本发明属于生物医药技术领域，具体涉及核糖体s6激酶rsk在制备治疗或修复周围神经损伤药物中的应用。
背景技术：
周围神经损伤后神经元内在再生能力的激活受多种因素影响，其中包括神经元胞内蛋白的翻译合成，寻求关键分子调控神经元内与轴突再生相关蛋白的翻译合成，将有助于周围神经损伤后再生修复。核糖体s6激酶rsk（p90ribosomals6kinase）作为mapk信号通路的下游之一，参与多种生物学过程，并可通过多种途径调节蛋白翻译的起始和延伸。然而周围神经损伤后drg组织中rsk的表达及其在轴突再生中的作用鲜有研究。
技术实现要素：
本发明目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供核糖体s6激酶rsk在制备治疗或修复周围神经损伤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供核糖体s6激酶rsk在制备治疗或修复周围神经损伤药物中的应用。
进一步的，所述核糖体s6激酶rsk作为分子干预靶点，通过下调或干扰核糖体s6激酶rsk抑制drg轴突生长。
进一步的，所述修复周围神经损伤药物包括体外rsk特异性抑制剂sl0101或rsk1和rsk2的干扰病毒中的一种。
优选的，所述修复周围神经损伤药物包括体外rsk特异性抑制剂sl0101。
优选的，所述修复周围神经损伤药物包括rsk1和rsk2的干扰病毒。
进一步的，所述周围神经损伤是坐骨神经损伤。
本发明的实施例还提供一种用于治疗或修复周围神经损伤的药物，其特征在于，至少包括体外rsk特异性抑制剂sl0101或rsk1和rsk2的干扰病毒中的一种。
进一步的，所述药物还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或其混合物。
进一步的，所述周围神经损伤是坐骨神经损伤。
本发明的实施例还核糖体s6激酶rsk在修复周围神经损伤药物作用中的验证方法，其特征在于，具体包括以下方面：
（1）利用原位杂交及westernblot发现大鼠坐骨神经夹伤后drg组织中rsk1和rsk2表达显著增加；
（2）验证体外rsk特异性抑制剂sl0101或rsk1、rsk2的干扰病毒可以显著抑制正常或预损伤的drg神经元轴突的生长；
（3）验证大鼠鞘内注射针对rsk1和rsk2的干扰病毒，均可以显著抑制坐骨神经损伤后轴突的生长。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
（1）本发明提出了核糖体s6激酶rsk在制备治疗或修复周围神经损伤药物中的应用，以rsk作为分子干预靶点，下调或干扰rsk，抑制drg轴突生长；并提出了用于修复或治疗周围神经损伤的药物，为周围神经损伤后的治疗提供新的可能性治疗药物。
（2）本发明的实施例中利用原位杂交及westernblot发现大鼠坐骨神经夹伤后drg组织中rsk1和rsk2表达显著增加；体外rsk特异性抑制剂sl0101、rsk1和rsk2的干扰病毒可以显著抑制正常或预损伤的drg神经元轴突的生长；大鼠鞘内注射针对rsk1和rsk2的干扰病毒，均可以显著抑制坐骨神经损伤后轴突的生长；本发明中rsk在周围神经损伤与再生过程中可以调节drg神经元细胞轴突生长，有助于更好地理解rsk在神经损伤修复过程中起到的重要作用，同时验证了修复或治疗周围神经损伤的药物的有效性；为神经损伤后的治疗提供新的靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例1中所述大鼠坐骨神经损伤后drg组织中rsk1-4的原位杂交结果图；
图2为本发明的实施例1中所述大鼠坐骨神经损伤后drg组织中rsk1及rsk2的westernblot结果图；
图3为本发明的实施例2中所述体外rsk抑制剂抑制drg神经元轴突生长情况图；
其中，图3a为不同浓度rsk抑制剂sl0101和mtor抑制剂rapamycin处理正常或预损伤后的drg神经元轴突的生长图，anti-tuj1抗体（红光）标记轴突；图3b为正常条件下rsk抑制剂sl0101和mtor抑制剂rapamycin对drg神经元轴突生长影响的统计图；图3c为预损伤处理后rsk抑制剂sl0101和mtor抑制剂rapamycin对drg神经元轴突生长影响的统计图；
图4为本发明的实施例3中所述体外shrna病毒干扰rsk1和rsk2抑制drg神经元轴突生长情况图；
其中，图4a为qrt-pcr检测shrna病毒处理后drg神经元细胞中rsk1及rsk2的mrna水平图；图4b为shrna病毒体外干扰drg神经元细胞中rsk1或rsk2后，drg神经元轴突生长的免疫荧光结果图；图4c为rskshrna病毒处理后drg神经元轴突总长度统计图；图4d为rskshrna病毒处理后drg神经元轴突最长长度的统计图；
图5为本发明的实施例4中所述鞘内注射针对rsk1或rsk2的shrnaaav2/8病毒抑制大鼠坐骨神经损伤后的轴突生长情况图；
其中，图5a为动物实验流程图；图5b为免疫组化实验检测鞘内注射aav2/8-gfp病毒的效率图；图5c为免疫组化检测rskshrnaaav2/8病毒处理后大鼠坐骨神经损伤后轴突的生长情况图，anti-scg10（红光）标记再生轴突；图5d为rskshrnaaav2/8病毒处理后轴突再生长度的统计结果图；图5e为rskshrnaaav2/8病毒处理后轴突再生最长长度的统计结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1考察大鼠坐骨神经损伤后drg组织中rsk家族的表达变化
1-1、构建成年sd大鼠坐骨神经夹伤模型
从南通大学实验动物中心订购27只健康成年雄性sd大鼠，200±20g，随机分成3组，每组9只。用复合麻醉剂注射大鼠腹腔进行麻醉（0.3ml/100g），左侧后肢剃毛碘伏消毒，手术暴露左侧股骨中段坐骨神经，将神经与肌肉、基膜分离，夹伤专用镊子全齿夹住该段坐骨神经中间位点，夹伤宽度2mm，时间30s，然后缝合伤口，并腹腔注射1ml生理盐水，0.2ml青霉素钠溶液。分别在0d、1d和4d三个时间点，准时快速取夹伤侧l4-l5背根神经节（drg）组织，每组6只大鼠的drg组织置于冻存管内，-80ºc保存（提蛋白用），3只置入预冷的4%甲醛溶液（组织切片用）中，4ºc保存。
1-2、冰冻切片
将经脱水完全后的组织取出，置于平衡液（30%蔗糖：oct1:1）中平衡5min，然后放进塑料模具中，加入oct后将模具平整地放置，用干冰环绕，微调组织形态，直至组织被冻在oct后，将模具置入液氮或者大量干冰中速冻，做好标记用于冰冻切片（可放在-80ºc长期保存）。切片时，将oct块从模具取出，修整后，用oct固定于冻台上即可切片。使用leicacm3050s冰冻切片机根据实验要求切片，切片先置于50ºc烘箱2h烘干，烘干后-80ºc保存。
1-3、原位杂交
制备针对rsk1-4的特异性探针，成年大鼠坐骨神经夹伤后，分别取成年sd大鼠坐骨神经夹伤后0d和4d这两个时间点的drg组织切片，进行原位杂交，正义链探针（sense）作为杂交的阴性对照。
具体步骤如下：组织切片，50ºc，2h；depc水洗10min×3次；0.2mhcl室温处理10min；0.3%pbst室温15min；1×pbs5min×3次；3μg/mlproteinasek37℃消化组织20min；3mg/ml甘氨酸/pbs5min；pbs洗片10min×3次；4%多聚甲醛15min；0.1m三乙醇胺/0.05%乙酸酐/depc水孵育10min；乙醇梯度脱水，依次为70%、80%、90%、100%，3min/次。探针杂交：将鲑鱼精dna（100℃，5min变性）加入到42℃预热的杂交液中（比例1∶1000，鲑鱼精终浓度100μg/ml）配成预杂交液，加到切片上，42℃预杂交2h；将正反义探针65℃，变性10min，冰浴2-3min，按照1∶200的比例加到预杂交液中，敷到切片上，做好标记，42℃杂交12-16h；依次用含有0.1%sds的2×ssc、1×ssc、0.1×ssc，50℃洗片，时间依次为是10min×2次、15min×2次、30min×2次；1×bufferi室温孵育3min；bufferii（含有1%的blocking的1×bufferi），37℃封闭30min；敷上anti-dig-ap（1∶1000，bufferii配制），4℃过夜。nbt/bcip显色：bufferi，室温15min×2次；bufferiii，3min洗涤；将显色液加到切片上，室温反应，之后每30min观察显色情况，适时用0.01mpbs终止显色反应，按照50%、70%、80%、95%、无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明化，树脂封片，放通风橱干燥，显微镜观察并拍照。
结果如图1所示，与0d相比，大鼠坐骨神经损伤后4d，drg组织中rsk1和rsk2mrna表达水平显著增加，而rsk3和rsk4的表达变化不显著。
1-4、westernblot
用t-pertissueproteinextractionreagent（pierce）试剂盒提取大鼠坐骨神经夹伤后0d、1d和4d的drg组织蛋白，按halt™proteaseinhibitorcocktailkit（pierce）说明书加入蛋白酶抑制剂，用bca™proteinassaykit（pierce）进行蛋白定量。进行sds-page电泳：变性蛋白上样（20μg），浓缩胶（5%，80v，30min）；分离胶（10%，110v），根据目的条带大小，决定电泳停止时间。转膜：pvdf膜（0.2μm），甲醇激活30s，与胶一起放在预冷的转膜液中平衡5min，湿转（100v，2h）。封闭：用5%的脱脂牛奶，室温封闭2h。孵育抗体：分别用特异性针对rsk的抗体rabbitanti-rsk1（abcam，ab32114，1：500）、rabbitanti-rsk2（abcam，ab32133，1：500），摇床4℃过夜；tbst，10min×3次，tbs洗膜，10min；孵二抗，摇床，室温2h；tbst，15min×3次，tbs洗膜，10min。显影：用ecl暗室显影、洗片、定影；胶片晾干扫描，保存，分析结果。
结果如图2所示，与0d相比，大鼠坐骨神经损伤后，drg组织中rsk1及rsk2的蛋白表达水平在损伤后1d和4d均显著增加。
实施例2体外rsk抑制剂处理抑制drg神经元轴突生长
2-1、原代drg神经元细胞的提取
用10%水合氯醛麻醉成年sd大鼠若干只，备毛并用75%酒精消毒，从背部尾巴处解剖，分离取出完整脊柱，打开上椎板，取出所有drg，放入已加入hibernatea（ha 1%ps）的皿中；drg全部取完后，弃ha，pbs洗一遍，弃pbs，加入少量胶原酶，用眼科剪将drg充分剪碎，补加胶原酶至合适的量（每3只大鼠的drg加1ml），放置于37ºc，5%co2恒温细胞培养箱中90min；将皿中所有液体转移至5mlep管中，1200rpm×5min离心，弃上清，加入与胶原酶等量的在37ºc预热的0.25%trypsin-edta（胰酶），用1ml移液枪吹打10-20次，放回37ºc，5%co2恒温细胞培养箱静置3min，取出继续吹打10-20次，drg组织块即可完全消化；加入3倍胰酶体积的胰酶消化终止液（10
