本发明涉及纳米药物载体领域，具体涉及一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系及其制备方法与应用。
背景技术：
核酸药物是指具有疾病治疗功能的dna或rna，与传统小分子药物和抗体药物相比，核酸药物可以从根源上调控致病基因的表达，并可以达到单碱基水平上的序列特异性，具有治标治本的特点。此外，核酸药物具有治疗效率高、药物毒性低、特异性强和应用领域广等优点。
由于核酸药物十分不稳定，在体内给药时极易被血浆中的核酸酶降解，也极易被孔径为6-10nm的肾小球基膜经由滤过作用清除。同时，核酸药物的非特异性分布会降低靶组织的局部浓度，进入细胞的核酸还要成功进行溶酶体逃逸进入细胞质，才能发挥作用。因此，核酸类药物需要借助各类载体实现肿瘤部位的给药。核酸药物主要包括小干扰rna、核酸适配体和反义核酸几类。
目前核酸药物的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高，但是存在致突变性以及内源性重组等安全问题，而且使用成本高，不适用于临床。非病毒载体相对于病毒载体比较安全，成本较低，并且具有共递送药物的能力，是目前核酸药物载体研究的热点。
核酸药物和其它小分子药物的结合是疾病治疗中一个智能的并且有前景的协同策略，可以同时针对不同组分从而相互补充。但是由于两种药物的不同性质，共同递送的载体往往被设计成多功能化并且比较复杂。例如，小分子药物通常是疏水的化学结构，它需要载体通过疏水相互作用或者化学键合将其包载。对于核酸药物，由于其大分子和强负电荷的特性，可以通过化学键合或者静电相互作用包载入载体中。而复杂的共同递送载体可能会带来许多潜在的问题，如不可控性、毒性和低包载效率等。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系及其制备方法与应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，包括核酸和亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物；所述蒽醌类药物为含有伯胺、仲胺和叔胺中至少一种基团的蒽醌类药物。
本发明中亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物上的正电荷的伯胺、仲胺和叔胺基团可以通过与核酸药物上磷酸根的静电相互作用结合形成复合物，从而共同递送两种药物。
优选的，所述蒽醌类药物上氨基和核酸上磷酸根基团的摩尔比为1:1～100:1。
优选的，所述亲水性聚合物为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸氨基酯类、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸中的一种或两种以上形成的任意均聚物或共聚物。
优选的，所述蒽醌类药物选自多柔比星、阿柔比星、到诺霉素、伊达比兴、表柔比星、米托蒽醌和氨柔比星中的至少一种。
优选的，所述亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物中蒽醌类药物与亲水性聚合物之间的修饰可以为一些刺激敏感的化学键。例如可以为腙键、二硫键、硫缩酮键、硼酸邻苯二酚酯键、原酸酯键、乙烯基醚键和缩醛键中的一种或两种以上组合。
进一步优选的，所述亲水性聚合物中聚乙二醇嵌段的数均分子量范围为550～10000g/mol。聚乙二醇形成亲水性的壳，可以稳定胶束、避免被生物体内内质网清除和蛋白质的吸附作用。
优选的，本发明所用的核酸，对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例，可以为sirna、mrna、trna、rrna、cdna、mirna(微rna)、核酶、反义寡核普酸、质粒dna、肽核酸、三链形成型寡核酸(triplexformingoligonucleotide,tfo)、基因等。本发明所用的核酸，可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通过化学合成制备的核酸。进而，上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种，并且对其分子量也没有特殊的限定。另外，本发明中，核酸可以为被化学、酶或肽修饰的核酸。本发明中，核酸可以单独使用1种，也可以2种以上适当地组合使用。
进一步优选的，所述核酸为sirna。
优选的，所述蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系形成直径为20-250纳米的纳米颗粒。
优选的，所述蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系的表面进行化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。
本发明还提供了一种核酸导入方法，通过使上述蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系与细胞接触，将核酸导入到细胞内。所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为病理状态下或非正常生理状态下的哺乳动物细胞，所述核酸优选为小干扰核酸(sirna)。
以上任一项所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系的制备方法，包括以下步骤：
将亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物、核酸分别溶于dpec水中，然后将两者水溶液等体积吹打混匀，室温静置后得到蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系。
优选的，所述静置的时间为15min。
以上任一项所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为肝脏肿瘤或乳腺肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过蒽醌类药物上的氨基和核酸药物上的磷酸根基团的静电相互作用自组装形成纳米颗粒，该纳米颗粒直径为50-250纳米。
(2)本发明的蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系可生物降解，并且它的最终降解产物不会对生物体有不良影响。
(4)本发明制成的载药纳米颗粒在循环过程中，可避免核酸的降解和小分子药物的泄露。
(5)本发明通过核酸药物和小分子药物的结合，实现协同作用。
附图说明
图1为水溶性mpeg-hyd-dox与sirna自组装形成纳米颗粒的示意图。
图2为不同n:p比的p-h-d/sirna凝胶电泳图。
图3为不同n:p比的sirna的复合效率。
图4为p-h-d/sirna的透射电镜图片和粒径分布图。
图5为p-h-d/sirna的zeta电势图。
图6为p-h-d/sirna保护sirna避免被rnasea降解效果图。
图7为pd-l1mrna表达的基因沉默效果图。
图8为pd-l1蛋白表达的基因沉默效果图。
图9为肿瘤生长抑制效果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1、聚乙二醇腙键修饰的阿霉素和sirna(p-h-d/sirna)复合物纳米颗粒制备方法与应用
一、peg-hyd-dox的制备
首先将甲氧基聚乙二醇(mpeg2000，2g，1mmol)和三乙胺(triethylamine，tea，0.252g，2.5mmol)溶于无水四氢呋喃中，恒压滴液漏斗中加入无水四氢呋喃溶解的对硝基苯基氯甲酸酯(4-nitrophenylchloroformate，npc，0.5g，2.5mmol)，在冰浴中逐滴滴加，反应12h。用砂芯漏斗除去产生的三乙胺盐后，在冷乙醚中沉淀三次，真空干燥得到npc修饰的聚乙二醇(mpeg-npc)。
mpeg-npc(1g，0.462mmol)溶于15ml二氯甲烷中，在40℃下溶解后，逐滴加入水合肼(245mg，4.9mmol)，反应24h。产物在冷乙醚中沉淀三次后，真空干燥得到mpeg-hyd。
mpeg-hyd(0.69g，0.335mmol)，盐酸阿霉素(dox·hcl，198mg，0.341mmol)溶于无水甲醇中，60℃下逐滴加入三氟乙酸(60μl)，避光反应48h，产物在乙醚中沉淀三次，真空干燥得到甲氧基聚乙二醇腙键修饰的阿霉素(mpeg-hyd-dox)。
二、p-h-d/sirna纳米颗粒的制备
根据阿霉素上氨基和sirna上磷酸根的n：p摩尔比，将1ml不同浓度的peg-hyd-dox的depc水溶液加入到1mlsirna(5nmol)的depc水溶液中，吹打混匀后，室温下孵育15min后，得到p-h-d/sirna颗粒。与加样缓冲液混合后，在100v下用含tae缓冲液的2％琼脂糖凝胶中进行15min凝胶电泳，以确认p-h-d/sirna的阻滞能力。水溶性mpeg-hyd-dox与sirna自组装形成纳米颗粒的示意图见图1。如图2和图3所示，n:p比为3:1时，peg-hyd-dox能完全阻滞sirna。根据软件imagej分析灰度值算出n；p比为1:1、2:1、3:1时sirna的复合效率为77.34％，92.00％和几乎100％。
制备的颗粒用动态光散射仪(dynamiclightscattering，dls)检测载药纳米颗粒粒径和电位，p-h-d/sirna的粒径在40nm左右，zeta电位为26.3mv左右，如图4和图5所示。在透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,tem)下观察两种超支化载药纳米颗粒都有一个紧凑的球型形貌，大小在40nm左右，与dls检测结果一致，如图4所示。
三、p-h-d/sirna保护sirna避免被rnasea降解
为了研究保护sirna的能力，将p-h-d/sirna与100μg/ml的rnasea在37℃下孵育1h，然后15000rpm/min离心90min，去除上清将用depc水沉淀重悬两次，最后用1％sds孵育10min，进行琼脂凝胶电泳。结果如图6所示，free的sirna很快被rnasea降解，而p-h-d/sirna能很好的保护sirna被rnase降解。
四、体外p-h-d/sirna基因沉默效果
ct26细胞种在24孔板中培养过夜，然后加入不含fbs的p-h-d/sirna的dmem溶液。lipo/sirna按照供应商的操作手册制备。孵育6h后，培养基换成新的含10％fbs的dmem。继续孵育24h后，分离ct26mrna，48h后ct26蛋白检测。pd-l1mrna和蛋白的表达水平分别用实时荧光定量核酸扩增检测系统(reversetranscription-polymerasechainreaction，qpcr)和流式细胞荧光分选技术(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)检测。
如图7所示，由于dox的影响，p-h-d/sin.c.组pd-l1mrna的表达水平明显升高到200％。而与相同sirna浓度(10nm)的p-h-d/sin.c.组相比，p-h-d/sirna能明显地降低pd-l1的表达。提高sipd-l1的浓度至20nm能明显提高pd-l1的基因沉默效率。如图8所示，同样用流式检测ct26表面pd-l1蛋白水平的表达证明了rnai的效果。
五、肿瘤生长抑制效果
将携带panc02异种移植肿瘤的c57bl/6小鼠随机分为四组，每三天静脉给药一次，治疗15天。dox和sirna的注射剂量为750μg，每次注射剂量为4mg/kg。每隔一天检测每只小鼠的肿瘤大小和体重变化，并使用以下公式计算肿瘤体积：0.5×(长)×(宽)2。
如图9所示，由于化疗的毒性作用dox组能部分抑制肿瘤的生长。p-h-d/sin.c.相比于dox组能显著抑制肿瘤生长，可能源于p-h-d/sin.c.增强的肿瘤富集作用和药物递送能力。其中p-h-d/sipd-l1组表现出最强的肿瘤抑制作用。
1.一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，包括核酸和亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物；所述蒽醌类药物为含有伯胺、仲胺和叔胺中至少一种基团的蒽醌类药物。
2.根据权利要求1所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述蒽醌类药物上氨基和核酸上磷酸根基团的摩尔比为1:1～100:1。
3.根据权利要求1所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述亲水性聚合物为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸氨基酯类、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸中的一种或两种以上形成的任意均聚物或共聚物；所述蒽醌类药物选自多柔比星、阿柔比星、到诺霉素、伊达比兴、表柔比星、米托蒽醌和氨柔比星中的至少一种；所述亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物中修饰的化学键为腙键、二硫键、硫缩酮键、硼酸邻苯二酚酯键、原酸酯键、乙烯基醚键和缩醛键中的一种或两种以上组合。
4.根据权利要求3所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述亲水性聚合物中聚乙二醇嵌段的数均分子量范围为550～10000g/mol。
5.根据权利要求1所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述核酸为sirna、mrna、trna、rrna、cdna、mirna、核酶、反义寡核普酸、质粒dna、肽核酸、三链形成型寡核酸和基因中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述核酸为sirna。
7.根据权利要求1所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系形成直径为20-250纳米的纳米颗粒。
8.根据权利要求1所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系，其特征在于，所述蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系的表面进行化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。
9.制备权利要求1-8任一项所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将亲水性聚合物修饰的蒽醌类药物、核酸分别溶于dpec水中，然后将两者水溶液等体积吹打混匀，室温静置后得到蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系。
10.权利要求1-8任一项所述的一种蒽醌类药物和核酸复合物纳米递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术总结