本发明涉及生物医药研究领域，特别是涉及人ube2s基因的用途及相关产品。
背景技术：
：脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤之一，约占原发性中枢神经系统肿瘤的44％，复发率高，预后差。尤其胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)总生存期(os)为16-18个月，5年生存率约为5％左右，其5年病死率仅次于胰腺癌和肺癌，位列第三。目前，脑胶质瘤的发病机制尚不明确。流行病学研究发现电离辐射(包括放射治疗和暴露于x射线、扫描和显像等低剂量辐射)人群患脑胶质瘤的风险显著增高。手术切除、放射治疗、化疗等手段是目前临床治疗脑胶质瘤的重要方法。近年来，抗肿瘤新生血管、免疫治疗、病毒治疗等新方法也在积极探索中，但是可选择的药物仍然非常有限。由于缺乏有效的模型，脑胶质瘤信号传导通路的复杂性，缺乏有效的靶点，脑胶质瘤的异质性、血脑屏障的存在等原因，导致靶向药物的选择非常困难。目前，脑胶质瘤靶向药物治疗主要针对egfr、brafv600、drd2、met等基因突变及相应的靶向药物。然而，大部分脑胶质瘤患者在治疗后快速复发，对患者及其家庭和社会影响巨大。因此，提高脑胶质瘤诊疗技术水平及改善预后，仍然是原发性中枢神经系统肿瘤中主要关注的焦点和巨大挑战。随着近年来对胶质瘤分子特征研究的深入，越来越多的研究表明胶质瘤的分子特征以及其相关的信号通路参与了胶质瘤的发生发展。对胶质瘤的增殖、侵袭以及转移等有重要影响，对这些分子特征进行深入的分析有助于我们在临床上对不同分型的胶质瘤患者进行个体化治疗，从而改善患者的预后有重要意义。泛素化过程由e1泛素激活酶、e2泛素结合酶和e3泛素连接酶介导。e3连接酶介导e2活性半胱氨酸上泛素向特定靶标蛋白赖氨酸的转移。泛素结合酶e2s(ubiquitin-conjugatingenzymee2s，ube2s)是将泛素链延伸至26s蛋白酶体的关键，目前未见ube2s与胶质瘤相关的报道。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人ube2s基因的用途及相关产品，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供人ube2s基因作为靶标在制备胶质瘤治疗药物中的用途。所述人ube2s基因作为靶标在制备胶质瘤治疗药物具体是指：将ube2s基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人ube2s基因表达的药物作为胶质瘤治疗备选药物。如本发明所述的ube2s基因小分子干扰rna(sirna)即是以人ube2s基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制胶质瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将ube2s基因作为作用对象。所述胶质瘤治疗药物为能够特异性抑制ube2s基因的转录或翻译，或能够特异性抑制ube2s蛋白的表达或活性的分子，从而降低胶质瘤细胞中ube2s基因的表达水平，达到抑制胶质瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。所述通过ube2s基因制备获得的胶质瘤治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链rna(dsrna)、核酶、核糖核酸内切酶iii制备的小干扰rna或者短发夹rna(shrna)。所述胶质瘤治疗药物的施用量为足够降低人ube2s基因的转录或翻译，或者足够降低人ube2s蛋白的表达或活性的剂量。以使人ube2s基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。采用前述胶质瘤治疗药物治疗胶质瘤的方法，主要是通过降低人ube2s基因的表达水平抑制胶质瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人ube2s基因表达水平的物质给药于患者。在一种实施方式中，所述ube2s基因的靶标序列如seqidno：1和seqidno：2所示。具体分别为：5’-gctctcttcctccttccac-3’，5’-ggctctcttcctccttcca-3’。本发明的第二方面，提供ube2s抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：治疗胶质瘤；抑制胶质瘤细胞的增殖速率；促进胶质瘤细胞凋亡；抑制胶质瘤生长。所述产品必然包括ube2s抑制剂，并以ube2s抑制剂作为前述功效的有效成分。所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为ube2s抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。亦即，ube2s抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。所述ube2s抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。如本发明实施例列举的，所述ube2s抑制剂可以为降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链rna或shrna。本发明的第三方面，提供了一种治疗胶质瘤的方法，为向对象施用ube2s抑制剂。所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的胶质瘤细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述胶质瘤细胞可以为离体胶质瘤细胞。所述对象可以是罹患胶质瘤的患者或者期待治疗的胶质瘤的个体。或者所述对象为胶质瘤患者或者期待治疗胶质瘤的个体的离体胶质瘤细胞。所述ube2s抑制剂可以在接受胶质瘤治疗前、中、后向对象施用。本发明第四方面公开了一种降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链rna或shrna。其中，所述双链rna中含有能够与ube2s基因杂交的核苷酸序列；所述shrna中含有能够与ube2s基因杂交的核苷酸序列。进一步的，所述双链rna包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成rna二聚体，并且所述第一链的序列与ube2s基因中的靶序列基本相同。所述ube2s基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默ube2s基因表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mrna片段所对应的ube2s基因中的片段。进一步的，所述双链rna的靶序列如seqidno：1和seqidno：2所示。更进一步的，所述双链rna第一链的序列如seqidno：3和seqidno：4所示。具体分别为5’-gcucucuuccuccuuccac-3’，5’-ggcucucuuccuccuucca-3’。进一步的，所述双链rna为小干扰rna(sirna)。seqidno：3和4为分别以seqidno:1和2所示的序列为rna干扰靶序列设计的、针对人ube2s基因的小干扰rna的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该sirna可以起到特异性沉默胶质瘤细胞中内源ube2s基因表达的作用。所述shrna包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与ube2s基因中的靶序列基本相同。进一步的，所述shrna的靶序列如seqidno：1和2所示。所述shrna经酶切加工后可成为小干扰rna(sirna)进而起到特异性沉默胶质瘤细胞中内源ube2s基因表达的作用。进一步的，所述shrna的茎环结构的序列可选自以下任一：uucaagaga、aug、ccc、uucg、ccacc、ctcgag、aagcuu和ccacacc。更进一步的，所述shrna的序列如seqidno：5和seqidno：6所示。具体分别为5’-gcucucuuccuccuuccaccucgagguggaaggaggaagagagc-3’(seqidno：5)，5’-ggcucucuuccuccuuccacucgaguggaaggaggaagagagcc-3’(seqidno：6)。进一步的，所述ube2s基因来源于人。本发明第五方面，公开了一种ube2s基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的shrna的基因片段，能表达所述shrna。所述的ube2s基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人ube2s基因shrna的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述ube2s基因干扰核酸构建体为ube2s基因干扰慢病毒载体。本发明公开的ube2s基因干扰慢病毒载体是将编码前述ube2s基因shrna的dna片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述ube2s基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染胶质瘤细胞，进而转录出本发明所述shrna，通过酶切加工等步骤，最终获得所述sirna，用于特异性沉默ube2s基因的表达。进一步的，所述ube2s基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码胶质瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(gfp)。进一步的，所述慢病毒载体可以选自：gv115、plko.1-puro、plko.1-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tgfp、plko.1-cmv-neo、plko.1-neo、plko.1-neo-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tagcfp、plko.1-puro-cmv-tagyfp、plko.1-puro-cmv-tagrfp、plko.1-puro-cmv-tagfp635、plko.1-puro-ubc-turbogfp、plko.1-puro-ubc-tagfp635、plko-puro-iptg-1xlaco、plko-puro-iptg-3xlaco、plp1、plp2、plp/vsv-g、pentr/u6、plenti6/block-it-dest、plenti6-gw/u6-laminshrna、pcdna1.2/v5-gw/lacz、plenti6.2/n-lumio/v5-dest、pgcsil-gfp或plenti6.2/n-lumio/v5-gw/lacz中的任一。本发明实施例具体列举了以gv115(购自吉凯基因)为载体构建的人ube2s基因干扰慢病毒载体，命名为gv115-ube2s-sirna-1和gv115-ube2s-sirna-2。本发明的ube2s基因sirna可用于抑制胶质瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗胶质瘤的药物或制剂。ube2s基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述ube2s基因sirna。当用作治疗胶质瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明第六方面，公开了一种ube2s基因干扰慢病毒，由前述ube2s基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染胶质瘤细胞并产生针对ube2s基因的小分子干扰rna，从而抑制胶质瘤细胞的增殖。该ube2s基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗胶质瘤的药物。本发明的第七方面，提供前述核酸分子，或前述ube2s基因干扰核酸构建体，或前述ube2s基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗胶质瘤的药物，或用于制备降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的试剂盒。所述预防或治疗胶质瘤的药物的应用为胶质瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内胶质瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内胶质瘤时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述胶质瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述胶质瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。所述方法的对象可以为人。本发明的第八方面，提供一种用于预防或治疗胶质瘤的组合物，其有效物质含有：前述的核酸分子；和/或，前述ube2s基因干扰核酸构建体；和/或，前述ube2s基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述组合物可以为药物组合物。当所述组合物用于预防或治疗对象体内胶质瘤时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述胶质瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述胶质瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。综上所述，本发明设计了针对人ube2s基因的rnai靶点序列，构建相应的ube2srnai载体，其中rnai载体gv115-gfp-ube2s-sirna-1和gv115-gfp-ube2s-sirna-2能够显著下调ube2s基因在mrna水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为lv)作为基因操作工具携带rnai载体gv115-gfp-ube2s-sirna-1和gv115-gfp-ube2s-sirna-2能够靶向地将针对ube2s基因的rnai序列高效导入胶质瘤细胞，降低ube2s基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的ube2s基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。如上所述，本发明具有以下有益效果：本发明经过广泛而深入的研究发现，采用rnai方法下调人ube2s基因的表达后可有效地抑制胶质瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡，可以有效地控制胶质瘤的生长进程。本发明提供的sirna或者包含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制胶质瘤细胞的增殖速率、促进胶质瘤细胞凋亡、抑制胶质瘤细胞克隆、抑制胶质瘤生长，从而治疗胶质瘤，为胶质瘤治疗开辟新的方向。附图说明图1显示为ube2s在胶质瘤组织中表达水平图。图2显示为westernblot检测ube2s敲降后的u87和u251稳转细胞系中ube2s的表达水平图。图3-1显示为流式细胞仪检测ube2s敲降后的u87稳转细胞系凋亡情况的峰图。图3-2显示为流式细胞仪检测ube2s敲降后的u87稳转细胞系凋亡情况的统计图。图4显示为ube2s敲降后的u87稳转细胞系相对于对照组细胞的增殖曲线。图5-1显示为ube2s敲降后的u87稳转细胞系的克隆形成照片。图5-2显示为ube2s敲降后的u87稳转细胞系的克隆形成统计图。图6-1显示为ube2s基因敲降的u87稳转细胞系体内形成的肿瘤大小。图6-2显示为ube2s基因敲降的u87稳转细胞系体内形成的肿瘤体积(左图)和重量(右图)。具体实施方式本发明从细胞功能学角度出发证实ube2s基因在胶质瘤发生中的作用。通过构建目的基因shrna慢病毒后转染胶质瘤细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组胶质瘤细胞系内mrna及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡等检测，结果显示shrna组与对照组对比，shrna组胶质瘤细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高。ube2s抑制剂指对于ube2s具有抑制效果的分子。对于ube2s具有抑制效果包括但不限于：抑制ube2s的表达或活性。抑制ube2s活性是指使ube2s活力下降。优选地，相比抑制前，ube2s活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。抑制ube2s表达具体的可以是抑制ube2s基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使ube2s的基因不转录，或降低ube2s的基因的转录活性，或者使ube2s的基因不翻译，或降低ube2s的基因的翻译水平。本领域技术人员可以使用常规方法对ube2s的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰rna等。ube2s的基因表达的抑制可以通过pcr或westernblot检测表达量验证。优选地，与野生型相比，ube2s基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地ube2s基因完全没有表达。小分子化合物本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。制备预防或治疗胶质瘤的药物可以利用降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的核酸分子；和/或，ube2s基因干扰核酸构建体；和/或，ube2s基因干扰慢病毒，作为有效成分，制备预防或治疗胶质瘤的药物。通常，所述药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1ube2s在胶质瘤组织中表达上调首先检测ube2s在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达水平。1.总rna抽提(使用上海普飞公司trizol试剂盒抽提)(1)收取样品，trizol裂解。细胞样品：收集细胞(6孔板80％细胞密度)，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mltrizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mlep管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上，将组织样品切割成约3mm×3mm×3mm大小，置于装有1mltrizol裂解液的1.5mlep管中。将超细匀浆机工作头浸入trizol裂解液中5-10s灭活rna酶后，组织研磨；研磨后4℃，5000rpm3min离心，弃沉淀，吸取上清移至新的1.5mlep管中。(2)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒ep管15s，室温静置10min。(3)4℃、12800rpm，离心15min。(4)吸取上层液体移至新的1.5mlep管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min。(5)4℃、12800rpm离心12min后，弃上清。(6)加入1ml、75％乙醇(用depc水新鲜配制)，洗涤沉淀。(7)4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清。(8)4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，室温干燥。(9)待rna沉淀基本透明时，加入rnase-free水(加入体积视rna沉淀量而定)至完全溶解，nanodrop2000/2000c分光光度计分析测定所抽提rna的浓度及质量。2.反转录获得cdna(使用promegam-mlv试剂盒)(1)将1μloligodt(0.5μg/μl)和2.0μgtotalrna加入到pcr小管中，补充rnase-freeh2o至10μl；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使oligodt和模板退火。(2)在上述混合物中，按表1-1的比例配制反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心表1-1反转录体系试剂每管加入量5×rtbuffer4μl10mmdntps2μlrnasin(40u/μl)0.4μlm-mlv-rtase(200u/μl)1μlrnase-freeh2o2.6μl注:dntps是datp,dctp,dgtp,dttp的混合，浓度为10mm(3)上述体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min使rt酶失活，将得到的rt产物--cdna置于-20℃保存备用。3.real-timepcr检测(1)按表1-2下列比例配置反应体系(20μl体系)：表1-2real-timepcr体系试剂每管加入量sybrpremixextaq10μl上游引物(2.5μm)0.5μl下游引物(2.5μm)0.5μlcdna1μlrnase-freeh2o8μl(2)两步法进行real-timepcr，并制作熔解曲线，程序如下：表1-3real-timepcr程序4.数据分析相对定量分析f＝2-δδct，δct＝目的基因ct值-内参基因ct值；-δδct＝nc组δct平均值-各样品δct值；2-δδct反映各样品相对nc组样品目的基因的相对表达水平。结果如图1所示，本实验室74例胶质瘤组织及正常脑组织mrna表达数据表明，ube2s在胶质瘤组织中的表达水平显著高于正常脑组织中的表达(p<0.0001)。实施例2ube2s稳定敲降细胞系的构建我们筛选了2个knockdown敲除靶点(seqidno：1和2)，利用shrna慢病毒根据侵染复数值感染胶质瘤细胞系u87细胞系。1.ube2s基因rna干扰慢病毒载体构建和包装以ube2s基因为模板，设计rna干扰靶点序列(seqidno：1和2)，构建目的基因rna干扰慢病毒载体。完成rna干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链dnaoligo，退火配对产生双链dna；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，pcr鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提。(1)rna干扰靶点设计及双链dnaoligo制备根据rna干扰序列设计原则，以ube2s基因为模板，设计多个19-21ntrna干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取psc-14013和psc-14014作为干扰靶点序列：psc-14013：5’-gctctcttcctccttccac-3’(seqidno：1)，psc-14014：5’-ggctctcttcctccttcca-3’(seqidno：2)，根据已选靶点序列分别设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在shrna干扰序列正链3’端添加ttttt终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成dnaoligo，针对psc-14013的dnaoligo正义链和反义链序列分别如seqidno：7和seqidno：8所示，针对psc-14014的dnaoligo正义链和反义链序列分别如seqidno：9和seqidno：10所示：正义链：ccgggggctctcttcctccttccacctcgaggtggaaggaggaagagagccctttttg(seqidno：7)反义链：aattcaaaaagggctctcttcctccttccacctcgaggtggaaggaggaagagagccc(seqidno：8)正义链：ccggtgggctctcttcctccttccactcgagtggaaggaggaagagagcccatttttg(seqidno：9)反义链：aattcaaaaatgggctctcttcctccttccactcgagtggaaggaggaagagagccca(seqidno：10)双链dnaoligo制备：将合成的单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μm)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。(2)线性化载体制备按照neb说明书配制50μl反应体系，使用agei和ecori双酶切gv115载体使其线性化。表2-1酶切体系试剂使用量vector(1μg/μl)2μlcutsmartbuffer5μlagei(10u/μl)1μlecori(10u/μl)1μlh2oupto50μl37℃(最适温度)反应1h，之后切胶回收目的片段。①电泳上样说明泳道1：1kbmarker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp泳道2：agei和ecori双酶切线性化后的载体质粒泳道3：没有酶切的载体质粒(3)rna干扰慢病毒载体构建①连接按照fermentast4dnaligase说明书配制20μl反应体系(表2-2)，将双链dnaoligo与线性化的载体相连。表2-2连接体系试剂使用量linearizedvector(100ng/μl)1μlinsert(100ng/μl)1μl10×t4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase1μlh2oupto20μl于16℃反应1h-3h，回收连接产物，之后分别进行转化实验。②转化将回收的连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：1)将10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。2)42℃热激90sec，冰浴2min。3)加入500μl无抗生素的lb液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1hr。4)取150μl菌液均匀涂抹在含有amp的lb固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。③阳性克隆的pcr鉴定1)引物表2-3pcr鉴定引物序列引物名称引物序列(5’→3’)鉴定引物-fcctatttcccatgattccttcataseqidno.11鉴定引物-rgtaatacggttatccacgcgseqidno.122)pcr扩增按表2-4配制20μlpcr反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行pcr扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。pcr结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序。表2-4pcr反应体系试剂使用量taqplusdnapolymerase0.2μl10xbuffer2μl鉴定引物-f0.4μl鉴定引物-r0.4μl模板-h2oupto20μl④阳性克隆测序结果分析以鉴定引物-f进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆即为针对seqidno：1和seqidno：2的rnai的表达载体，分别命名为gv115-ube2s-sirna-1和gv115-ube2s-sirna-2。(4)质粒抽提将测序正确的菌液转接于150ml含amp抗生素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照endofreemaxiplasmidkit说明书提取质粒，质检合格的质粒进行病毒包装。(5)质粒转染与慢病毒收获1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；2)转染前2h更换为无血清培养基；3)向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(gv载体质粒20μg、phelper1.0载体质粒15μg、phelper2.0载体质粒10μg，不相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；4)混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中，混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；6)缓慢加入含10％血清的培养基20ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48-72h。(6)慢病毒浓缩与纯化1)根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可计为0h的293t细胞上清液；2)于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；4)分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；5)离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；6)经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，上清分装待用。2.慢病毒感染胶质瘤u87细胞系培养生长状态良好的目的细胞u87(moi＝5)，将其以合适的细胞数接种在六孔板中。第二天待细胞密度汇合到50％-70％时，弃掉旧培养基，用1×pbs清洗细胞3次，每孔加2ml10％胎牛血清的新鲜培养基，然后每孔加入2μl毒液感染。感染48h-72h于荧光显微镜下观察gfp表达情况，当荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80％左右，使用含20μg/mlpuromycin的选择性培养基筛选48h，即可得到稳定敲降ube2s的细胞株(感染gv115-ube2s-sirna-1慢病毒载体的细胞记为shube2s#1，感染gv115-ube2s-sirna-2慢病毒载体的细胞记为shube2s#1)，收集细胞汇合度70％-80％左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。实施例3western–blot检测稳转细胞系中ube2s的表达水平1.细胞总蛋白抽提1)收集稳转细胞样品，取适当量的ripa裂解液(碧云天，p0013c)，使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。2)加入适当量的ripa裂解液，冰上裂解10-15min。细胞刮刮下细胞转移入新的ep管中，然后超声破碎细胞(40w共20b次，每次1s，间隔2s)。3)4℃、12000g，离心15min，取上清用bcaproteinassaykit(厂家：碧云天，货号：p0010s)测定蛋白浓度。4)加入新的裂解液将每个样品蛋白浓度调为一致，一般为2μg/μl。然后加入1/5体积的6×loddingbuffer混匀，100℃金属浴煮10min，短暂离心后-80℃保存备用。2.sds-page1)制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如表3-1、表3-2、表3-3所示：表3-1sds-page分离胶(8ml体系)分离胶(8ml体系)8％9％10％12％13％15％h2o3.73.43.12.62.31.830％page2.12.42.73.23.541.5mol/ltris(ph8.8)22222210％sds0.080.080.080.080.080.0810％aps0.080.080.080.080.080.08temed0.0050.0040.0040.0040.0040.004表3-2sds-page分离胶(10ml体系)分离胶(10ml体系)8％9％10％12％13％15％h2o4.64.343.32.92.330％page2.733.344.451.5mol/ltris(ph8.8)2.52.52.52.52.52.510％sds0.10.10.10.10.10.110％aps0.10.10.10.10.10.1temed0.0060.0040.0040.0040.0040.004表3-3sds-page浓缩胶(不同体系)浓缩胶(5％)3ml4ml5mlh2o2.12.73.430％page0.50.670.831.0mol/ltris(ph6.8)0.380.50.6310％sds0.030.040.0510％aps0.030.040.05temed0.0030.0040.0052)上样：胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。3)电泳：浓缩胶80ma，20min；分离胶120ma，1h。3.免疫印迹(湿转)电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300ma恒流条件下电转150min，将蛋白转移到pvdf膜上。4.抗体杂交：1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的tbst溶液)室温封闭pvdf膜1h或4℃过夜。2)一抗孵育：用封闭液按照1:10000稀释ube2s(厂家：abcam，货号：ab228848)一抗，1:1000稀释β-actin(厂家：abcam，货号：ab8227)，然后与封闭好的pvdf膜室温孵育2h或4℃过夜，并用tbst洗膜4次，每次8min。3)二抗孵育：用封闭液按照1:2000稀释山羊抗兔iggh&l二抗(厂家：abcam，货号：ab205718)，室温下孵育pvdf膜1.5h，并用tbst洗膜4次，每次8min。5.显影：1)使用eclwesternblottingsubstrate(厂家：thermoscientific,货号32106：)试剂盒进行蛋白质条带显影。将试剂盒中a液和b液按1:1比例混合颠倒混匀，放置数分钟后可使用。2)将pvdf膜取出，吸水纸擦干，将ab液混合液均匀涂在pvdf膜上，小心将膜置于化学发光成像仪(imagequantlas4000)中显影。结果如图2所示，与对照细胞相比，knockdown细胞系中ube2s表达显著降低。实施例4流式细胞仪检测ube2s对胶质瘤细胞凋亡的影响将ube2s稳定敲降细胞及对照过表达细胞接种至6孔板中，待各实验组6孔板细胞生长至覆盖率约为70％时，胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，每组设三个复孔。1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的d-hanks洗涤细胞沉淀。200μl1×bindingbuffer(ebioscience，88-8007-74)重悬细胞沉淀。加入10μlannexinv-apc染色，室温避光10-15min。根据细胞量，补加400-800μl1×bindingbuffer，流式细胞仪进行检测。结果如图3-1和3-2所示，胶质瘤细胞u87中稳定敲降ube2s能够显著提高u87细胞凋亡比例，提示ube2s与胶质瘤细胞的凋亡显著相关。实施例5cck-8检测ube2s对胶质瘤细胞体外增殖的影响采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(cellcountingkit-8,cck-8)来检测ube2s稳定敲降细胞系细胞增殖的能力。将生长状态良好的ube2s稳定敲降胶质瘤细胞系经常规胰蛋白酶消化计数，以4000cells/well密度接种于96孔板。24h后待细胞贴壁，按照每孔10μl的量加入cck-8试剂，37℃孵育1.5小时后，用酶标仪测定波长450nm处的吸光度od值，绘制细胞生长4天的生长曲线。实验结果如图4所示，在胶质瘤细胞u87中稳定敲降ube2s能够显著抑制细胞的增殖能力。实施例6克隆形成实验检测ube2s对胶质瘤细胞体外增殖的影响克隆形成实验也是测定细胞增殖能力的一种常用实验方法。因此我们采用该实验方法进一步检测ube2s表达对细胞增殖能力的影响。首先将处于对数生长期的稳定敲降ube2s细胞及对照细胞接种至12孔板中。在37℃培养箱培养2周左右即可出现肉眼可见的细胞集落，随后经过pbs清洗，甲醇固定，结晶紫染色计数。1)取对数生长期的细胞，采用常规胰蛋白酶消化方法离心收集细胞，制成细胞悬液。2)反复吹打细胞悬液，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95％以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每孔1000个细胞的浓度分别接种到12孔板中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。4)根据不同的实验目的对细胞进行相应的处理，处理结束后换成正常的完全培养基。5)将培养板置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养2-3周，中间根据培养液ph变化适时更换新鲜培养液。6)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，pbs溶液小心浸洗2-3次。7)甲醇固定20分钟，0.5％结晶紫染色20分钟。流水缓慢洗去染液，蒸馏水冲洗，空气干燥。8)倒置显微镜下观察，计数细胞个数在50个以上的克隆，统计各孔细胞集落形成数目，并拍照记录。结果如图5-1和5-2所示，胶质瘤细胞u87中稳定敲降ube2s能够显著抑制细胞的克隆形成能力。实施例7ube2s对胶质瘤细胞体内增殖的影响在体外细胞增殖实验的基础上，我们进一步利用裸鼠皮下荷瘤瘤实验来探究敲降ube2s基因对胶质瘤细胞体内生长能力的影响。本研究所用裸鼠品系均为balb/c裸鼠，5周龄，体重16–20g，所有裸鼠均为雌性，购自于北京华阜康生物科技股份有限公司。培养条件为恒温(25℃–27℃)，恒湿(40％–50％)。饲养裸鼠所需所有材料包括鼠笼、垫料、饲料和水均经过高温高压灭菌。整个饲养过程完全按照国家规定的spf级实验裸鼠的饲养管理制度标准进行。1)将5周龄左右的balb/c雌性裸鼠随机分组，每组10只。2)将处于对数生长期的稳定敲降ube2s细胞和未敲降对照细胞常规胰蛋白酶消化。800g离心5分钟，弃上清，收集细胞。向离心管中加入适量无血清rpmi1640培养基重悬细胞，反复吹打细胞悬液，使细胞充分分散。3)细胞记数，并用无血清rpmi1640培养基调节细胞浓度为1×107个/ml，待用。4)在spf级动物房超净台无菌条件下进行肿瘤细胞的接种实验：使用1ml无菌注射器吸取100μl细胞悬液，分别接种对照组和实验组细胞悬液于裸鼠腋下。5)密切观察裸鼠的成瘤情况，并记录每只裸鼠的出瘤时间。每周用游标卡尺测量裸鼠移植瘤大小。肿瘤体积按下列公式计算：v＝π/6×l×w(l，长径；w，短径)。6)5周后使用co2处死裸鼠，将肿瘤取下，测量瘤体大小后拍照备用。结果如图6-1和6-2所示，在胶质瘤细胞u87中稳定敲降ube2s能够显著抑制胶质瘤细胞的体内增殖能力。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>新疆医科大学第三附属医院<120>人ube2s基因的用途及相关产品<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gctctcttcctccttccac19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggctctcttcctccttcca19<210>3<211>19<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcucucuuccuccuuccac19<210>4<211>19<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggcucucuuccuccuucca19<210>5<211>44<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcucucuuccuccuuccaccucgagguggaaggaggaagagagc44<210>6<211>44<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggcucucuuccuccuuccacucgaguggaaggaggaagagagcc44<210>7<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccgggggctctcttcctccttccacctcgaggtggaaggaggaagagagccctttttg58<210>8<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aattcaaaaagggctctcttcctccttccacctcgaggtggaaggaggaagagagccc58<210>9<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ccggtgggctctcttcctccttccactcgagtggaaggaggaagagagcccatttttg58<210>10<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aattcaaaaatgggctctcttcctccttccactcgagtggaaggaggaagagagccca58<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cctatttcccatgattccttcata24<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gtaatacggttatccacgcg20当前第1页1 2 3
技术特征：1.人ube2s基因作为靶标在制备胶质瘤治疗药物中的用途。
2.ube2s抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
治疗胶质瘤；
抑制胶质瘤细胞的增殖速率；
促进胶质瘤细胞凋亡；
抑制胶质瘤生长。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述ube2s抑制剂是指对ube2s具有抑制效果的分子；
2)所述ube2s抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一；
3)所述ube2s抑制剂选自双链rna、shrna、抗体或小分子化合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述shrna或双链rna靶序列如seqidno：1和seqidno：2所示；
2)所述双链rna包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成rna二聚体，所述第一链的序列如seqidno：3和seqidno：4所示；
3)所述shrna的核苷酸序列如seqidno：5和seqidno：6所示。
5.一种降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：
a.双链rna，所述双链rna中含有能够与ube2s基因杂交的核苷酸序列；或者
b.shrna，所述shrna中含有能够与ube2s基因杂交的核苷酸序列；
其中，所述双链rna包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成rna二聚体，并且所述第一链的序列与ube2s基因中的靶序列基本相同；所述shrna包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与ube2s基因中的靶序列基本相同。
6.根据权利要求5所述的降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的核酸分子，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述shrna或双链rna靶序列如seqidno：1和seqidno：2所示；
2)所述双链rna为sirna，所述sirna的第一链的序列如seqidno：3和seqidno：4所示；
3)所述shrna的核苷酸序列如seqidno：5和和seqidno：6所示。
7.一种ube2s基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求5-6任一权利要求所述核酸分子中的shrna的基因片段，能表达所述shrna。
8.一种ube2s基因干扰慢病毒，由权利要求7所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
9.根据权利要求5-6任一权利要求所述的核酸分子，或权利要求7所述ube2s基因干扰核酸构建体，或权利要求8所述的ube2s基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗胶质瘤的药物，或用于制备降低胶质瘤细胞中ube2s基因表达的试剂盒。
10.一种用于预防或治疗胶质瘤的组合物，其有效物质含有：
权利要求5-6任一权利要求所述的核酸分子；和/或，权利要求7所述ube2s基因干扰核酸构建体；和/或，权利要求8所述的ube2s基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
技术总结本发明涉及生物医药研究领域，特别是涉及人UBE2S基因作为靶标在制备胶质瘤治疗药物中的用途。本发明经过广泛而深入的研究发现，采用RNAi方法下调人UBE2S基因的表达后可有效地抑制胶质瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡，可以有效地控制胶质瘤的生长进程。本发明提供的shRNA或者包含该shRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制胶质瘤细胞的增殖速率、促进胶质瘤细胞凋亡、抑制胶质瘤细胞克隆、抑制胶质瘤生长，从而治疗胶质瘤，为胶质瘤治疗开辟新的方向。
技术研发人员：郭文佳;董晓刚
受保护的技术使用者：新疆医科大学第三附属医院
技术研发日：2020.03.10
技术公布日：2020.06.05
