本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗。
背景技术：
trim28也被称为krab(kruppel-associatedbox)相关蛋白1或者转录中介因子1β。可以帮助维持胚胎干细胞固有的分化潜能，并且抑制体细胞的重编程能力。正肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylargininedeiminase4,padi4)是一种瓜氨酸化酶，可以将蛋白多肽中的精氨酸残基催化成瓜氨酸，瓜氨酸化后的蛋白其分子构象和生物活性均发生改变。在已识别的padi4底物中，发现atrx，dnmt3b，trim28和接头组蛋白histoneh1的变体等底物均可能影响干细胞的多能性。trim28的核心部分由pxvxl五肽结构域和转录中介因子信号序列(tif1signaturesequence，tss)组成，前者可以与异染色质蛋白(heterochromatinprotein1，hp1)相互作用。trim28的羧基端包含2个结构域，分别是植物同源结构域(planthomeodomain，phd)和溴结构域(bromodomain)，其中phd区域可以招募核小体重塑脱乙酰酶(nucleosomeremodelingdeacetylase，nurd)、组蛋白脱乙酰酶复合物和组蛋白h3k9特异甲基转移酶(setdomainbifurcated1，setdb1)，从而发挥染色质凝缩作用。多潜能细胞具有疏松的染色质结构，trim28的470和472位的精氨酸可以被padi4瓜氨酸化，这提示我们干细胞的多能性与trim28瓜氨酸化有关。关于trim28非组蛋白瓜氨酸化的研究还存在许多空白，原因在于瓜氨酸与精氨酸结构差异很小，很难制备特异性识别的trim28瓜氨酸化的抗体。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，包括与载体蛋白连接的短肽，以及其可接受的佐剂；
该短肽的氨基酸序列为：pyssaephvsgmkcit(瓜氨酸)scit(瓜氨酸)sgevc。
进一步地，佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
进一步地，载体蛋白为bsa。
进一步地，短肽与载体蛋白连接的连接过程如下：
将短肽溶解于载体蛋白溶液中，加入戊二醛溶液，室温搅拌4～6h后，加入反应终止剂终止反应，静置后于4～6℃取上清，并将其与缓冲液混合，透析70～90h即可；
短肽与载体蛋白的重量比为0.05～0.1:0.5～1。
进一步地，反应终止剂为甘氨酸。
进一步地，短肽与载体蛋白的重量比为0.05:1。
包含上述短肽的细胞系。
本发明的有益效果为：
通过本发明设计的抗原短肽，能够得到trim28-cit抗体，其能够特异性的、且高灵明度的识别到细胞内的trim28-cit蛋白，从而使得本发明设计的抗原短肽能够区分出trim28和trim28-cit蛋白表达差异。
附图说明
图1为trim28-cit抗体敏感性检测结果图；
图2为trim28抗体和trim28-cit抗体特异性检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1免疫抗原的合成
1、设计并合成抗原短肽各10毫克，序列如下：
trim28短肽序列：protyrserseralagluprohisvalserglymetlysargserargserglygluvalcys；(seqidno.1)
trim28-cit短肽序列：protyrserseralagluprohisvalserglymetlyscitsercitserglygluvalcys。
2、抗原短肽与载体蛋白的连接
称取10mgbsa溶解于1mlpbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中制备混合液，分别将0.5mg的抗原短肽(trim28短肽和trim28-cit短肽)溶解于该混合液中，再加1ml的0.25％戊二醛溶液，室温下搅拌4h。加入0.5ml的1mol/l的甘氨酸终止反应。4℃条件下，取上清液装入pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)透析袋，4℃条件下透析72h，每3～4h换液1次透析液，72h后取出分装，分别制备得到trim28-bsa和trim28-cit-bsa。然后收集透析液中成分一半于4℃下保存供检测用，一半于-20℃下保存供免疫用。
实施例2动物免疫
各免疫两只四川大耳白兔子，总共进行3次免疫。四川大耳白兔子颈背部皮下多点注射免疫。首次免疫用trim28-bsa/trim28-cit-bsa(1mg/ml)与分别弗氏完全佐剂以体积比为1:1进行混合，连接器来回抽打，充分乳化形成油包水状，乳化后每只注射1ml。2周后进行第2次免疫，取trim28-bsa/trim28-cit-bsa(1mg/ml)与弗氏不完全佐剂以体积比为1:1进行乳化，乳化后每只注射1ml；2周后，相同的方法(同第2次免疫)进行第3次免疫，10d后，耳静脉采血并检测其抗血清效价。
抗血清效价的具体过程如下：
(1)抗原包被
将trim28抗原/trim28-cit抗原用包被液稀释至最佳包被浓度。100μl/孔加入到聚苯乙烯酶联检测板各孔中，37℃包被2h，洗涤2次，5min/次，拍干。
(2)封闭
加入封闭液200μl/孔，37℃封闭3h，洗涤3次，拍干。
(3)分别加入血清样本品
抗血清100μl/孔，以正常大耳兔阴性血清作对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。
(4)加二抗
用封闭液将酶标记的羊抗兔稀释，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。
(5)显色
加入a、b液各80μl/孔，37℃d显色15min。
(6)终止
加入终止液80μl/孔。
(7)读数
在450nm单波长下测定各孔的d值，以与阴性对照孔d值的比值(p/n)大于2.1为限，作为判断效价的临界点。最终，确定血清的稀释倍数为1:1000。
实施例3抗血清的纯化保存
1、利用生物素标记trim28-cit和trim28多肽
取400μl的链霉亲和素磁珠在pbs缓冲液清洗3次，并重新分散于5ml体积的pbs缓冲液中。准确移取1ml生物素标记多肽到洗涤过的dynabeadstm磁珠在pbs悬浮液中孵育30分钟。标记了生物素的多肽特异性地与链霉亲和素结合，由此被磁珠捕获。
2、trim28抗体纯化
取1mltrim28-bsa免疫所得血清与2.5mltrim28-cit多肽的磁珠(2mg，10mg/ml)结合，4℃缓慢摇晃孵育2h。用磁铁分离涂带有抗体的珠粒2～3分钟，收集上清液再与trim28多肽的磁珠(2mg，10mg/ml)的结合，同样缓慢摇晃孵育2h。在含0.1％bsa的pbs洗脱液中将包被的珠子洗4～5次并收集洗脱液。
3、trim28-cit抗体纯化
取1mltrim28-cit-bsa免疫所得血清与2.5mltrim28多肽的磁珠(2mg，10mg/ml)结合，4℃缓慢摇晃孵育2h。用磁铁分离涂带有抗体的珠粒2～3分钟，收集上清液再与trim28-cit多肽的磁珠(2mg，10mg/ml)的结合，同样缓慢摇晃孵育2h。在含0.1％bsa的pbs洗脱液中将包被的珠子洗4～5次并收集洗脱液。
实施例4抗体敏感性检测
斑点杂交：pvdf膜用甲醇活化后，分别滴加2μl不同剂量的trim28和trim28-cit多肽，室温干燥后5％脱脂牛奶封闭1h。分别与1:1000稀释的trim28和trim28-cit抗体浸泡，室温孵育1h。pbst洗涤3次。加入1:10000稀酶标记的羊抗兔抗体，室温摇晃孵育1h，pbst洗涤3次。将膜浸于荧光显色剂中并后期显色，其结果见图1。
如图1所示，当多肽含量低于40ng时，trim28抗体可以特异性的只识别野生型trim28多肽而非瓜氨酸化的多肽；trim28-cit抗体在多肽含量5μg之内只特异性的识别trim28-cit多肽，而不能识别野生型的trim28多肽，因此，制备的trim28-cit抗体具有高效敏感和显著的特异性。
实施例5抗体特异性检测
采用无lif(lif-)培养基诱导小鼠胚胎干细胞分化，在无lif的培养条件下胚胎干细胞从紧密的聚集生长逐渐变成单个延展贴壁生长并开始分化，通过western-blot观察小鼠胚胎干细胞(es)、分化细胞的trim28和trim28-cit的表达情况，其结果见图2，其中，a中lif-：表达trim28，无trim28-cit；lif ：表达trim28和trim28-cit；
b中es：表达trim28和trim28-cit；b中differentiatedcell：表达trim28，无trim28-cit；b中条带1和条带2为两个平行样品，tubulin为westernblot检测时的上样质控。
根据图2的检测结果，可以明显看出trim28与trim28-cit抗体具有很强的特异性。
序列表
<110>四川大学
<120>一种用于产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
protyrserseralagluprohisvalserglymetlysargserarg
151015
serglygluvalcys
20
1.一种用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，其特征在于，包括与载体蛋白连接的短肽，以及其可接受的佐剂；
所述短肽的氨基酸序列为：pyssaephvsgmkcitscitsgevc。
2.根据权利要求1所述的用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，其特征在于，所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
3.根据权利要求1所述的用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，其特征在于，所述载体蛋白为bsa。
4.根据权利要求1所述的用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，其特征在于，所述短肽与载体蛋白连接的连接过程如下：
将短肽溶解于载体蛋白溶液中，加入戊二醛溶液，室温搅拌4～6h后，加入反应终止剂终止反应，静置后于4～6℃取上清，并将其与缓冲液混合，透析70～90h即可；
所述短肽与载体蛋白的重量比为0.05～0.1:0.5～1。
5.根据权利要求4所述的用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，其特征在于，所述反应终止剂为甘氨酸。
6.根据权利要求4所述的用于诱导产生瓜氨酸化trim28特异性抗体的疫苗，其特征在于，所述短肽与载体蛋白的重量比为0.05:1。
7.一种包含权利要求1所述短肽的细胞系。
技术总结