本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统及其制备方法和应用。
背景技术：
前列腺癌是欧美等发达国家和地区男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位。在亚洲其发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势。当患者在早期诊断出转移性前列腺癌时，手术和内分泌治疗手段可暂时有效抑制软组织病灶的转移，降低血清中前列腺特异性抗原水平。然而，几乎所有的前列腺癌患者会无可避免的发展成转移性较强的去势耐受型前列腺癌(metastaticcastration-resistantprostatecancer，mcrpc)，即对内分泌治疗不再敏感，仅能试用化疗。其中，多西他赛能够明显改善mcrpc骨转移患者的临床症状，但其耐药性成为导致临床治疗无效最常见的原因之一。更为遗憾的是，不同的化疗分子耐药机制也不尽相同。因此，研究一种新型靶向给药系统，既对正常前列腺上皮细胞无毒，又能延缓前列腺癌的发生和转移，克服多药耐药性，是十分必要的。
近年来，化学-光热联合治疗(chemo-photothermalcombinationtherapy)为耐药型癌症治疗提供了新策略。大量研究数据证明，通过纳米体系共传递化疗药物和光热试剂，联合近红外(near-infrared,nir)激光照射，使光热试剂产生癌细胞敏感性的热，有效延长化疗药物在肿瘤内的驻留时间，促使药物发挥作用，攻克多药耐药。中科院研究人员以一步超声法制备出共包载化疗药物阿霉素和光热试剂吲哚青绿的纳米颗粒(dinps)，通过化疗热疗协同作用，对耐药型mcf-7/adr乳腺癌细胞显示出更显著的凋亡坏死诱导率及肿瘤生长抑制活性。因而，开发一种安全高效的传递系统，确保化疗药物和光热试剂能够被同时传输到肿瘤部位发挥多重协同功能，克服肿瘤细胞耐药性，势在必行。
金纳米棒(goldnanorods,gnrs)作为一种新型纳米载体，在生物医学领域的应用前景极为广阔。其具有毒性低，比表面积大，易与生物分子结合的优点，可用于传递小分子药物及生物大分子。gnrs合成过程中通过控制其的形貌、尺寸和结构，可以调节其近红外吸收性能。然而，由于gnrs在不同细胞内的自聚集，可能导致其理想的近红外窗口转变为可见光谱区，大大降低其光热转换效率。此外，gnrs的非特异性转运易导致全身毒副作用，也是目前亟待解决的问题。
水溶性n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺[n-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide，hpma]作为合成高分子材料，它具有生物相容性好，无免疫原性，可根据使用目的对其结构进行修饰等特点。目前已研究出以不同间隔基连接各种药物的线性、接枝以及胶束型等多种hpma聚合物药物接合物。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统，利用水溶性hpma聚合物，将化疗药物装配gnrs，协同热疗化疗作用，解决了前列腺癌治疗过程中细胞的耐药性问题。
本发明的目的之二在于提供一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统在治疗前列腺癌的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统，所述载药系统以ph敏感型hpma聚合物作为金纳米棒的修饰链，所述ph敏感型hpma聚合物通过ph敏感化学键连接化疗药物。
进一步地，所述ph敏感化学键为腙键。
进一步地，所述化疗药物为阿霉素。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用种子溶液生长方法制备ctab-gnrs；
(2)取ma-gg-nhnh2和化疗药物阿霉素反应，得到中间体ma-gg-nhn＝dox；
(3)以hpma和上述步骤(2)的中间体ma-gg-nhn＝dox为单体，制备ph敏感型hpma聚合物pds-phpma-dox；
(4)取上述步骤(1)制备的ctab-gnrs和上述步骤(3)的产物pds-phpma-dox混合，避光反应，即得hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统phpma-dox@gnrs。
进一步地，上述步骤(2)中ma-gg-nhn＝dox的制备过程为：取ma-gg-nhnh2和阿霉素溶于甲醇中，加入冰乙酸，于室温搅拌下搅拌，即得产物。
进一步地，所述ma-gg-nhnh2和阿霉素的摩尔比为1:1。
进一步地，上述步骤(3)中包括以下过程：以4,4’-偶氮双(氰基戊酸)-四氢噻唑-2-硫酮(abik-tt)为引发剂，dmso为反应溶剂，将abik-tt、dmso、单体hpma、ma-gg-nhn＝dox置于安瓿瓶内，熔封，50℃油浴反应24h，超纯水溶解粗产物，透析48h，冷冻干燥得末端链为tt的半摇爪聚合物tt-phpma-dox；取tt-phpma-dox和pdea溶于dmf中，将含有diea的dmf滴加至反应液中，室温搅拌3h，减压除去溶剂，去离子水溶解粗产物，透析48h，冷冻干燥得聚合物pds-phpma-dox。
进一步地，所述aibk-tt、dmso、单体hpma和ma-gg-nhn＝dox的混合物的重量百分含量分别为2.4％、85.1％、12.5％，其中单体hpma和ma-gg-nhn＝dox的摩尔比为9:1。
进一步地，上述步骤(4)中包括将ctab-gnrs重悬于生理盐水，搅拌条件下，滴加pds-phpma-dox溶液，其中ctab-gnrs和pds-phpma-dox的摩尔比为1:1.5，避光反应一段时间，得产物phpma-dox@gnrs。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统在治疗前列腺癌中的应用
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统，利用水溶性hpma聚合物将化疗药物装配gnrs，协同热疗化疗作用。其中gnrs吸收近红外光转化为热，通过吸收nir光改变肿瘤微环境，在保证化疗药物稳定释放的过程中，高效利用gnrs的光热转化效应，提高化疗药物的杀伤力，协同作用于前列腺癌细胞，有助于克服肿瘤细胞的耐药性。
本发明的载药系统中ph敏感型hpma聚合物的修饰，提高了gnrs的稳定性及化疗药物的肿瘤蓄积量，降低两者对正常组织的毒性。采用ph敏感腙键将化疗药物连接于hpma聚合物水溶性骨链，既能实现小分子抗癌药物成功连接到hpma聚合物上且在血液循环时保持稳定，又能保证化疗药物在肿瘤细胞溶酶体内快速被释放，靶向转运至肿瘤组织，以胞吞或胞饮的方式进入肿瘤细胞，可被快速释放，有助于药效发挥。
本发明还提供了上述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，制备过程简单易操作。本发明还提供了上述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统在治疗前列腺癌的应用，有效克服肿瘤细胞的耐药性，延缓前列腺癌的发生和转移。
附图说明
图1为本发明的hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的合成路线图；
图2为实施例1的ctab-gnrs和实施例3的phpma-dox@gnrs的透射电镜图；
图3为实施例1的ctab-gnrs和实施例3的phpma-dox@gnrs的升温趋势图；
图4为实施例3的phpma-dox@gnrs在酸性及中性缓冲液中随时间释放dox的结果统计图；
图5为不同浓度dox、实施例3的phpma-dox@gnrs与人前列腺癌细胞孵育48h细胞存活率统计图；
图6为dox、实施例3的phpma-dox@gnrs治疗荷人前列腺癌细胞裸鼠的效果图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
制备ctab-gnrs：
(1)制备种子液：在26℃水浴条件下，向5ml、0.2mol/l十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中加入5ml、0.0005mol/l氯金酸溶液，搅拌均匀后，快速加入600μl、0.01mol/l冰硼氢化钠溶液，反应液由黄色迅速变为棕色，剧烈搅拌2min，26℃避光静置20至30min。
(2)制备生长液：26℃水浴条件下，向5ml、0.2mol/lctab溶液中依次加入200μl、0.004mol/l硝酸银(agno3)溶液，5ml、0.001mol/l氯金酸溶液，搅拌均匀，缓慢搅拌下加入70μl、0.0788mol/laa溶液，反应液由深黄色迅速变为无色，快速加入80μl上述种子液，剧烈搅拌2min，26℃避光静置过夜，即得ctab-gnrs。
实施例2
制备pds-phpma-dox，合成路线如图1所示，具体操作步骤如下：
(1)制备ma-gg-oh：将ma-cl8.71ml(0.091mol)与30ml二氯甲烷混合，取gg-oh9.79g(0.075mmol)溶于20ml4m氢氧化钠溶液，于-15℃搅拌下将ma-cl的二氯甲烷溶液缓缓滴入含gg-oh的氢氧化钠溶液中，同时滴入1m氢氧化钠溶液调节ph9～10，室温搅拌1.5h。分离二氯甲烷层后以20ml水洗涤，合并水层，以6m盐酸水溶液调节ph1～2。沉淀以50％乙醇水溶液重结晶，得白色结晶ma-gg-oh6.44g，产率71.46％，m.p.136-138℃；ms：c8h12n2o4，201.1(m )。
(2)制备ma-gg-nhnh2：将2.00g(10mmol)ma-gg-oh溶于150ml无水乙醇，0℃冷却，搅拌情况下加入2.24g(18mmol)dic，反应2h，继续置于室温反应2h。再加入0.7723g(12mmol)80％一水合肼，室温反应4h。加入150ml正己烷，析出白色沉淀，用无水乙醇/正己烷(v/v＝1:1)混合液洗涤3次，得1.16g白色固体，产率为54.20％，m.p.166-168℃；ms：c8h14n4o3，215.0(m )；
(3)制备ma-gg-nhn＝dox：取ma-gg-nhnh20.15g(0.68mmol)和dox·hcl0.4g(0.68mmol)溶于35ml甲醇中，加入1ml冰乙酸，于室温搅拌下搅拌24h，加入适量含肼基的聚合物，室温搅拌4h以结合未反应的dox·hcl。以sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱分离产物，收集第二条红色色带，减压干燥得红色固体产物ma-gg-nhn＝dox142.21mg，产率为26％，m.p.108-110℃；ms：c35h41n5o13，740.3(m )；
(4)制备hpma：将新蒸的ma-cl30ml(0.312mol)与15ml二氯甲烷混合，缓缓滴入含有1-氨基-2-丙醇21ml(0.271mol)和碳酸钠32g(0.312mol)的二氯甲烷溶液77ml中，滴加完毕后升至室温，搅拌1h。然后将反应液置于-50℃的低温冷浴槽中1h，产生白色沉淀。过滤后将沉淀用丙酮重结晶，得白色晶体18.04g即为hpma，产率46.31％，mp66-69℃，ms：c7h13no2，144.1(m )；
(5)制备pds-phpma-dox：取单体287.27mg(2mmol)hpma、164.60mg(0.22mmol)ma-gg-nhn＝dox溶于3.82mldmso中，加入引发剂abik-tt144.73mg置于安瓿瓶内，熔封，50℃油浴反应24h，超纯水溶解粗产物，透析48h，冷冻干燥得末端链为tt的半摇爪聚合物tt-phpma-dox180.91mg；取tt-phpma-dox(0.021mm)和pdea(0.027mm)溶于1.75mldmf，将含有5μldiea的0.3mldmf滴加至反应液中，室温搅拌3h，减压除去溶剂，去离子水溶解粗产物，透析48h，冷冻干燥得产物pds-phpma-dox141.24mg。
实施例3
制备phpma-dox@gnrs，合成路线如图1所示，具体操作步骤如下：
取实施例1中制备的1ml(0.60nm)ctab-gnrs重悬于生理盐水，搅拌条件下，缓慢滴加1ml(0.90nm)实施例2的pds-phpma-dox，避光反应12h，得2ml(0.3nm)的产物phpma-dox@gnrs。
实验例1
观察ctab-gnrs和phpma-dox@gnrs的透射电镜图：分别取实施例1的ctab-gnrs和实施例3的产物phpma-dox@gnrs，观察其透射电镜图，图2a为ctab-gnrs，图2b为phpma-dox@gnrs，由图2可以看出合成的ctab-gnrs的横向长度平均约为11nm，纵向长度平均约为37nm，经载阿霉素的hpma聚合物作用后在ctab-gnrs表面形成一层约5nm的包覆层。
实验例2
ctab-gnrs与phpma-dox@gnrs的升温趋势：分别吸取4ml超纯水(saline)、ctab-gnrs水溶液(0.3nm)与phpma-dox@gnrs水溶液(0.3nm)，置于石英比色皿中，在25℃条件下，用808激光仪照射，在10min内每1min记录温度情况，绘制升温曲线，结果如图3所示。
由图3可以看出：本发明的载药系统phpma-dox@gnrs采用载hpma聚合物阿霉素接合物修饰金纳米棒后，在nir条件下仍然能够将光能转化为热能，且与ctab-gnrs的升温效果相似，激光照射5min后，温度都能达到40℃以上，表明phpma-dox@gnrs具有光热转化能力，可发挥热疗作用。
实验例3
phpma-dox@gnrs体外释药：取适量产物phpma-dox@gnrs溶于1mlph5.0的醋酸盐缓冲液或ph7.4的磷酸盐缓冲液中，转入透析袋(mwco3500)，以20ml对应的ph缓冲液为释放介质，于37℃摇床(100rpm)进行释放考察，特定时间点取释放介质200μl，并补充等体积的新鲜释放介质，离心(1000rpm，5min)，精密量取上清液20μl进样分析，计算各时间点的累积释放量，结果如图4所示。
由图4可知：在ph7.4时，dox从phpma-dox@gnrs的释放量在48h内不到20％，说明腙键在生理ph条件下能保持稳定。当ph降低至溶酶体内弱酸性环境即ph5.0时，由于腙键的断裂，phpma-dox@gnrs释放dox的速率明显加快，累积释放量为83％。说明本发明的载药系统即能在血液循环时保持稳定，又能保证化疗药物在肿瘤细胞溶酶体内快速被释放，靶向转运至肿瘤组织，以胞吞或胞饮的方式进入肿瘤细胞，可被快速释放，有助于药效发挥。
实验例4
不同浓度phpma-dox@gnrs的体外细胞毒性：取人源前列腺癌细胞pc-3(中国科学院上海细胞库购得)用dmem培养基(加入10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml的链霉素)37℃，5％co2的条件下培养。
将pc-3细胞悬液按密度1×104cell/well接种于96孔板中，孵育24h，弃去培养基，加入含不同浓度的dox或phpma-dox@gnrs的培养基，每组浓度设五个复孔，以新鲜培养基孵育的细胞作为阴性对照，不含细胞的培养基做空白对照，孵育48h，每孔加入20μlmtt的pbs(5mg/ml)，孵育4h，吸出溶液，加入150μldmso，振摇20min，使用酶标仪测定每个孔在570nm处的吸光度，计算细胞存活率,其中phpma-dox@gnrs laser表示给予phpma-dox@gnrs2h后808激光仪照射5min，结果如图5所示。
由图5可以看出：phpma-dox@gnrs的细胞毒性远小于dox，但结合nir光照后，phpma-dox@gnrs对pc-3细胞的生长抑制活性与浓度成正相关。在高浓度条件下，phpma-dox@gnrs laser对pc-3的存活率影响显著高于dox。说明本发明的载药系统通过ph敏感型hpma聚合物的修饰，提高了gnrs的稳定性及盐酸阿霉素的肿瘤蓄积量，降低两者对正常组织的毒性。
实验例5
phpma-dox@gnrs的体内抗肿瘤效果：将100μlpc-3细胞悬液(6×106cells，pbs)皮下注射于雄鼠裸鼠单肩，建立荷pc-3单侧瘤模型。待肿瘤体积达到100-200mm3时，随机分为5组(n＝6)，分别为生理盐水(saline)、dox、phpma-dox@gnrs和联合治疗组phpma-dox@gnrs laser(给予phpma-dox@gnrs2h后，用808nmnir照射肿瘤部位，2w/cm2、5min)。在第1、8和15天时尾静脉注射给予相应药物治疗，dox当量为5mg/kg。每三天测量裸鼠体重和肿瘤大小(即肿瘤长和宽)，用于绘制体重和肿瘤体积变化曲线，结果如图6所示。
由图6可以看出：相对于对照组(saline组)，dox组、phpma-dox@gnrs组和联合治疗组phpma-dox@gnrs laser的肿瘤生长被抑制。从统计上看，phpma-dox@gnrs组和联合治疗组的肿瘤体积明显小于对照组(p<0.01)，且联合治疗组的部分小鼠的肿瘤完全治愈。dox肿瘤生长抑制率(tgi)为31％，具有中度的抗肿瘤效果，而phpma-dox@gnrs的tgi提高了一倍，约68％，良好的抗肿瘤效果归功于更长的血液循环及更强的epr效应，联合治疗组的tgi则达到了88％，说明本发明的载药系统利用水溶性hpma聚合物，将化疗药物装配gnrs，协同热疗化疗作用。其中gnrs吸收近红外光转化为热，通过吸收nir光改变肿瘤微环境，在保证化疗药物稳定释放的过程中，高效利用gnrs的光热转化效应，提高化疗药物的杀伤力，协同作用与于前列腺癌的肿瘤细胞，有效克服肿瘤细胞的耐药性，进一步表明了本发明的载药系统在化学-光热治疗前列腺癌的潜在优势。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
1.一种hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统，其特征在于，所述载药系统以ph敏感型hpma聚合物作为金纳米棒的修饰链，所述ph敏感型hpma聚合物通过ph敏感化学键连接化疗药物。
2.根据权力要求1所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统，其特征在于，所述ph敏感化学键为腙键。
3.根据权力要求2所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统，其特征在于，所述化疗药物为阿霉素。
4.如权力要求3所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用种子溶液生长方法制备ctab-gnrs；
(2)取ma-gg-nhnh2和化疗药物阿霉素反应，得到中间体ma-gg-nhn＝dox；
(3)以hpma和上述步骤(2)的中间体ma-gg-nhn＝dox为单体，制备ph敏感型hpma聚合物pds-phpma-dox；
(4)取上述步骤(1)制备的ctab-gnrs和上述步骤(3)的产物pds-phpma-dox混合，避光反应，即得hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统phpma-dox@gnrs。
5.根据权利要求4所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，其特征在于，上述步骤(2)中ma-gg-nhn＝dox的制备过程为：取ma-gg-nhnh2和阿霉素溶于甲醇中，加入冰乙酸，于室温搅拌下搅拌，即得产物。
6.根据权利要求5所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，其特征在于，所述ma-gg-nhnh2和阿霉素的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求4所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，其特征在于，上述步骤(3)中包括以下过程：以4,4’-偶氮双(氰基戊酸)-四氢噻唑-2-硫酮为引发剂，dmso为反应溶剂，将4,4’-偶氮双(氰基戊酸)-四氢噻唑-2-硫酮、dmso、单体hpma、ma-gg-nhn＝dox置于安瓿瓶内，熔封，50℃油浴反应24h，超纯水溶解粗产物，透析48h，冷冻干燥得末端链为tt的半摇爪聚合物tt-phpma-dox；取tt-phpma-dox和pdea溶于dmf中，将含有diea的dmf滴加至反应液中，室温搅拌3h，减压除去溶剂，去离子水溶解粗产物，透析48h，冷冻干燥得聚合物pds-phpma-dox。
8.根据权利要求7所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，其特征在于，所述aibk-tt、dmso、单体hpma和ma-gg-nhn＝dox的混合物的重量百分含量分别为2.4％、85.1％、12.5％，其中单体hpma和ma-gg-nhn＝dox的摩尔比为9:1。
9.根据权利要求4所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统的制备方法，其特征在于，上述步骤(4)中包括将ctab-gnrs重悬于生理盐水，搅拌条件下，滴加pds-phpma-dox溶液，其中ctab-gnrs和pds-phpma-dox的摩尔比为1:1.5，避光反应一段时间，得产物phpma-dox@gnrs。
10.一种如权利要求1所述hpma聚合物修饰的金纳米棒载药系统在治疗前列腺癌中的应用。
技术总结