别肿瘤细胞新抗原的t细胞，具有能够高效的杀死肿瘤细胞能力，包括杀死由该病灶转移到的其他部位的肿瘤传代细胞。肿瘤浸润淋巴细胞的优势为：用机械处理和酶消化方法，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润淋巴细胞，加入高剂量il-2体外培养及改造，然后将其回输入患者体内，相较于其它免疫疗法，肿瘤浸润淋巴细胞具有识别肿瘤抗原靶点多、副作用少、可治疗实体瘤多，疗效更强等优点。
本发明的有益效果是：在2019年5月asco公布数据：til免疫细胞治疗实体肿瘤客观缓解率达44％，疾病控制率达89％。本发明til免疫疗法相比较其他治疗方法的优势：1、手术切除法：优势：是能够直接切除病灶；劣势：有出血或感染风险，愈合时间较长，肿瘤若扩散或转移，则不可手术，伤及患者元气。2、放射疗法：优势：精准、高效和副作用小等；劣势：只针对特定部位，有些部位无法使用，对正常组织细胞有伤害，副作用低。3、化学疗法：优势：肿瘤扩散或转移时可有效杀减肿瘤细胞；劣势：副作用较大，免疫系统损失严重，增加感染风险，容易产生耐药性。4、靶向药物疗法：优势：精准，高效；劣势：只针对单一的抗原靶点，容易产生耐药性和副作用。本发明公开的til免疫疗法具有高效的杀伤能力，能够识别多个抗原靶点，使用自身免疫细胞，无副作用，而且til免疫疗法能够针对复发或转移的晚期胃癌患者使用。
表1：til免疫细胞疗法相比较其它免疫疗法的优势。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作详细描述。
本发明公开了一种通过til免疫细胞改善胃癌的方法，其具体操作流程为：（1）首先从患者体内切除肿瘤，将肿瘤组织在无菌、冷链条件下运输至gmp实验室，并分离获得104～106个起始肿瘤浸润淋巴细胞；（2）起始肿瘤浸润淋巴细胞在适宜条件下培养、扩增一万倍并进一步纯化，达到108个初代种子细胞，然后进行冻存，冻存条件为每组10支，107个细胞/支，液氮-196℃温度条件下保存；（3）肿瘤浸润淋巴细胞复苏、扩增至8×107个，以慢病毒载体rnai技术敲低pd-1；（4）肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至一千至一万倍，使肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至1010个以上；（5）最后肿瘤浸润淋巴细胞回输至患者，平均每次注射肿瘤浸润淋巴细胞的细胞量为7.3×108个。
改善案例：1名52岁的脑转移胃癌患者，之前接受过胃癌切除手术和化疗治疗，平均注射til细胞量7.3×108个，17个月后，从医学影像上看，肿瘤消失，患者处于临床无病状态。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1.一种通过til免疫细胞改善胃癌的方法，其特征在于：所述肿瘤浸润淋巴细胞在改善胃癌中的应用的具体操作流程为：
（1）首先从患者体内切除肿瘤，将肿瘤组织在无菌、冷链条件下运输至gmp实验室，并分离获得104～106个起始肿瘤浸润淋巴细胞；
（2）起始肿瘤浸润淋巴细胞在适宜条件下培养、扩增一万倍并进一步纯化，达到108个初代种子细胞，然后进行冻存，冻存条件为每组10支，107个细胞/支，液氮-196℃温度条件下保存；
（3）肿瘤浸润淋巴细胞复苏、扩增至8×107个，以慢病毒载体rnai技术敲低pd-1；
（4）肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至一千至一万倍，使肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至1010个以上；
（5）最后肿瘤浸润淋巴细胞回输至患者，平均每次注射肿瘤浸润淋巴细胞的细胞量为7.3×108个。
技术总结