本发明涉及生物医药领域，具体是指一种用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料及其制备方法。
背景技术：
免疫疗法在许多难以治疗的癌症上取得了前所未有的治疗效果。在临床上，免疫检查点阻断疗法对于黑色素瘤，非小细胞肺癌以及三阴性乳腺癌患者效果显著，然而其在临床中面临的主要问题就是极低的治疗响应率。据文献报道，即使是免疫活性最高的黑色素瘤，也仅仅只有20％-50％的患者对该疗法有所响应。最近研究发现，静脉注射经过化学改性或基因编辑后的微生物能够激活天然免疫，从而提高免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤响应率。然而如何克服微生物疗法的毒副作用始终是一大难题。
疫苗，作为一种微生物来源的药物，具有类似病毒的结构和很好的生物安全性。许多证据表明，目前使用的一些非活性的疫苗也能够引发强烈的免疫响应。在临床的2b-3期研究中，9价hpv疫苗对14215位女性的保护率高达92.5％，并且只有2％的人感到轻微的不适，例如疼痛，肿胀，起红疹，皮肤瘙痒等。为了提高免疫治疗的响应率，并且克服微生物疗法的毒副作用，用商业化的疫苗取代微生物与免疫检查点疗法联合，有望实现临床化的高响应性的抗肿瘤免疫治疗。
技术实现要素：
本发明针对免疫检查点阻断疗法响应率低，而目前使用的微生物联合疗法毒副作用大等缺陷，提供了一种生物安全性高，肿瘤靶向性好，治疗响应率高的用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料及其制备方法，利用装载的sirna抑制pdl1蛋白的表达，达到免疫检查点阻断的作用。同时hpv疫苗蛋白激活体内天然免疫，大大增强了免疫检查点阻断疗法的响应率。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供一种用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料，其特征在于：所述改性材料是具有高生物安全性且对肿瘤有治疗效果的改性纳米材料；所述改性材料结构为peg化的hpvl116疫苗蛋白与抑制pdl1蛋白的sirna组装形成的假病毒纳米结构；
所述sirna为靶向cd274基因的sirna，包含以下序列：
sirna1：5'-cuacgggcguuuacuaucatt-3'，其序列如seqidno.1所示；
sirna2：5'-gaagggaaaugcugcccuutt-3'，其序列如seqidno.2所示；
sirna3：5'-gaggauauuugcuggcauutt-3'，其序列如seqidno.3所示。
注意：上述序列中tt(见下划线)是为了稳定sirna的，不参加编码，不显示在序列表文件中。
作为优选方案，所述假病毒纳米结构组装驱动力包括双硫键，疏水作用和静电作用；所述假病毒纳米结构直径为55～65nm；所述假病毒纳米结构适合于系统性静脉给药；所述假病毒纳米结构有良好的肿瘤富集效果。
进一步地，所述改性材料利用hpvl116蛋白和sirna激活机体天然免疫通路，利用sirna下调肿瘤细胞的pdl1蛋白以放大细胞免疫。
第一方面，本发明提供一种上述用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将疫苗蛋白组装体分散在pb缓冲溶液中，滴加1-2mm的还原剂溶液，震荡反应，得到解组装的疫苗蛋白；
(2)在蛋白解组装溶液体系中加入peg2000-nhs和sirna，将得到的混合溶液对pb溶液透析24h；随着还原剂的除去，蛋白会再组装，形成装载有sirna的peg化的假病毒纳米粒子，即得到用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料；
所述疫苗蛋白组装体为hpvl116疫苗蛋白，还原剂为二硫苏糖醇，sirna为靶向cd274基因的sirna。
作为优选方案，所述步骤(1)具体为：将疫苗蛋白组装体分散在pb缓冲液中，加入2mm的还原剂，25℃下震荡1h，调整频率为600-800rmp；所述还原剂为二硫苏糖醇，所述pb缓冲液ph为8.2，并且含有0.166m的nacl；所述纳米粒子在缓冲液中的浓度为1mg/ml；
所述步骤(2)具体为：在蛋白解组装反应体系中加入peg2000-nhs和sirna，涡旋混合均匀后，将混合溶液置入孔径为3.5kda的透析袋中，对pb缓冲溶液透析24h，6h换一次水；所述pb缓冲液ph为8.2，并且含有0.5m的nacl；其中疫苗蛋白与peg2000-nhs的质量比为100:1，疫苗蛋白与sirna的质量比为1:0.5。
本发明中的hpv疫苗改性材料，是由peg化的hpvl116蛋白与抑制pdl1蛋白的sirna共组装形成的假病毒纳米粒子；组装驱动力包括双硫键，静电作用和疏水作用。上述hpv疫苗改性材料为具有高生物安全性的改性纳米材料；改性材料为对肿瘤有治疗效果的改性材料。hpv疫苗改性材料的直径为55～65nm；假病毒纳米结构适合于系统性静脉给药；上述假病毒纳米结构有良好的肿瘤富集效果。上述改性材料利用hpvl1蛋白和sirna激活机体天然免疫通路，利用sirna下调肿瘤细胞的pdl1蛋白以放大细胞免疫。
本发明中上述疫苗蛋白组装体为hpvl116疫苗蛋白，还原剂为二硫苏糖醇，sirna为靶向cd274基因的sirna。
本发明的优点及有益效果如下于：
(1)本发明的hpv疫苗改性材料制备方法简单，稳定性好，原料为hpvl116疫苗和已知序列的sirna，成本低廉，设备要求低。
(2)本发明制备的hpv改性材料由于hpv蛋白与α6整合素的结合作用，能够有效的靶向α6整合素过表达的三阴性乳腺癌。此外，hpv改性材料用于肿瘤治疗结合了微生物免疫疗法和免疫检查点免疫疗法的优点，生物安全性高，能够显著活化天然免疫和细胞免疫，治疗效果好，响应率高，临床转化前景大。
附图说明
图1为合成材料在冷冻透射电镜下的形貌结构图。
图2为合成材料经过不同条件处理后的凝胶电泳图谱。
图3为合成材料活化树突状细胞效果的流式图。
图4为合成材料活化巨噬细胞效果的流式图。
图5为静脉注射装载有三种不同sirna序列的合成材料对肿瘤pdl1蛋白的抑制效果(免疫荧光染色切片图)。
图6为4t1荷瘤小鼠静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)，三天后肿瘤引流淋巴结内树突状细胞的成熟情况统计；
图7为静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)两周后瘤内毒性t细胞的含量；
图8为静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)两周后瘤内m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞的比例。
图9为静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)12h后血清中干扰素的水平。
图10为4t1突变1型乳腺癌荷瘤小鼠在静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)之后的肿瘤生长曲线以及生存曲线。
图11为4t1突变2型乳腺癌荷瘤小鼠在静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)之后的肿瘤生长曲线以及生存曲线。
图12为4t1突变3型乳腺癌荷瘤小鼠在静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)之后的肿瘤生长曲线以及生存曲线。
图13为4t1突变4型乳腺癌荷瘤小鼠在静脉注射合成材料(注射剂量为7.5mg每千克小鼠体重)之后的肿瘤生长曲线以及生存曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明作进一步地详细阐述。
【实施例1】hpv改性材料(sirna1@hpvp)的制备
1、hpv疫苗蛋白的解组装
利用二硫苏糖醇(dtt)作为还原剂，切断hpv疫苗蛋白中的双硫键使hpv疫苗蛋白组装体解组装。具体制备过程如下：将5mg疫苗蛋白组装体分散在装有5ml的pb缓冲溶液(ph8.2,含有0.166m的nacl)的ep管中，缓慢滴加二硫苏糖醇溶液，使还原剂的最终浓度为2mm，并将混合溶液置于恒温振荡器上，25℃震荡1h，得到解组装的疫苗蛋白溶液置于4℃备用。
2、装载sirna以及重组装hpv疫苗蛋白
制备peg化的装载有sirna的假病毒纳米粒子(sirna@hpvp)：在解组装的疫苗蛋白混合溶液中，加入50μg的peg2000-nhs和2.5mg的sirna1序列。将上述混合溶液对pb缓冲溶液(ph8.2,含有0.5m的nacl)透析。每6h换一次透析液，24h后即得到hpv疫苗改性纳米材料。
合成的hpv疫苗改性纳米材料(sirna@hpvp)用冷冻电镜进行表征，结果如图1所示。结果表明重组装的hpv疫苗改性材料仍然保持着类病毒的结构。同时，纳米改性材料中的sirna组分用凝胶电泳进行验证，结果如图2所示。结果表明hpv蛋白载体能够有效的保护sirna，使其不被体内的酶降解。
【实施例2】hpv改性材料(sirna2@hpvp)的制备
本实例中解组装的hpv疫苗蛋白溶液来源于实例1。
1、装载sirna2以及重组装hpv疫苗蛋白
制备peg化的装载有sirna的假病毒纳米粒子(sirna2@hpvp)：在解组装的疫苗蛋白混合溶液中，加入50μg的peg2000-nhs和2.5mg的sirna2序列。将上述混合溶液对pb缓冲溶液(ph8.2,含有0.5m的nacl)透析。每6h换一次透析液，24h后即得到hpv疫苗改性纳米材料。
【实施例3】hpv改性材料(sirna3@hpvp)的制备
本实例中解组装的hpv疫苗蛋白溶液来源于实例1。
1、装载sirna3以及重组装hpv疫苗蛋白
制备peg化的装载有sirna3的假病毒纳米粒子(sirna3@hpvp)：在解组装的疫苗蛋白混合溶液中，加入50μg的peg2000-nhs和2.5mg的sirna3序列。将上述混合溶液对pb缓冲溶液(ph8.2,含有0.5m的nacl)透析。每6h换一次透析液，24h后即得到hpv疫苗改性纳米材料。
【实施例4】体外免疫细胞活化效果
获得鼠源树突状细胞：将健康的babl/c小鼠脱臼处死，在无菌的环境下获取其两条大腿骨，浸泡在70％的医用酒精中3-5min。然后，将腿骨在超净台里用无菌的pbs冲洗干净，再浸泡到rpmi1640培养基中(含有20ng/ml的gm-csf和10ng/ml的il-4)。用灭菌的剪刀镊子剔除骨头上的组织，露出骨髓。用4ml的注射器吸取3ml的培养基，将针尖插进骨缝，对着骨髓反复冲洗3，4遍。将得到的细胞悬浮液过滤(70μm)，分散在六孔板中。每两天换一次新鲜的rpmi1640培养基(含有20ng/ml的gm-csf和10ng/ml的il-4)。第七天的时候，得到分化好的树突状细胞。将所获得的树突状细胞与小鼠单核巨噬细胞白血病(raw267.4)细胞以2×105细胞每孔的密度接种到24孔板中，并于培养箱中孵育24h。然后，向每个孔中加入不同材料，共培养24h。然后，将细胞用胰酶消化下来，用pbs洗涤一次后，用抗体进行染色。染色的条件是4℃，30min，缓慢震荡。染色完成后，将细胞用pbs洗涤两次后，用流式细胞术检测两种细胞的活化情况。
结果如图3和图4所示，图3为sirna@hpvp纳米材料对树突状细胞的活化效果，图4为sirna@hpvp纳米材料对巨噬细胞的活化效果。结果表明，sirna能够增强hpv蛋白的免疫原性，在装载不同sirna序列的hpv疫苗蛋白改性材料中，sirna1@hpvp和sirna2@hpvp的免疫原性大于sirna3@hpvp。
【实施例5】体内pdl1蛋白抑制效果
在7-9周的babl/c雌性小鼠的背面右侧皮下注射4t1细胞(1×106个细胞)，接种4t1肿瘤。当肿瘤生长到大约100mm3时，给小鼠分别静脉注射相同剂量的sirna1@hpvp，sirna2@hpvp和sirna3@hpvp纳米材料。24h后，获取肿瘤组织，通过免疫荧光成像检测肿瘤内pdl1细胞的表达情况。
结果如图5所示，灰度越大，说明荧光越强，pdl1蛋白表达量越高。sirna2@hpvp的pdl1蛋白抑制效果较sirna1@hpvp和sirna3@hpvp要好。其中pbs是标准对照组。
【实施例6】体内免疫细胞活化效果。
体内树突状细胞成熟检测：在7-9周的babl/c雌性小鼠的背面右侧皮下注射4t1细胞(1×106个细胞)，接种4t1肿瘤。在肿瘤接种的第四天，将小鼠随机分成5组，通过尾静脉注射不同的材料：pbs，sirna2，sirna2@hpvp，hpvp和anti-pdl1抗体(apdl1) hpvp(peg化的hpv蛋白重组装体)。三天之后，获取肿瘤引流淋巴结，利用注射器的塑胶端研磨淋巴结组织，将得到的单细胞悬浮液用anti-cd11c，anti-cd80和anti-cd86抗体进行染色。染色条件为4℃，30min，缓慢震荡。染色完成后，细胞用pbs洗涤两次，再用流式细胞术检测。
结果如图6所示，sirna2@hpvp相比于pbs组，明显的促进了树突状细胞的成熟。其效果相较于sirna2，hpvp和apdl1 hpvp要好。说明了sirna和hpv都有天然免疫刺激效果。
体内t细胞和巨噬细胞检测：在7～9周的babl/c雌性小鼠的背面右侧皮下注射4t1细胞(1×106个细胞)，接种4t1肿瘤。在肿瘤接种的第四天，将小鼠随机分成5组，通过尾静脉注射不同的材料：pbs，sirna2，sirna2@hpvp，hpvp和anti-pdl1抗体(apdl1) hpvp。两周之后，将肿瘤组织解剖下来，用含有胶原酶iv(1mg/ml)，dna酶(0.1mg/ml)和透明质酸酶(0.1mg/ml)和2％胎牛血清的rpmi1640培养基于37℃下消化1-2h。将组织消化液用70μm的细胞滤网过滤，离心(400g，5min)和用pbs洗涤。将得到的单细胞悬浮液分成两部分，一部分用anti-cd3，anti-cd4和anti-cd8抗体染色，一部分用anti-cd11b和anti-cd206抗体染色。染色条件为4℃，30min，缓慢震荡。染色完成后，细胞用pbs洗涤两次，再用流式细胞术检测。
结果如图7和图8所示，图7为治疗后肿瘤浸润t细胞的含量，图8为治疗后肿瘤内m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞的比例。sirna2@hpvp相比于pbs组，明显的促进了瘤内t细胞的浸润，并增加了m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞的比例。其效果相较于sirna2，hpvp和apdl1 hpvp要好。说明了sirna2@hpvp能够有效的激活天然免疫和细胞免疫。
【实施例7】体内细胞因子检测。
在7～9周的babl/c雌性小鼠的背面右侧皮下注射4t1细胞(1×106个细胞)，接种4t1肿瘤。给小鼠分别静脉注射相同剂量的pbs，sirna，hpvp和sirna2@hpvp。12h后通过心脏穿刺的方式获取小鼠血液样品，用elisa测量不同组的小鼠血清中ifn-α和ifn-γ含量。
结果如图9所示，柱图从左到右分别为pbs，sirna，hpvp和sirna2@hpvp组。sirna2@hpvp相比于pbs组，明显的促进了fn-α和ifn-γ的分泌，其效果明显好于sirna和hpvp，说明sirna和hpvp都具有天然免疫活化效果。
【实施例8】体内治疗效果。
在7～9周的babl/c雌性小鼠的背面右侧皮下注射不同突变株的4t1细胞(1×106个细胞)，建立四种不同突变表型的4t1肿瘤荷瘤小鼠模型。在肿瘤接种的第四天，将小鼠随机分成3组，通过尾静脉注射不同的材料：pbs，sirna2@hpvp paclitaxel和apdl1 paclitaxel。在治疗过程中每两天量一次肿瘤体积，并记录小鼠生存情况。
结果如图10-图13所示，图10-图13为四种不同4t1肿瘤荷瘤小鼠接受治疗的肿瘤生长曲线和生存情况。相较于pbs组，sirna2@hpvp paclitaxel治疗对于四种荷瘤模型种均有较好的抑瘤效果，而apdl1 paclitaxel治疗对四种模型的小鼠治疗效果差，几乎不延长小鼠存活时间。说明sirna2@hpvp paclitaxel疗法具有很好的抗肿瘤效果和高的治疗响应率。
综上所述，本发明提供的hpv疫苗蛋白改性纳米材料首次加工改造商业化成熟的hpv疫苗，并装载抑制pdl1蛋白的sirna，通过peg修饰从而组装成假病毒纳米粒子，这是一种新的具有良好的生物安全性和高的治疗响应率的抗肿瘤纳米材料。首次通过hpv装载抑制pdl1蛋白的sirna，大大活化了肿瘤部位的天然免疫和细胞免疫，提高了治疗效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利的保护范围之内。
序列表
<110>武汉大学
<120>用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料及其制备方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>rna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>1
cuacgggcguuuacuauca19
<210>2
<211>19
<212>rna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>2
gaagggaaaugcugcccuu19
<210>3
<211>19
<212>rna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>3
gaggauauuugcuggcauu19
1.一种用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料，其特征在于：所述改性材料是具有高生物安全性且对肿瘤有治疗效果的改性纳米材料；所述改性材料结构为peg化的hpvl116疫苗蛋白与抑制pdl1蛋白的sirna组装形成的假病毒纳米结构；
所述sirna为靶向cd274基因的sirna，包含以下序列：
sirna1：5'-cuacgggcguuuacuaucatt-3'，其序列如seqidno.1所示；
sirna2：5'-gaagggaaaugcugcccuutt-3'，其序列如seqidno.2所示；
sirna3：5'-gaggauauuugcuggcauutt-3'，其序列如seqidno.3所示。
2.根据权利要求1上述用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料，其特征在于：所述假病毒纳米结构组装驱动力包括双硫键，疏水作用和静电作用；所述假病毒纳米结构直径为55～65nm；所述假病毒纳米结构适合于系统性静脉给药；所述假病毒纳米结构有良好的肿瘤富集效果。
3.根据权利要求1或2上述用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料，其特征在于：所述改性材料利用hpvl116蛋白和sirna激活机体天然免疫通路，利用sirna下调肿瘤细胞的pdl1蛋白以放大细胞免疫。
4.一种制备如权利要求1或2所述用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将疫苗蛋白组装体分散在pb缓冲溶液中，滴加1-2mm的还原剂溶液，震荡反应，得到解组装的疫苗蛋白；
(2)在蛋白解组装溶液体系中加入peg2000-nhs和sirna，将得到的混合溶液对pb溶液透析24h；随着还原剂的除去，蛋白会再组装，形成装载有sirna的peg化的假病毒纳米粒子，即得到用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料；
所述疫苗蛋白组装体为hpvl116疫苗蛋白，还原剂为二硫苏糖醇，sirna为靶向cd274基因的sirna。
5.根据权利要求4上述用于高响应性抗肿瘤免疫疗法的hpv疫苗改性材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)具体为：将疫苗蛋白组装体分散在pb缓冲液中，加入2mm的还原剂，25℃下震荡1h，调整频率为600-800rmp；所述还原剂为二硫苏糖醇，所述pb缓冲液ph为8.2，并且含有0.166m的nacl；所述纳米粒子在缓冲液中的浓度为1mg/ml；
所述步骤(2)具体为：在蛋白解组装反应体系中加入peg2000-nhs和sirna，涡旋混合均匀后，将混合溶液置入孔径为3.5kda的透析袋中，对pb缓冲溶液透析24h，6h换一次水；所述pb缓冲液ph为8.2，并且含有0.5m的nacl；其中疫苗蛋白与peg2000-nhs的质量比为100:1，疫苗蛋白与sirna的质量比为1:0.5。
技术总结