抗HER3抗体-药物偶联物的制作方法

专利2022-06-30 62

本申请是申请日为2015年04月10日、发明名称为“抗her3抗体-药物偶联物”的中国发明专利申请no.201580019138.9(国际申请号为pct/jp2015/002020)的分案申请。

本发明涉及将抗her3抗体与抗肿瘤性药物经由接头结构部分彼此偶联的抗体-药物偶联物，该偶联物可用作抗肿瘤药。

背景技术：

将具有细胞毒性的药物偶联至能够与在癌细胞表面表达并且能向细胞内化的抗原结合的抗体(能够与抗原结合的抗体也能向细胞内化)的抗体-药物偶联物(adc)可选择性地向癌细胞递送药物，从而有望使药物在癌细胞中积累并杀死癌细胞(参见非专利文献1至3)。作为adc，其中卡奇霉素(calicheamicin)与抗cd33抗体偶联的mylotarg(注册商标；吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin))被批准作为急性髓细胞性白血病的治疗剂。另外，最近其中耳他汀e与抗cd30抗体偶联的adcetris(注册商标；brentuximabvedotin)被批准作为霍奇金淋巴瘤和未分化大细胞淋巴瘤的治疗剂(参见非专利文献4)。迄今为止被批准的adc中所含的药物以dna或微管蛋白为靶标。

作为抗肿瘤性的低分子量化合物，抑制拓扑异构酶i而表现出抗肿瘤效果的喜树碱衍生物是已知的。其中，下式

[化学式1]

表示的抗肿瘤化合物(依沙替康，化学名：(1s，9s)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1h，12h-苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9h，15h)-二酮)是喜树碱的水溶性衍生物(专利文献1和2)。

与目前临床中使用的伊立替康不同，该化合物发挥其抗肿瘤效果不需要通过酶活化。另外，与同在临床中使用的伊立替康和拓扑替康的主要药学活性成分sn-38相比，其对拓扑异构酶i具有更高的抑制活性并且对多种癌细胞具有更高的体外杀细胞活性。特别地，其表现出针对因p-糖蛋白的表达而对sn-38等具有耐性的癌细胞的效果。另外，在具有皮下移植的人肿瘤的小鼠模型中，其表现出强抗肿瘤效果，因而进行了临床研究，但尚未上市(参见非专利文献5至10)。尚不清楚依沙替康能否作为adc有效发挥作用。

de-310是其中依沙替康经由ggfg肽间隔物(spacer)偶联至生物可降解羧甲基葡聚糖多元醇聚合物的复合物(专利文献3)。通过使依沙替康成为高分子形式前药，可保持高血液滞留性，进而通过利用提高的肿瘤新生血管透过性和肿瘤组织滞留性被动提高肿瘤区的高渗透特性。对于de-310，用酶切割肽间隔物以持续释放作为主要活性成分的依沙替康和甘氨酸结合至氨基的依沙替康，结果，药代动力学提高。根据非临床研究中的各种肿瘤评价模型，发现与单独施用的依沙替康相比，de-310获得了更高的有效性，即便其中包含的依沙替康的总量低于单独施用依沙替康的情况。对de-310进行了临床研究并确认了有效例。有报道称，相较于正常组织，主要活性成分在肿瘤中积累。然而，也有报道称，de-310及主要活性成分在肿瘤中的积累与在正常组织中的积累并无明显不同，因而未在人中发现被动靶向(参见非专利文献11至14)。结果，de-310也未商业化，尚不清楚依沙替康能够作为指向该靶向的药物有效发挥功能。

作为de-310的相关化合物，还已知将-nh-(ch2)4-c(＝o)-表示的结构部分插入-ggfg-间隔物与依沙替康之间以形成用作间隔物结构的-ggfg-nh-(ch2)4-c(＝o)-的复合物(专利文献4)。然而，完全不清楚该复合物的抗肿瘤效果。

人表皮生长因子受体3(也称为her3和erbb3)是受体蛋白酪氨酸激酶，并且属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(egfr)亚家族，其还包括her1(也称为egfr)、her2和her4(参见非专利文献15至17)。像典型的(prototypical)表皮生长因子受体那样，跨膜受体her3由细胞外配体结合结构域(ecd)、ecd内的二聚结构域、跨膜结构域和羧基端磷酸化结构域构成。除这些结构域以外，her1、her2和her4还携带胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(tkd)，而her3缺乏该结构域，因而不能自磷酸化。

配体调蛋白(hrg)与her3的胞外结构域相结合，并通过促进与其它人表皮生长因子受体(her)家族成员二聚化及其胞内结构域的转磷酸作用激活受体介导的信号传导途径。her3与其它her家族成员的二聚体形成扩展her3的信号传导潜力，而且不仅充当信号多样化的手段，还用作信号放大的手段。例如，her2/her3杂二聚体诱导her家族成员中最重要的促有丝分裂信号之一。her3在多种类型的癌中过表达，例如乳腺癌、肠胃癌和胰腺癌。有趣的是，已示出her2/her3的表达与从非侵袭阶段进展到侵袭阶段之间的关系(参见非专利文献18至20)。因此，期望干扰her3介导的信号传导的药剂。抗her3抗体及其免疫偶联物已分别报道于例如专利文献5至10中。

[引用列表]

[专利文献]

[专利文献1]日本特开平5-59061号公报

[专利文献2]日本特开平8-337584号公报

[专利文献3]国际公开第1997/46260号

[专利文献4]国际公开第2000/25825号

[专利文献5]美国专利第5968511号

[专利文献6]美国专利第5480968号

[专利文献7]国际公开第2003/013602号

[专利文献8]国际公开第2007/077028号

[专利文献9]国际公开第2008/100624号

[专利文献10]国际公开第2012/019024号

[非专利文献]

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[非专利文献20]nadiu等，br.j.cancer(1998)78，1385-1390.

技术实现要素：

[技术问题]

关于使用抗体治疗肿瘤，即使抗体识别抗原并与肿瘤细胞结合时，也有可能观察到不充分的抗肿瘤效果，因而有时需要更有效的抗肿瘤抗体。另外，许多抗肿瘤性低分子量化合物存在如副作用和毒性这样的安全性问题，即便这些化合物具有优异的抗肿瘤作用。因此，通过进一步提高安全性实现更优的治疗效果仍然是个课题。因而，本发明的目的是提供在抗肿瘤效果和安全性方面优异的具有优异治疗效果的抗肿瘤药。

[用于解决课题的手段]

本申请的发明人认为，由于抗her3抗体是能以肿瘤细胞为靶标的抗体，即，为具有识别肿瘤细胞的特性、与肿瘤细胞结合的特性、向肿瘤细胞内化的特性、针对肿瘤细胞的杀细胞活性等的抗体，所以，当将作为抗肿瘤化合物的依沙替康转化为经由接头结构部分偶联至该抗体而成的抗体-药物偶联物时，该抗肿瘤化合物能更可靠地递送至肿瘤细胞从而在肿瘤细胞中特异性地发挥该化合物的抗肿瘤效果，因而能可靠地发挥抗肿瘤效果，还可期待抗her3抗体的增强的杀细胞效果，以及，与单独施用所述化合物的情况相比，可减少该抗肿瘤化合物的剂量，因而能减轻抗肿瘤化合物对正常细胞的影响，从而可实现更高的安全性。

因此，本申请的发明人构建了具有特定结构的接头，成功地获得了其中经由该接头将抗her3抗体与依沙替康彼此偶联的抗体-药物偶联物，并且确认了该偶联物发挥优异的抗肿瘤效果，从而完成了本发明。

具体地，本发明涉及以下方案：

[1]抗体-药物偶联物，其中下式

[化学式2]

表示的抗肿瘤化合物与抗her3抗体经由具有下式：

-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-或-l¹-l²-l^p-

表示的结构的接头、通过在存在于抗her3抗体的铰链部的二硫键部分中形成的硫醚键偶联。

此处，抗her3抗体连接于l¹的末端，抗肿瘤化合物以1位氨基的氮原子为连接部位连接于-(ch2)n²-c(＝o)-部分的羰基或l^p的c末端。

在该式中，n¹表示0至6的整数，

n²表示0至5的整数，

l¹表示-(琥珀酰亚胺(succinimid)-3-基-n)-(ch2)n³-c(＝o)-，

其中，n³表示2至8的整数，

l²表示-nh-(ch2ch2-o)n⁴-ch2ch2-c(＝o)-或单键，

其中，n⁴表示1至6的整数，

l^p表示由2至7个氨基酸构成的肽残基，

l^a表示-o-或单键，

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-具有下式：

[化学式3]

表示的结构，以该结构的3位与抗her3抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构中的亚甲基连接。

本发明还涉及以下的各方案。

[2]根据[1]所述的抗体-药物偶联物，其中，l^p的肽残基为包含选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸的肽残基。

[3]根据[1]或[2]所述的抗体-药物偶联物，其中，l^p为选自下组的肽残基：

-ggf-、

-dggf-、

-(d-)d-ggf-、

-eggf-、

-ggfg-、

-sggf-、

-kggf-、

-dggfg-、

-ggfgg-、

-ddggfg-、

-kdggfg-，及

-ggfgggf-；

(其中，“(d-)d”表示d-天冬氨酸。)

[4]根据[1]或[2]所述的抗体-药物偶联物，其中，l^p为包含4或5个氨基酸的肽残基。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，l^p为-ggfg-或-dggfg。

[6]根据[1]至[4]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，l^p为-ggfg-。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，n³为2至5的整数，l²为单键。

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，接头为-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-。

[9]根据[8]所述的抗体-药物偶联物，其中，n³为2至5的整数，l²为nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-，并且n⁴为2或5。

[10]根据[8]或[9]所述的抗体-药物偶联物，其中，-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-是链长为4至7个原子的部分结构。

[11]根据[8]或[9]所述的抗体-药物偶联物，其中，-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-是链长为5或6个原子的部分结构。

[12]根据[10]或[11]所述的抗体-药物偶联物，其中，-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-为

-nh-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-或

-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-。

[13]根据[12]所述的抗体-药物偶联物，其中，-nh-(ch2)n1-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-为以下中的任一者：

-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-或

-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-。

[14]根据[1]至[5]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所述接头是-l¹-l²-l^p。

[15]根据[14]所述的抗体-药物偶联物，其中，-l^p-为-dggfg-。

[16]根据[15]所述的抗体-药物偶联物，其中，n³为2至5的整数，l²为单键。

[17]根据[1]所述的抗体-药物偶联物，其中，药物与-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-或-l¹-l²-l^p-相结合的药物-接头结构部分为选自下述组中的1种药物-接头结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-(nh-dx)

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)。

其中，-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-具有下式：

[化学式4]

表示的结构，以该结构的3位与抗her3抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构中的亚甲基连接。

-(nh-dx)表示下式：

[化学式5]

表示的基团，其中1位氨基的氮原子是连接部位。

-ggfg-表示四肽残基-gly-gly-phe-gly-，-dggfg表示五肽残基-asp-gly-gly-phe-gly-。

[18][1]中所述的抗体-药物偶联物，其中，药物与-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-相结合的药物-接头结构部分为选自下述组中的1种药物-接头结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)。

此处，-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-、-(nh-dx)、-ggfg-及-dggfg-如上文所述。

[19]抗体-药物偶联物，其包含下式

[化学式6]

表示的抗肿瘤化合物与抗her3抗体经由具有下式：

-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-

表示的结构的接头、通过在存在于抗her3抗体的铰链部的二硫键部分中形成的硫醚键连接偶联。

此处，抗her3抗体连接于l¹的末端，抗肿瘤化合物连接于-(ch2)n²-c(＝o)-部分的羰基。

在该式中，n¹表示0至6的整数，

n²表示0至5的整数，

l¹表示-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)n²-c(＝o)-，

其中，n²表示2至8的整数，

l²表示-nh-(ch2ch2-o)n⁴-ch2ch2-c(＝o)-或单键，

其中，n⁴表示1至6的整数，

l^p表示四肽残基-ggfg-，

l^a表示-o-或单键，

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-具有下式：

[化学式7]

表示的结构，以该结构的3位与抗her3抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构中的亚甲基连接。

[20][19]所述的抗体-药物偶联物，其中，n¹为3，n²为0，n²为2，l²为-nh-(ch2ch2-o)n⁴-ch2ch2-c(＝o)-，n⁴为2，l^a为单键，或

n¹为1，n²为1，n²为5，l²为单键，l^a为-o-，或

n¹为2，n²为1，n²为5，l²为单键，l^a为-o-。

[21][19]或[20]所述的抗体-药物偶联物，其中，n³为2或5，l²为单键。

[22][19]或[20]所述的抗体-药物偶联物，其中，n³为2或5，l²为-nh-(ch2ch2-o)n⁴-ch2ch2-c(＝o)-，n⁴为2或4。

[23][19]至[22]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-为

-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-或

-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-。

[24][19]至[23]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，药物与-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-相结合的药物-接头结构部分为选自下述组中的1种药物-接头结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)。

其中，-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-具有下式：

[化学式8]

表示的结构，以该结构的3位与抗her3抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构中的亚甲基连接。

-(nh-dx)表示下式：

[化学式9]

表示的基团，其中1位氨基的氮原子是连接部位的基团。

-ggfg-表示四肽残基-gly-gly-phe-gly-。

[25][19]至[23]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，药物与-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-相连接的药物-接头结构部分为选自下述组中的1种药物-接头结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)。

其中，-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-、-(nh-dx)及-ggfg-如上文所述。

[26][1]至[25]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所选择的1种药物-接头结构在每1抗体上偶联的平均单元数在1至10的范围内。

[27][1]至[25]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所选择的1种药物-接头结构在每1抗体上偶联的平均单元数在2至8的范围内。

[28][1]至[25]中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中，所选择的1种药物-接头结构在每1抗体上偶联的平均单元数为3至8。

[29]药物，其包含根据[1]至[28]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物。

[30]抗肿瘤药和/或抗癌药，其包含根据[1]至[28]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物。

[31]根据[30]所述的抗肿瘤药和/或抗癌药，其应用于肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃肠道间质瘤、宫颈癌、头颈癌、食道癌、表皮样癌、腹膜癌、成体多形性成胶质细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌(uteruscancer)、唾液腺癌、肾脏癌、外阴癌、甲状腺癌、肝恶性肿瘤、肛门癌或阴茎癌。

[32]药物组合物，其包含根据[1]至[28]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物作为活性组分，且包含可药用制剂组分。

[33]根据[32]所述的药物组合物，其应用于肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃肠道间质瘤、宫颈癌、头颈癌、食道癌、表皮样癌、腹膜癌、成体多形性成胶质细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、外阴癌、甲状腺癌、肝恶性肿瘤、肛门癌或阴茎癌。

[34]一种用于治疗肿瘤和/或癌的方法，其包括施用根据[1]至[28]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物。

[35]根据[29]所述的药物、根据[30]或[31]所述的抗肿瘤药和/或抗癌药、根据[32]或[33]所述的药物组合物或根据[34]所述的治疗方法，其用于与其它药物组合施用。

[36]根据[32]或[33]所述的药物组合物，其甚至还包含其它药物作为活性成分。

[35]一种用于制造抗体-药物偶联物的方法，其包括：

使下式表示的化合物与抗her3抗体或其反应性衍生物反应，并通过在存在于该抗体的铰链部的二硫键部分中形成硫醚键的方法将药物-接头部分偶联至该抗体，

(马来酰亚胺-n-基)-(ch2)n³-c(＝o)-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-(nh-dx)或

(马来酰亚胺-n-基)-(ch2)n³-c(＝o)-l²-l^p-(nh-dx)。

在该式中，n³表示2至8的整数，

l²表示-nh-(ch2ch2-o)n⁴-ch2ch2-c(＝o)-或单键，

其中，n⁴表示1至6的整数，

l^p表示由选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的2至7个氨基酸构成的肽残基，

n¹表示0至6的整数，

n²表示0至5的整数，

l^a表示-o-或单键，

(马来酰亚胺-n-基)-为由下式

[化学式10]

表示的、氮原子成为连接部位的基团。

-(nh-dx)表示下式

[化学式11]

表示的基团，其中1位氨基的氮原子是连接部位。

[36][35]所述的制造方法，其中，将药物-接头部分与抗her3抗体偶联的方法为将抗体还原以转化为反应性衍生物的方法。

[37][35]或[36]所述的制造方法，其中，所选择的1种药物-接头结构在每1抗体上偶联的平均单元数在1至10的范围内。

[38][35]或[36]所述的制造方法，其中，所选择的1种药物-接头结构在每1抗体上偶联的平均单元数在2至8的范围内。

[39][35]或[36]所述的制造方法，其中，所选择的1种药物-接头结构在每1抗体上偶联的平均单元数在3至8的范围内。

[40]抗体-药物偶联物，其是通过根据[35]至[39]中任一种制造方法而得到的。

[41]抗体-药物偶联物，其是通过在存在于抗her3抗体的铰链部的二硫键位点中形成硫醚键获得的，其中在还原条件下处理抗her3抗体，然后与选自以下所示的化合物组中的化合物反应：

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2o-ch2ch2o-ch2ch2o-ch2ch2o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)、或

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-dggfg-(nh-dx)。

其中，(马来酰亚胺-n-基)-为下式

[化学式12]

表示的基团，其具有作为连接部位的氮原子。

-(nh-dx)表示下式

[化学式13]

表示的、1位氨基的氮原子是连接部位的基团。

-ggfg-表示四肽残基-gly-gly-phe-gly-，-dggfg-表示五肽残基-asp-gly-gly-phe-gly-。

[42]抗体-药物偶联物，其是通过在存在于抗her3抗体的铰链部的二硫键位点中形成硫醚键获得的，特征在于在还原条件下处理抗her3抗体，然后与选自以下所示的化合物组中的化合物反应：

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2-c(＝o)-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、或

(马来酰亚胺-n-基)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-ggfg-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)。

其中，(马来酰亚胺-n-基)-、-(nh-dx)及-ggfg-如上文定义。

[43]根据[41]或[42]所述的抗体-药物偶联物，其中，选择的1种药物-接头结构在每1抗体上的平均偶联数为1至10。

[44]根据[41]或[42]所述的抗体-药物偶联物，其中，选择的1种药物-接头结构在每1抗体上的平均偶联数为2至8。

[45]根据[41]或[42]所述的抗体-药物偶联物，其中，选择的1种药物-接头结构在每1抗体上的平均偶联数为3至8。

[46]药物，其包含根据[40]至[45]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物。

[47]抗肿瘤药和/或抗癌药，其包含根据[40]至[45]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物。

[48]根据[47]所述的抗肿瘤药和/或抗癌药，其应用于肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结肠直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃肠道间质瘤、宫颈癌、头颈癌、食道癌、表皮样癌、腹膜癌、成体多形性成胶质细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌或阴茎癌。

[49]药物组合物，其包含根据[40]至[45]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物作为活性组分，且包含可药用制剂组分。

[50]根据[49]所述的药物组合物，其应用于肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结肠直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、胃肠道间质瘤、宫颈癌、头颈癌、食道癌、表皮样癌、腹膜癌、成体多形性成胶质细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌或阴茎癌。

[51]一种用于治疗肿瘤和/或癌的方法，其包括施用根据[40]至[45]中任一项所述的抗体-药物偶联物、其盐或其水合物。

[52]根据[46]所述的药物、根据[47]或[48]所述的抗肿瘤药和/或抗癌药、根据[49]或[50]所述的药物组合物或根据[51]所述的治疗方法，其用于与其它药物组合施用。

[53]根据[49]或[50]所述的药物组合物，其甚至还包含其他药物作为活性成分。

[发明的有利效果]

使用经由具有特定结构的接头偶联抗肿瘤化合物依沙替康的抗her3抗体-药物偶联物，可获得优异的抗肿瘤效果和安全性。

附图说明

[图1]图1示出抗her3人抗体u1-59重链的全长氨基酸序列(seqidno：583)。

[图2]图2示出抗her3人抗体u1-59轻链的全长氨基酸序列(seqidno：584)。

[图3]图3示出用系列稀释的u1-59或每种抗体-药物偶联物处理的hcc1569的平均荧光强度。使用graphpadprism软件计算kd和bmax值。

[图4]用u1-59或多种抗体-药物偶联物培养a549细胞2天。通过western印记评价her3或磷酸化her3。检测pan-肌动蛋白作为电泳对照。

[图5]图5示出用u1-59或每种抗体-药物偶联物处理的hcc1569细胞表面上her3表达减少的平均值(37℃(℃表示“摄氏度”)，1小时)。

[图6]图6示出人乳腺癌系(hcc1569)中每种her3抗体-药物偶联物对促有丝分裂或存活信号的抑制试验结果。图6a示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活。该数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光值。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。图6b示出将未经处理组的发光定义为100％时，抗体-药物偶联物处理所致发光减少率。

[图7]图7示出人乳腺癌系(mda-mb453)中每种her3抗体-药物偶联物对促有丝分裂或存活信号的抑制试验结果。图7a示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光值。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。图7b示出将未经处理组的发光定义为100％时，抗体-药物偶联物处理所致发光减少率。

[图8]图8示出人黑素瘤系(a375)中每种her3抗体-药物偶联物对促有丝分裂或存活信号的抑制试验结果。图8a示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光值。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。图8b示出将未经处理组的发光定义为100％时，抗体-药物偶联物处理所致发光减少率。

[图9]图9示出人结肠直肠系(ht29)中每种her3抗体-药物偶联物对促有丝分裂或存活信号的抑制试验结果。图9a示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光值。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。图9b示出将未经处理组的发光定义为100％时，抗体-药物偶联物处理所致发光减少率。

[图10]图10示出人肺癌系(a549)中每种her3抗体-药物偶联物对促有丝分裂或存活信号的抑制试验结果。图10a示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光值。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。图10b示出将未经处理组的发光定义为100％时，抗体-药物偶联物处理所致发光减少率。

[图11]图11示出抗体-药物偶联物(3)与抗体-药物偶联物(4)之间细胞生长或存活抑制率的比较结果。左图示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活抑制率。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。该数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。右图示出当将未经处理组的发光定义为100％时，高载药量(hdl)与中等载药量(mdl)之间抗体-药物偶联物处理所致发光减少率的比较。

[图12]图12示出抗体-药物偶联物(10)与抗体-药物偶联物(11)之间细胞生长或存活抑制率的比较结果。左图示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活抑制率。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。该数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。右图示出当将未经处理组的发光定义为100％时，高载药量(hdl)与中等载药量(mdl)之间抗体-药物偶联物处理所致发光减少率的比较。

[图13]图13示出抗体-药物偶联物(13)与抗体-药物偶联物(14)之间细胞生长或存活抑制率的比较结果。左图示出在10％fbs的存在下，源自抗体-药物偶联物的细胞生长或存活抑制率。纵坐标绘出表明每种样品atp活性的发光。横坐标绘出每种抗体-药物偶联物的浓度。该数据由三次重复的平均值 /-标准差表示。右图示出当将未经处理组的发光定义为100％时，高载药量(hdl)与中等载药量(mdl)之间抗体-药物偶联物处理所致发光减少率比较。

[图14]图14示出使用抗体-药物偶联物(3)、(10)或(13)进行的人乳腺癌(hcc1569)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图15]图15示出使用抗体-药物偶联物(3)、(10)或(13)进行的人黑色瘤(ht-144)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图16]图16示出使用抗体-药物偶联物(3)、(10)或(13)进行的人乳腺癌(mda-mb-453)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图17]图17示出使用抗体-药物偶联物(3)、(10)或(13)进行的人结肠直肠癌系(ht-29)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图18]图18示出使用抗体-药物偶联物(3)、(10)或(13)进行的人肺癌系(a549)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图19]图19示出使用抗体-药物偶联物(13)进行的人三阴性乳腺癌(mda-mb-468)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图20]图20示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人管腔乳腺癌系(mcf-7)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图21]图21示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人黑素瘤系(wm-266-4)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图22]图22示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人卵巢癌系(ovcar-8)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图23]图23示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人膀胱癌系(sw-780)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图24]图24示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人乳腺癌系(mda-mb-453)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图25]图25示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人乳腺癌系(mda-mb-453)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图26]图26示出使用抗体-药物偶联物(15)进行的人乳腺癌系(jimt-1)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图27]图27示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人肺癌系(pc9)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图28]图28示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人三阴性乳腺癌系(mda-mb-453)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图29]图29示出使用抗体-药物偶联物(16a)进行的人头颈癌系(fadu)抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值 /-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

[图30]图30示出使用人胃癌患者来源的肿瘤切片(nibio-g016)和抗体-药物偶联物(16a)进行的抗肿瘤试验结果。纵坐标绘出肿瘤平均体积。横坐标绘出从细胞移植开始计的天数。全部值均由平均值/-标准差表示。使用microsoftexcel2009基于描述性数据(平均值和标准差)分析肿瘤初始体积和小鼠初始重量。

具体实施方式

以下，参照附图来说明用于实施本发明的优选实施方案。同时，以下说明的实施方案是本发明代表性实施方案的实例，而不应基于上述实施方案狭义地解释本发明的范围。

本发明提供her3结合蛋白-药物偶联物。优选地，本发明的her3结合蛋白是具有抗体样结合活性的支架蛋白或抗体，即，抗-her3抗体。

本发明的抗her3抗体-药物偶联物是抗肿瘤药，其中抗her3抗体经由接头结构部分偶联至抗肿瘤化合物，以下进行详细说明。

在本发明的上下文中，本文所用术语“支架蛋白”是指具有高度耐受氨基酸插入、替换或缺失的暴露表面区域的多肽或蛋白质。可根据本发明使用的支架蛋白的实例是来自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的蛋白质a、来自欧洲粉蝶的胆色素结合蛋白或其它运载蛋白、锚蛋白重复蛋白和人纤连蛋白(综述于binz和pluckthun，curropinbiotechnol，16，459-69中)。支架蛋白的遗传工程可视为将亲和功能移植或整合至稳定地折叠的蛋白质的结构框架。亲和功能是指对根据本发明的蛋白质的结合亲和力。支架蛋白可以是在结构上能与赋予结合特异性的氨基酸序列分离的。一般而言，可通过合理的或者最通常组合蛋白质工程技术获得此类适于开发这样的人工亲和试剂的蛋白质，所述蛋白质工程技术例如为在体外展示的人工支架蛋白质文库中针对her3(经纯化蛋白质或展示在细胞表面上的蛋白质)淘选结合试剂，这样的技术在本领域中是已知的(skerra，j.mol.recog.，2000；binzandpluckthun，2005)。此外，具有抗体样结合活性的支架蛋白可衍生自含支架蛋白结构域的受体多肽，其可移植有供体多肽的结合结构域以赋予含受体多肽的支架蛋白结构域以供体多肽的结合特异性。所述插入的结合结构域可以是例如抗体的互补决定区(cdr)，特别是抗-her3抗体。插入可通过本领域技术人员已知的多种方法(包括例如编码氨基酸的多肽合成、核酸合成)及本领域技术人员公知的多种形式的重组方法来完成。

[抗体]

此外，本文所用术语“抗体”或“抗her3抗体”是指单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(jones等，nature321(1986)，522-525；riechmann等，nature332(1988)，323-329；和presta，curr.op.struct.biol.2(1992)，593-596)、嵌合抗体(morrison等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.81(1984)，6851-6855)、人抗体和全人抗体(tomizuka，k.等，naturegenetics(1997)16，第133至143页；kuroiwa，y.等，nucl.acidsres.(1998)26，第3447至3448页；yoshida，h.等，animalcelltechnology：basicandappliedaspects第10卷，第69至73页(kitagawa，y.，matsuda，t.和iijima，s.编辑)，kluweracademicpublishers，1999.；tomizuka，k.等，proc.natl.acad.sci.usa(2000)97，第722至727页，国际公开no.wo2007/077028等)、由至少两种抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包括前述抗体的任意部分，优选其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fv片段、双体(hollinger等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90(1993)，6444-6448)、单链抗体分子(pluckthunin：thepharmacologyofmonoclonalantibodies113，rosenburgandmoore，eds，springerverlag，n.y.(1994)，269-315)及其他片段，只要它们表现出期望的与her3结合的能力即可。

此外，本文所用术语“抗体”或“抗-her3抗体可包括含抗体的经改造子结构域或天然抗体变体的抗体样分子。这些抗体样分子可以是单结构域抗体例如来自天然来源例如骆驼科(muyldermans等，reviewsinmolecularbiotechnology74，277-302)或通过人、骆驼科或其它种属的体外展示(holt等，trendsbiotechnol.，21，484-90)衍生的仅vh结构域或仅vl结构域。

根据本发明，“fv片段”是含全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体构成。在该构型中，每个可变结构域的3个cdr相互作用以限定vh至vl二聚体在表面的抗原结合位点。6个cdr合起来赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或含仅3个对抗原具有特异性的cdr的半个fv)也能够识别和结合抗原，尽管通常结合力以比整个结合位点低。

“fab片段”还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。“fab片段”与“fab¹片段”不同之处在于：在包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸的重链ch1结构域的羧基末端添加有几个残基。“f(ab’)2片段”起初作为其间有铰链半胱氨酸的“fab’片段”对制造。这样的抗体片段的制备方法(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)是本领域技术人员已知的。

在本发明的另一优选实施方案中，本发明的抗her3抗体是针对her3的胞外结构域(ecd)的抗-her3抗体。

本发明的抗her3抗体-药物偶联物中使用的抗her3抗体可来源于任何物种。物种的优选实例可包括人、大鼠、小鼠和兔。来源于人以外的物种的抗-her3抗体优选地使用公知的技术嵌合化或人源化。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。

抗her3抗体可以是能靶向肿瘤细胞并因而具有能识别肿瘤细胞的特性、能与肿瘤细胞结合的特性、能向肿瘤细胞内化的特性、以及针对肿瘤细胞的杀细胞活性等的那些。抗-her3抗体可经由接头与具有抗肿瘤活性的化合物偶联而形成抗体-药物偶联物。

可采用流式细胞术确认抗体与肿瘤细胞的结合活性。抗体向肿瘤细胞内化可利用以下方法确认：(1)使用与治疗抗体结合的二抗(荧光标记)，在荧光显微镜下观察对进入到细胞内的抗体进行可视化检验(assay)(celldeathanddifferentiation(2008)15，751-761)；(2)使用与治疗抗体结合的二抗(荧光标记)，测量进入到细胞内的荧光量的检验(molecularbiologyofthecell第15卷，5268-5282，december2004)；或者，(3)使用与治疗抗体结合的免疫毒素，一旦进入到细胞内，则释放毒素从而抑制细胞生长的mab-zap检验(biotechniques28：162-165，january2000)。可以使用白喉毒素的催化结构域与g蛋白的重组复合蛋白质作为免疫毒素。

抗体的抗肿瘤活性可通过在体外(invitro)确定抑制细胞生长的活性而确认。例如，培养过量表达抗体的靶蛋白的癌细胞系，向培养体系中添加各种浓度的抗体，以测量针对灶形成(focusformation)、集落形成及球体生长的抑制活性。抗肿瘤活性可在体内确认，例如通过向移植了高表达靶蛋白的肿瘤细胞系的裸鼠施用抗体，并测量癌(肿瘤)细胞的变化。

由于抗体-药物偶联物中偶联的化合物发挥抗肿瘤效果，所以抗体自身不必须具有抗肿瘤效果，但优选具有抗肿瘤效果。为了特异性地和选择性地对肿瘤细胞发挥抗肿瘤化合物的细胞毒性，优选地，抗体应具有内化而转移到肿瘤细胞内的特性，这是重要的。

抗her3抗体可通过本领域中通常实施的方法获得，所述方法涉及用抗原多肽免疫动物，并收集和纯化在体内制造的抗体。抗原的来源不限于人，并且可以用来源于小鼠或大鼠等非人动物的抗原免疫动物。这种情况下，通过对与获取的异种抗原结合的抗体与人抗原的交差反应性进行试验以筛选适用于人的疾病的抗体。

或者，按照本领域中已知的方法(例如，kohler和milstein，nature(1975)256，第495-497页；kennet，r.编著，monoclonalantibodies，第365-367页，plenumpress，n.y.(1980))，通过融合制造针对抗原的抗体的产抗体细胞与骨髓瘤细胞，从而获得杂交瘤，从该杂交瘤可进而获得单克隆抗体。

抗原可通过利用遗传工程使宿主细胞制造编码抗原蛋白的基因而得到。具体而言，制备可表达抗原基因的载体，并将其转染至宿主细胞，使该基因表达。可纯化由此表达的抗原。也可通过使用涉及用经遗传工程的抗原表达细胞或具有表达的抗原的细胞系免疫动物的方法而获得抗体。抗-her3抗体可通过本领域已知的手段获得。

对于可用于本发明的抗her3抗体没有特别限制，例如，期望为具有以下特性的抗体。

(1)抗her3抗体，其具有以下特性：

(a)与her3特异性地结合，和/或

(b)具有通过与her3结合而内化至her3表达细胞中的活性。

(2)根据(1)所述的抗体，其中所述抗体与her3的胞外结构域相结合。

(3)根据(1)或(2)所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)活性。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的抗体，其中所述抗体是小鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体或者人或全人(单克隆)抗体。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化单克隆抗体，所述人源化单克隆抗体包含：包含seqidno：1所示氨基酸序列的重链和包含seqidno：2所示氨基酸序列的轻链。

(7)根据(1)至(6)中任一项所述的抗体，其中，其中所述抗体缺少重链羧基末端的赖氨酸残基。

(8)根据(7)所述的抗体，其中所述抗体包含：seqidno：70所示氨基酸序列表示的重链可变区和seqidno：72所示氨基酸序列表示的轻链可变区。

(9)抗体，其通过用于制造根据(1)至(8)任一项的抗体的方法获得，所述方法包括以下步骤：培养转化有含编码所述抗体的多核苷酸的表达载体的宿主细胞；并从前述步骤中得到的培养物中收集目标抗体。

以下，对本发明中使用的抗her3抗体进行描述。

本说明书中，术语“癌”与“肿瘤”可互换使用。

本说明书中，术语“基因”不仅包括dna，还包括其mrna、cdna及其crna。

本说明书中，术语“多核苷酸”与核酸可互换使用，并且还包括dna、rna、探针、寡核苷酸及引物。

本说明书中，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。

本说明书中，术语“细胞”还包括动物个体内的细胞和培养的细胞。

本说明书中，术语“her3”与her3蛋白可互换使用。

本说明书中，术语“cdr”是指互补性决定区(cdr)。已知抗体分子的重链及轻链中分别具有3处cdr。cdr也被称为高度可变区结构域，位于抗体的重链及轻链可变区内。这些位点具有特别高的变异性的一级结构，并且在重链及轻链的多肽链的一级结构上分别分离成3处。本说明书中，针对重链cdr，抗体cdr从重链氨基酸序列的氨基末端开始被称为cdrh1、cdrh2、cdrh3，针对轻链cdr，抗体cdr从轻链氨基酸序列的氨基末端开始被称为cdrl1、cdrl2、cdrl3。这些位点在三维结构上相互接近，决定相对于待结合抗原的特异性。

本发明中，短语“在严格条件下杂交”是指在68℃于市售的杂交溶液expresshybhybridizationsolution(clontech公司制)中杂交，或者是在0.7至1.0m的nacl存在下，使用固定有dna的滤膜于68℃杂交，然后使用0.1至2’ssc溶液(1’ssc包含150mmnacl和15mm柠檬酸钠)于68℃洗涤的条件下的可识别的杂交，或者是在其等同条件下的杂交。

1.her3

人表皮生长因子受体3(her3，也称为erbb3)是受体蛋白酪氨酸激酶，并且属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(egfr)亚家族，其还包括her1(也称为egfr)、her2和her4。her3是跨膜受体，并且由细胞外配体结合结构域(ecd)、ecd内的二聚结构域、跨膜结构域和胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(tkd)及c末端磷酸化结构域构成。已发现her3在若干类型的癌(例如乳腺癌、肠胃癌和胰腺癌)中过表达。已示出her2/her3的表达与从非侵袭进展至侵袭阶段之间的关联。

本发明中使用的her3蛋白可在从表达her3的人或非人哺乳动物(大鼠、小鼠等)细胞中直接纯化后使用或者可以通过制备细胞的细胞膜级分来使用。或者，her3可以在体外合成或者可以通过遗传工程由宿主细胞制造。遗传工程中，具体而言，将her3cdna整合入可表达her3cdna的载体中，然后可通过在包含转录和翻译所需要的酶、底物及能量物质的溶液中合成，或者通过转化其它原核宿主细胞或真核宿主细胞来表达her3，从而得到该蛋白质。或者，可以将上述经遗传工程而得到的her3表达细胞或具有表达的her3的细胞系用作her3蛋白。

her3的rna序列、cdna序列及氨基酸序列可得自公开数据库，例如，可参照诸如aaa35979(包括由氨基末端19个氨基酸残基构成的信号序列的前体)、m34309(ncbi)等登录号。

上述her3的氨基酸序列由至少1个氨基酸被替换、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列构成，并且her3还包括具有与该蛋白质等同的生物活性的蛋白质。

2.抗her3抗体的制备

本发明的针对her3的抗体可通过以下方式得到：按照本领域中通常实施的方法用her3或选自her3的氨基酸序列的任意多肽免疫动物，收集并纯化在体内制造的抗体。用作抗原的her3的生物种类不限于人，可以用来源于例如小鼠或大鼠的人以外的动物的her3免疫动物。在这种情况下，通过研究与所获异种her3结合的抗体与人her3的交叉反应性，可选出可应用于人的疾病的抗体。

另外，可通过按照已知的方法(例如，kohler和milstein，nature(1975)256，第495-497页；kennet，r.编著，monoclonalantibodies，第365-367页，plenumpress，n.y.(1980))，将制造针对her3的抗体的产抗体细胞与骨髓瘤细胞融合而建立杂交瘤，从杂交瘤得到单克隆抗体。

用作抗原的her3可通过利用遗传工程在宿主细胞中表达her3基因而得到。

具体而言，制备能够表达her3基因的载体，将所得载体转染入宿主细胞以表达该基因，然后纯化表达的her3。

还可使用通过遗传工程得到的her3表达细胞或表达her3的细胞系作为her3蛋白。以下，具体说明针对her3的抗体的获取方法。

(1)抗原的制备

用于制备抗her3抗体的抗原的实例包括her3，其为由her3的至少6个连续氨基酸的部分氨基酸序列构成的多肽及通过添加给定氨基酸序列得到的载体衍生物或其载体。

her3可从人的肿瘤组织或肿瘤细胞中直接纯化并使用。另外，her3可通过在体外(invitro)合成her3或者通过遗传工程而在宿主细胞中制造而得到。

对于遗传工程，具体而言，将her3cdna整合入能够表达her3cdna的载体后，通过在包含转录和翻译所需要的酶、底物及能量物质的溶液中合成，或将其他原核或真核转化的宿主细胞中表达her3得到her3。

另外，也可通过使将作为膜蛋白质的her3的细胞外结构域与抗体的恒定区连接获得的融合蛋白质在适当的宿主-载体系统中表达来获得作为分泌蛋白质的抗原。

her3cdna例如可通过所谓pcr法获得，在pcr法中，以表达her3cdna的cdna文库为模板，并使用特异性地扩增her3cdna的引物进行聚合酶链式反应(称为“pcr”；参见saiki，r.k.，等，science(1988)239，第487-489页)。

多肽的体外合成例如rochediagnotics，inc.制造的rapidtranslationsystem(rts)，但不限于此。

原核宿主细胞的实例包括大肠杆菌(escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。为了用目标基因转化这些宿主细胞，用包含来源于能与宿主匹配的种类的复制子(即复制起点)和调节序列的质粒载体转化宿主细胞。另外，载体优选具有能够向转化细胞赋予表型选择性的序列。

真核宿主细胞的实例包括脊椎动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。例如，常使用例如以下的脊椎动物细胞：类人猿cos细胞(gluzman，y.cell(1981)23，第175-182页、atcccrl-1650；atcc：美国典型培养物保藏中心)、小鼠成纤维细胞nih3t3(atccno.crl-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞；atccccl-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株(urlaub，g.和chasin，l.a.proc.natl.acad.sci.usa(1980)77，第4126-4220页)等，但不限于这些细胞。

可按照本领域中通常实施的方法培养由此获得的转化体，通过培养该转化体，在细胞内或细胞外制造目标多肽。

待用于进行培养的合适的培养基可根据所用宿主细胞选自常用的各种培养基。如果使用大肠杆菌，例如，可根据需要使用补充有抗生素例如氨苄西林或ipmg的lb培养基。

可利用该蛋白质的物理特性或化学特性通过任意各种已知分离方法分离和纯化通过这样的培养而在转化体的细胞内或细胞外制造的重组蛋白。

该方法的具体实例包括用通常的蛋白质沉淀剂处理、超滤、诸如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法的各种液相色谱法、透析法及其组合。

另外，通过在待表达的重组蛋白上连接6个组氨酸残基的标签，可以用镍亲和柱高效地纯化蛋白质。或者，通过在待表达的重组蛋白上连接igg的fc区，可以用蛋白质a柱高效地纯化蛋白质。

通过组合上述方法，可以容易地以高收率和高纯度大量制造目标多肽。

(2)抗her3单克隆抗体的制造

与her3特异性地结合的抗体的实例包括与her3特异性地结合的单克隆抗体，并且获得所述抗体的方法如下所述。

单克隆抗体的制造通常需要下述操作步骤：

(a)纯化用作抗原的生物体高分子，或制备抗原表达细胞；

(b)通过注射抗原免疫动物，采集血液并检测其抗体滴度以确定摘出脾脏的时机来制备制造抗体的细胞；

(c)制备骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)；

(d)将制造抗体的细胞与骨髓瘤融合；

(e)筛选制造目标抗体的杂交瘤组；

(f)将杂交瘤分割成单一细胞克隆(克隆)；

(g)任选地，为了大量制造单克隆抗体，培养杂交瘤或饲养移植了杂交瘤的动物；

(h)对由此制造的单克隆抗体的生物活性及结合特异性进行研究，或检验其作为标记试剂的特性等。

以下，将按照上述步骤详细描述单克隆抗体的制造方法，然而，该方法不限于此，例如可以使用脾细胞以外的制造抗体的细胞及骨髓瘤。

(a)抗原的纯化

可以使用通过上述方法制备的her3或其一部分肽作为抗原。

另外，也可将由表达her3的重组细胞制备的膜级分或表达her3的重组细胞自身以及通过本领域技术人员公知的方法化学合成的本发明蛋白质的一部分肽用作抗原。

此外，还可将表达her3的细胞系用作抗原。

(b)产抗体细胞的制备

将步骤(a)中得到的抗原与诸如弗式完全或不完全佐剂或硫酸铝钾的助剂混合，将所得混合物用作免疫原来免疫实验动物。在一个替选方法中，用抗原表达细胞作为免疫原来免疫实验动物。作为实验动物，可无障碍地使用已知的杂交瘤制造方法中使用的任何动物。具体而言，例如，可使用小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。但是，从与摘出的产抗体细胞融合的骨髓瘤细胞的获得容易性观点考虑，优选将小鼠或大鼠用作待免疫动物。

另外，对于待使用的小鼠和大鼠株系没有特别限制，在小鼠的情况下，例如可使用各株系例如a、akr、balb/c、bdp、ba、ce、c3h、57bl、c57bl、c57l、dba、fl、hth、ht1、lp、nzb、nzw、rf、riii、sjl、swr、wb、129等，而在大鼠的情况下，例如，可使用例如wistar、low、lewis、sprague、dawley、aci、bn、fischer等。

这些小鼠和大鼠可购自例如cleajapan，inc.和charlesriverlaboratoriesjapan，inc.等实验动物饲养销售商。

关于待免疫动物，考虑到与下述骨髓瘤细胞的融合适应性，小鼠特别优选balb/c株系，大鼠特别优选wistar和low株系。

另外，考虑抗原的人与小鼠的同源性，还优选使用除去了自身抗体的具有降低的生物体机能的小鼠，即有自身免疫疾病小鼠。

这些小鼠或大鼠在免疫时的周龄优选为5至12周龄，更优选为6至8周龄。

为了用her3或其重组体免疫动物，可使用例如weir，d.m.，handbookofexperimentalimmunologyvol.i.ii.iii.，blackwellscientificpublications，oxford(1987)；kabat，e.a.和mayer，m.m.，experimentalimmunochemistry，charlescthomaspublisherspringfield，illinois(1964)等中详细描述的已知方法。

在这些免疫方法中，本发明中的一种优选的具体方法例如如下所述。

即，首先，将充当抗原的膜蛋白质级分或表达抗原的细胞皮内或腹腔内施用于动物。但是，为了提高免疫效率，优选两种施用途径的组合，前半段进行皮内施用，后半段或仅最后一次施用进行腹腔内施用，这样，可特别地提高免疫效率。

抗原的施用日程根据待免疫动物的种类、个体差别等的不同而不同。然而，一般而言，优选抗原施用频率为3～6次、施用间隔为2至6周的施用日程，更优选抗原施用频率为3～4次、施用间隔为2至4周的施用日程。

另外，抗原的施用量根据动物的种类、个体差异等的不同而不同，然而，通常将施用量设定为0.05至5mg，优选为约0.1至0.5mg。

加强免疫在如上所述的抗原施用的1至6周后、优选1至4周后、进一步优选1至3周后进行。当免疫原为细胞时，使用1×10⁶至1×10⁷个细胞。

进行加强免疫时的抗原施用量根据动物的种类或大小等的不同而不同，然而，通常在例如小鼠的情况下，一般将施用量设定为0.05至5mg、优选为0.1至0.5mg、进一步优选为约0.1至0.2mg。当免疫原为细胞时，使用1×10⁶至1×10⁷个细胞。

加强免疫1至10天后、优选2至5天后、进一步优选2至3天后，无菌地从被免疫动物取出包含产抗体细胞的脾脏细胞或淋巴细胞。此时，测量抗体滴度，若将抗体滴度足够高的动物用作产抗体细胞的供给源，则可更有效地实施后续步骤。

此处使用的抗体滴度的测量方法的实例包括ria法或elisa法，但所述方法不限于此。例如，如果采用elisa法，本发明中的抗体滴度的测量可按照如下步骤实施。

首先，将纯化或部分纯化的抗原吸附于诸如elisa用96孔板的固相表面，用与抗原没有关系的蛋白质例如牛血清白蛋白(在下文中称为“bsa”)覆盖未吸附抗原的固相表面。洗涤该表面后，使该表面与作为一抗的连续稀释的样品(例如小鼠血清)接触，从而使上述抗原与样品中的抗体结合。

进一步添加经酶标记的针对小鼠抗体的抗体作为二抗，使其与小鼠抗体结合。洗涤后添加该酶的底物，测量因由底物的分解诱导的显色而发生的吸光度变化等，并基于测量结果计算抗体滴度。

可按照已知的方法(例如，kohler等，nature(1975)256，第495页；kohler等，eur.j.immunol.(1977)6，第511页；milstein等，nature(1977)，266，第550页；walsh，nature，(1977)266，第495页)从被免疫动物的脾脏细胞或淋巴细胞分离产抗体细胞。例如，在脾脏细胞的情况下，可采用常规方法：其中将脾脏匀浆，用不锈钢网过滤细胞，然后将悬浮于伊格尔最低必须培养基(mem)中，分离产抗体细胞。

(c)骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)的制备

对于用于细胞融合的骨髓瘤细胞没有特别限制，并且合适的细胞可从已知的细胞系中选择。但是，考虑到从融合细胞选择杂交瘤时的便利性，优选使用其选择规程已确立的hgprt(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase)缺陷株。

更具体地，hgprt缺陷株的实例包括来源于小鼠的x63-ag8(x63)、ns1-ans/1(ns1)、p3x63-ag8.u1(p3u1)、x63-ag8.653(x63.653)、sp2/0-ag14(sp2/0)、mpc11-45.6tg1.7(45.6tg)、fo、s149/5xxo、bu.1等；来源于大鼠的210.rsy3.ag.1.2.3(y3)；和来源于人的u266ar(sko-007)、gm1500×gtg-a12(gm1500)、uc729-6、licr-low-hmy2(hmy2)和来源于人的8226ar/nip4-1(np41)。这些hgprt缺陷株例如可从atcc等获得。

将这些细胞株在例如以下的合适的培养基中进行继代培养：8-氮鸟嘌呤培养基(通过向补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素及胎牛血清(以下称为“fbs”)的rpmi-1640培养基中添加8-氮鸟嘌呤得到的培养基)、iscove改良dulbecco培养基(iscove’smodifieddulbecco’smedium；imdm)或dulbecco改良eagle培养基(以下称为“dmem”)。在这种情况下，在进行细胞融合的3至4天前，用正常培养基(例如，包含10％fcs的asf104培养基(ajinomotoco.，ltd.制))进行继代培养以确保在融合当天不少于2×10⁷个细胞。

(d)细胞融合

产抗体细胞与骨髓瘤细胞的融合可按照已知的方法(weir，d.m.，handbookofexperimentalimmunologyvol.i.ii.iii.，blackwellscientificpublications，oxford(1987)；kabat，e.a.和mayer，m.m.，experimentalimmunochemistry，charlescthomaspublisherspringfield，illinois(1964)等)在不过度降低细胞存活率的条件下适当进行。

作为这样的方法，例如，可使用其中在包含高浓度聚合物例如聚乙二醇的溶液中将产抗体细胞与骨髓瘤细胞混合的化学方法、利用电刺激的物理方法等。在这些方法中，化学方法的具体实例如下所述。

即，在含高浓度聚合物的溶液中使用聚乙二醇的情况下，在分子量1500至6000、优选为2000至4000的聚乙二醇溶液中，于30℃至40℃、优选35℃至38℃的温度，将产抗体细胞与骨髓瘤细胞进混合1至10分钟、优选5至8分钟。

(e)杂交瘤群的选择

对于通过上述细胞融合而得到的杂交瘤的选择方法没有特别限制，通常使用hat(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)选择法(kohler等，nature(1975)256，第495页；milstein等，nature(1977)266，第550页)。

该方法在使用无法在氨基蝶呤中生存的hgprt缺陷株的骨髓瘤细胞得到杂交瘤时有效。即，通过在hat培养基中培养未融合细胞及杂交瘤，从而仅选择性地使耐受氨基蝶呤的杂交瘤存活并增殖。

(f)分割成单一细胞克隆(克隆)

可使用诸如甲基纤维素法、软琼脂糖法或有限稀释法的已知方法(例如参见barbara，b.m.和stanley，m.s.：selectedmethodsincellularimmunology，w.h.freemanandcompany，sanfrancisco(1980))作为杂交瘤的克隆法。在这些方法中，特别优选三维培养法例如甲基纤维素法。例如，将通过细胞融合而制造的杂交瘤群悬于甲基纤维素培养基例如clonacell-hyselectionmediumd(stemcelltechnologies公司制#03804)并培养。然后，收集所形成的杂交瘤集落，由此可得到单克隆杂交瘤。培养收集的各杂交瘤集落，并在得到的杂交瘤培养上清液中选择确认具有稳定抗体滴度的杂交瘤作为产her3单克隆抗体的杂交瘤株。

(g)通过培养杂交瘤制备单克隆抗体

通过培养由此选择的杂交瘤，可高效地得到单克隆抗体。但优选在培养之前，筛选制造目标单克隆抗体的杂交瘤。

在这样的筛选中，可采用已知的方法。

本发明中的抗体滴度的测量例如可通过上述(b)项中说明的elisa法进行。

通过上述方法得到的杂交瘤可在液氮中或-80℃以下的冰箱中以冷冻状态保存。

完成克隆之后，将培养基从ht培养基更换成正常培养基，并培养杂交瘤。

大量培养通过使用大型培养瓶的旋转培养或旋动培养进行。利用本领域技术人员公知的方法例如凝胶过滤纯化可以从通过该大量培养获得的上清液得到本发明的特异性地与蛋白质结合的单克隆抗体。

另外，向与杂交瘤同株的小鼠(例如，上述balb/c)或nu/nu小鼠的腹腔内注射杂交瘤，使该杂交瘤增殖，由此，可得到含有大量本发明的单克隆抗体的腹水。

在腹腔内施用杂交瘤的情况下，如果事先(3至7天前)施用矿物油例如2，6，10，14-四甲基十五烷(姥鲛烷)，则可得到更多量的腹水。

例如，向与杂交瘤同系的小鼠的腹腔内预先注射免疫抑制剂，使t细胞失活。20天后，使10⁶至10⁷个杂交瘤克隆细胞悬于不含血清的培养基(0.5ml)中并施用于腹腔内。通常，在腹部膨胀而且积存腹水时，从小鼠采集腹水。通过该方法，可得到与培养液中相比为约100倍以上的浓度的单克隆抗体。

通过上述方法得到的单克隆抗体可通过例如weir，d.m.：handbookofexperimentalimmunology，vol.i，ii，iii，blackwellscientificpublications，oxford(1978)中所述的方法纯化。

由此得到的单克隆抗体对her3具有高抗原特异性。

(h)单克隆抗体的检验

可按照以下方式确定由此得到的单克隆抗体的同种型及亚类。

首先，鉴定法的实例包括ouchterlony法、elisa法和ria法。

ouchterlony法简单，但在单克隆抗体的浓度低时，需要进行浓缩操作。

另一方面，当使用elisa法或ria法时，通过使培养上清液与抗原吸附固相直接反应，并使用作为二抗的各种免疫球蛋白同种型和亚类相对应的抗体可鉴定单克隆抗体的同种型和亚类。

另外，也可利用市售的鉴定用试剂盒(例如，mousetyperkit；bio-radlaboratories，inc.制)等作为更简单的方法。

此外，蛋白质的定量确定可通过folinlowry法及基于280nm时的吸光度(1.4(od280)＝免疫球蛋白1mg/ml)计算的方法进行。

此外，甚至在通过再次进行(2)的(a)至(h)的步骤单独地和独立地获得单克隆抗体时，可获得具有与抗her3抗体等同的细胞毒性活性的抗体。作为这样的抗体中的一个实例，可举出与抗her3抗体相同的表位结合的抗体。若新制造的单克隆抗体与抗her3抗体所结合的部分肽或部分立体结构结合，则可判断为该单克隆抗体与her3抗体结合于相同的表位。另外，通过确认该单克隆抗体与抗her3抗体竞争向her3的结合(即，该单克隆抗体干扰抗her3抗体与her3的结合)，即使不确定具体的表位的序列或结构，也能判断该单克隆抗体与抗her3抗体结合于相同的表位。当确认了表位相同时，强烈期待该单克隆抗体具有与抗her3抗体相同的抗原结合能力或生物活性。

(3)其他抗体

本发明的抗体除了包括上述针对her3的单克隆抗体之外，还包括为了降低对人的异种抗原性而通过人为修饰得到的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。这些抗体可使用已知的方法制造。

作为嵌合抗体，可例示其中抗体可变区和恒定区来源于不同种类的抗体，例如其中来源于小鼠或大鼠的抗体可变区连接至来源于人的恒定区的嵌合抗体(参见proc.natl.acad.sci.u.s.a.，81，6851-6855，(1984))。

作为人源化抗体，可例示通过仅将互补性决定区(cdr)整合入来源于人的抗体而得到的抗体(参见nature(1986)321，第522-525页)和通过cdr移植法除了向人抗体移植cdr的序列之外、还移植一部分构架的氨基酸残基而得到的抗体(wo90/07861)。

本文所用术语“若干”是指1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1或2。

根据本发明，应理解，本发明结合蛋白的氨基酸序列不限于20种常规氨基酸(参见，immunology-asynthesis(第2版，e.s.golub和d.r.gren编著，sinauerassociates，sunderland，mass.(1991)，其通过引用并入本文)。例如，氨基酸可包括20种常规氨基酸的立体异构体(例如，d-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-氨基酸、α-二取代氨基酸、n-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸。也可以是用于结合本发明蛋白质的合适组分的非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-n，n，n-三甲基赖氨酸、ε-n-乙酰基赖氨酸、o-磷酸丝氨酸、n-乙酰基丝氨酸、n-甲酸基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-n-甲基精氨酸基其他类似氨基酸和亚氨基酸例如4-甲基脯氨酸。

作为本说明书中的氨基酸替换，优选保守的氨基酸替换。保守的氨基酸替换是指在与氨基酸侧链相关的氨基酸群组内发生的替换。优选的氨基酸群组如下：酸性群组(天冬氨酸和谷氨酸)；碱性群组(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；非极性群组(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)；及非带电极性家族(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)。更优选氨基酸群组如下：脂肪族羟基群组(丝氨酸和苏氨酸)；含酰胺群组(天冬酰胺和谷氨酰胺)；脂肪族群组(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；以及芳香族群组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)。这样的氨基酸替换优选在不有损于具有原始氨基酸序列的物质的特性的范围内进行。当本发明抗体的重链和轻链具有谷氨酰胺作为n-端氨基酸时，其可环化(为焦谷氨酰胺形式)。在本发明中，这样的焦谷氨酰胺与正常谷氨酰胺在氨基酸序列上不予区分。在本发明抗体的重链和轻链中，半胱氨酸可以为半胱氨酰形式。在本发明中，这样的半胱氨酰形式与正常半胱氨酸在氨基酸序列上不予区分。

另外，本发明的抗体包括与her3结合的人抗体。抗her3人抗体是指仅具有来源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体。抗her3人抗体可通过使用具有包含人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段的制造人抗体的小鼠的方法得到(参见tomizuka，k.等，naturegenetics(1997)16，第133-143页；kuroiwa，y.等，nucl.acidsres.(1998)26，第3447-3448页；yoshida，h.等，animalcelltechnology：basicandappliedaspectsvol.10，第69-73页(kitagawa，y.，matsuda，t.andiijima，s.编著)，kluweracademicpublishers，1999；tomizuka，k.编著，proc.natl.acad.sci.usa(2000)97，第722-727页等。)。

这样的制造人抗体的小鼠具体可按照如下建立。通过制造敲除动物及转基因动物以及使这些动物彼此交配制造这样的经遗传修饰的动物：其中内源性免疫球蛋白重链及轻链的基因座被破坏，代替地，经由酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，yac)载体等导入人免疫球蛋白重链及轻链的基因座。

另外，根据重组dna技术，通过利用分别编码这样的人抗体的重链及轻链的cdna、优选包含该cdna的载体转化真核细胞，培养制造重组人单克隆抗体的转化细胞，由此，也可从培养上清液中得到该抗体。

其中，可使用例如真核细胞，优选哺乳动物细胞例如cho细胞、淋巴细胞或骨髓瘤细胞作为宿主。

至于人抗体的制备，在国际公开no.wo2007/077028中给出了详细描述。国际公开no.wo2007/077028的内容通过引用并入本文。

另外，还已知获得从人抗体文库中选择的来源于噬菌体展示的人抗体的方法(参见wormstone，i.m.等，investigativeophthalmology&visualscience.(2002)43(7)，第2301-2308页；carmen，s.等，briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics(2002)，1(2)，第189-203页；siriwardena，d.等，ophthalmology(2002)109(3)，第427-431页等)。例如，可使用其中使人抗体的可变区作为单链抗体(scfv)在噬菌体表面表达并选择与抗原结合的噬菌体的噬菌体展示法(naturebiotechnology(2005)，23，(9)，第1105-1116页)。

通过分析基于与抗原结合而选择的噬菌体的基因，可确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的dna序列。

如果确定了与抗原结合的scfv的dna序列，则可通过制备包含该序列的表达载体、将载体导入适当的宿主而使其表达获得人抗体(wo92/01047、wo92/20791、wo93/06213、wo93/11236、wo93/19172、wo95/01438、wo95/15388；annu.rev.immunol(1994)12，第433-455页；naturebiotechnology(2005)23(9)，第1105-1116页)。

本发明的一个方面涉及与her3结合的分离的蛋白质。在本发明的一个实施方案中，本发明的分离的her3结合蛋白包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列包含：(a)seqidno：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226或230所示氨基酸序列中所含的cdrh1；(b)seqidno：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226或230所示氨基酸序列中所含的cdrh2；和(c)seqidno：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226或230所示氨基酸序列中所含的cdrh3，以及，所述轻链可变区氨基酸序列包含：(d)seqidno：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228或232所示氨基酸序列中所含的cdrl1；(e)seqidno：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228或232所示氨基酸序列中所含的cdrl2；和(f)seqidno：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228或232所示氨基酸序列中所含的cdrl3。

本发明的分离的her3结合蛋白优选地包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含：(a)含有选自seqidno：236、251、252和256中之一所示的氨基酸序列的cdrh1；(b)含有选自seqidno：258、278、280和282中之一所示的氨基酸序列的cdrh2；和(c)含有选自seqidno：283、285、309、313和315中之一所示氨基酸序列的cdrh3，并且所述轻链氨基酸序列包含：(d)含有选自seqidno：320、334、337和340中之一所示氨基酸序列的cdrl1；(e)含有选自seqidno：343、356、351和344中之一所示氨基酸序列的cdrl2；和(f)含有seqidno：360、381、385和387所示氨基酸序列的cdrl3。

在本发明的另一实施方案中，本发明的分离的结合蛋白包含重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列选自：seqidno：2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230构成的组，所述轻链可变区氨基酸序列选自：seqidno：4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232构成的组。

在本发明的又一实施方案中，本发明的分离的结合蛋白包含分别由seqidno：2和4、6和8、10和12、14和16、18和20、22和24、26和28、30和32、36和38、42和44、46和48、50和52、54和56、60和58、62和64、66和68、70和72、74和76、78和82、80和82、84和86、88和90、92和94、96和98、100和102、104和106、108和110、112和114、116和118、122和124、126和128、130和132、134和136、138和140、142和144、146和148、150和152、154和156、158和160、162和164、166和168、170和172、174和176、178和180、182和184、186和188、190和192、194和196、198和200、202和204、206和208、210和212、214和216、218和220、222和224、226和228或230和232所示的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，或者seqidno：34、40、60、62或120所示的重链可变区氨基酸序列和seqidno：58或64所示的轻链可变区氨基酸序列。

本发明的分离的her-3结合蛋白更优选地包含seqidno：42、54、70、92或96所示重链可变区氨基酸序列和seqidno：44、56、72、94或98所示轻链可变区氨基酸序列。

将包含seqidno：2和4所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-39”；将包含seqidno：6和8所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-40”；将包含seqidno：10和12所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-38”；将包含seqidno：14和16所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-41”；将包含seqidno：18和20所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-42”；将包含seqidno：22和24所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-43”；将包含seqidno：26和28所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-44”；将包含seqidno：30和32所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-45”；将包含seqidno：36和38所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-47”；将包含seqidno：42和44所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-49”；将包含seqidno：46和48所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-50”；将包含seqidno：50和52所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-51”；将包含seqidno：54和56所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-53”；将包含seqidno：60和58所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-55”；将包含seqidno：62和64所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-57”；将包含seqidno：66和68所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-58”；将包含seqidno：70和72所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-59”；将包含seqidno：74和76所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-52”；将包含seqidno：78和82所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-61”；将包含seqidno：80和82所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-61.1”；将包含seqidno：84和86所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-62”；将包含seqidno：88和90所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-2”；将包含seqidno：92和94所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-7”；将包含seqidno：96和98所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-9”；将包含seqidno：100和102所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-10”；将包含seqidno：104和106所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-12”；将包含seqidno：108和110所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-13”；将包含seqidno：112和114所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-14”；将包含seqidno：116和118所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-15”；将包含seqidno：122和124所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-20”；将包含seqidno：126和128所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-21”；将包含seqidno：130和132所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-22”；将包含eqidno：134和136所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-23”；将包含seqidno：138和140所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-24”；将包含seqidno：142和144所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-25”；将包含seqidno：146和148所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-26”；将包含seqidno：150和152所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-27”；将包含seqidno：154和156所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-28”；将包含seqidno：158和160所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-31”；将包含seqidno：162和164所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-32”；将包含seqidno：166和168所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-35”；将包含seqidno：170和172所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-36”；将包含seqidno：174和176所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-37”；将包含seqidno：178和180所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-34”；将包含seqidno：182和184所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-1”；将包含seqidno：186和188所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-3”；将包含seqidno：190和192所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-4”；将包含seqidno：194和196所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-5”；将包含seqidno：198和200所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-6”；将包含seqidno：202和204所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-8”；将包含seqidno：206和208所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“ul-11”；将包含seqidno：210和212所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-16”；将包含seqidno：214和216所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-17”；将包含seqidno：218和220所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-18”；将包含seqidno：222和224所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-33”；将包含seqidno：226和228所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-29”；将包含seqidno：230和232所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-30”；将包含seqidno：34所示重链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-46”；将包含seqidno：40所示重链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-48”；将包含seqidno：60和58所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-55.1”；将包含seqidno：120所示重链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-19”；将包含seqidno：62和64所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的抗体称为“u1-57.1”；在实施例中对这些抗体进行详细描述。本发明的分离的her3结合蛋白进一步更优选地包含分别由seqidno：42和44所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列、包含分别由seqidno：54和56所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列、包含分别由seqidno：70和72所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列、包含分别由seqidno：92和94所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列、包含分别由seqidno：96和98所示重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，以及还进一步更优选地，her3结合蛋白是作为抗-her3抗体的u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9。

[化学式14]

序列表

抗体u1-39

1重链dna：

2重链蛋白质：

3轻链dna：

4轻链蛋白质：

抗体u1-40

5重链dna：

6重链蛋白质：

7轻链dna：

8轻链蛋白质：

抗体u1-38

9重链dna：

10重链蛋白质：

11.轻链dna：

12轻链蛋白质：

抗体u1-41

13重链dna：

14重链蛋白质：

15轻链dna：

16轻链蛋白质：

抗体u1-42

17重链dna：

18重链蛋白质：

19轻链dna：

20轻链蛋白质：

抗体u1-43

21重链dna：

22重链蛋白质：

23轻链dna：

24轻链蛋白质：

抗体u1-44

25重链dna：

26重链蛋白质：

27轻链dna：

28轻链蛋白质：

抗体(u1-45)

29重链dna：

30重链蛋白质：

31轻链dna：

32轻链蛋白质：

抗体(u1-46)

33重链dna：

34重链蛋白质：

抗体u1-47

35重链dna：

36重链蛋白质：

37轻链dna：

38轻链蛋白质：

抗体u1-48

39重链dna：

40重链蛋白质：

抗体u1-49

41.重链dna：

42重链蛋白质：

43轻链dna：

44轻链蛋白质：

抗体u1-50

45重链dna：

46重链蛋白质：

47轻链dna：

48轻链蛋白质：

49抗体u1-51

重链dna：

50重链蛋白质：

51轻链dna：

52轻链蛋白质：

抗体u1-53

53重链dna：

54重链蛋白质：

55轻链dna：

56轻链蛋白质：

抗体u1-55

57轻链dna：

58轻链蛋白质：

抗体u1-55.1

59重链dna：

60重链蛋白质：

抗体u1-57

61重链dna：

62重链蛋白质：

抗体u1-57.1

63轻链dna：

64轻链蛋白质：

抗体u1-58

65重链dna：

66重链蛋白质：

67轻链dna：

68轻链蛋白质：

抗体u1-59

69重链dna：

70重链蛋白质：

71轻链dna：

72轻链蛋白质：

抗体u1-52

73重链dna：

74重链蛋白质：

75轻链dna：

76轻链蛋白质：

抗体u1-61

77重链dna：

78重链蛋白质：

抗体u1-61.1

79重链dna：

80重链蛋白质：

81轻链dna：

82轻链蛋白质：

抗体u1-62(2.9.1)

83重链dna：

84重链蛋白质：

85轻链dna：

86轻链蛋白质：

抗体u1-2：

87重链dna：

88重链蛋白质：

89轻链dna：

90轻链蛋白质：

抗体u1-7

91重链dna：

92重链蛋白质：

93轻链dna：

94轻链蛋白质：

抗体u1-9

95重链dna：

96重链蛋白质：

97轻链dna：

98轻链蛋白质：

抗体u1-10

99重链dna：

100重链蛋白质：

101.轻链dna：

102轻链蛋白质：

抗体u1-12

103重链dna：

104重链蛋白质：

105轻链dna：

106轻链蛋白质：

抗体u1-13

107重链dna：

108重链蛋白质：

109轻链dna：

110轻链蛋白质：

抗体u1-14

111重链dna：

112重链蛋白质：

113轻链dna：

114轻链蛋白质：

抗体u1-15

115重链dna：

116重链蛋白质：

117轻链dna：

118轻链蛋白质：

抗体u1-19

119轻链dna：

120轻链蛋白质：

抗体u1-20

121重链dna：

122重链蛋白质：

123轻链dna：

124轻链蛋白质：

抗体u-21

125重链dna：

126重链蛋白质：

127轻链dna：

128轻链蛋白质：

抗体u-22

129重链dna：

130重链蛋白质：

131轻链dna：

132轻链蛋白质：

抗体u-23

抗体u1-23

133重链dna：

134重链蛋白质：

135轻链dna：

136轻链蛋白质：

抗体u1-24

137重链dna：

138重链蛋白质：

139轻链dna：

140轻链蛋白质：

抗体u1-25

141重链dna：

142重链蛋白质：

143轻链dna：

144轻链蛋白质：

抗体u1-26

145重链dna：

146重链蛋白质：

147轻链dna：

148轻链蛋白质：

抗体u1-27

149重链dna：

150重链蛋白质：

151轻链dna：

152轻链蛋白质：

抗体u1-28

153重链dna：

154重链蛋白质：

155轻链dna：

156轻链蛋白质：

抗体u1-31

157重链dna：

158重链蛋白质：

159轻链dna：

160轻链蛋白质：

抗体u1-32

161重链dna：

162重链蛋白质：

163轻链dna：

154轻链蛋白质：

抗体u1-35

165重链dna：

166重链蛋白质：

167轻链dna：

168轻链蛋白质：

抗体u1-36

169重链dna：

170重链蛋白质：

171轻链dna：

172轻链蛋白质：

抗体u1-37

173重链dna：

174重链蛋白质：

175轻链dna：

176轻链蛋白质：

抗体u1-34

177重链dna：

178重链蛋白质：

179轻链dna：

180轻链蛋白质：

抗体u1-1

181重链dna：

182

183

184

185

186

187

188

抗体u1-4

h3_133_1n1g1

189量链dna：

190重链蛋白质：

191轻链dna：

192轻链蛋白质：

抗体u1-5

193重链dna：

194重链蛋白质：

195轻链dna：

196轻链蛋白质：

抗体u1-8

197重链dna：

198重链蛋白质：

199轻链dna：

200轻链蛋白质：

抗体u1-8

201重链dna：

202重链蛋白质：

203轻链dna：

204轻链蛋白质

抗体u1-11

205重链dna：

206重链蛋白质：

207轻链dna：

208轻链蛋白质：

抗体u1-16

209重链dna：

210重链蛋白质：

211轻链dna：

212轻链蛋白质：

抗体u1-17

213重链dna：

214重链蛋白质：

215轻链dna：

216轻链蛋白质：

抗体u1-18

217重链dna：

218重链蛋白质：

219轻链dna：

220轻链蛋白质：

抗体u1-33

221重链dna：

222重链蛋白质：

223轻链dna：

224轻链蛋白质：

抗体u1-33

225重链dna：

226重链蛋白质：

227轻链dna：

228轻链蛋白质：

抗体u1-30

229重链dna：

230重链蛋白质：

231轻链dna：

232轻链蛋白质：

[化学式15]

当新制造的单克隆抗体能与u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9抗体所结合的部分肽或部分三级结构结合时，可确定该抗体与u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9抗体在相同的表位结合。此外，通过确认该抗体与u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9抗体竞争与her3的结合(即，该抗体抑制u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9抗体与her3之间的结合)，可确定该抗体与u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9抗体在相同的表位结合，即便在表位的具体序列或结构未被界定时亦如此。一旦确认了表位相同，则该抗体特别有望具有与u1-49、u1-53、u1-59、u1-7或u1-9抗体等同的生物活性。

根据本发明，本发明的结合蛋白与her3胞外部分中的至少一个表位相互作用。所述表位优选地位于结构域l1(aa19-184)中，其为氨基末端结构域；结构域s1(aa185-327)和s2(500-632)中，其为两个富含半胱氨酸的结构域；结构域l2(328-499)中，其通过两个富含半胱氨酸的结构域侧接或her3结构域的组合。所述表位还可位于例如但不限于由l1和s1部分构成的表位的结构域的组合。此外，本发明的结合蛋白的特征还在于其与her3的结合减少her3介导的信号转导。根据本发明，her3介导的信号转导的减少可例如由导致her3分子至少有一部分从细胞表面消失的her3下调引起，或者由her3在细胞表面以基本失活的形式(即，与非稳定化形式相比表现出较低的信号转导的形式)稳定化引起。或者，her3介导的信号转导减少也可由以下引起：影响(例如，降低或抑制)配体或her家族的另一成员与her3的结合、grb2与her-2的结合或grb2与shc的结合，或者通过抑制受体酪氨酸激酶磷酸化、akt磷酸化、pyk2酪氨酸磷酸化或erk2磷酸化；或者通过减少肿瘤侵袭。或者，her3介导的信号传导减少还可由影响(例如，降低或抑制)含二聚物的her3及其它her家族成员的形成引起。一个例子可以是减少或抑制her3-egfr蛋白质复合物形成。

此外，根据本发明，考虑到seqidno：1-232所示氨基酸序列的微小变化均涵盖在本发明内，前提是氨基酸序列的变化仍保留seqidno：1-232所示氨基酸序列的至少75％，更优选至少80％、90％、95％，及最优选99％。所述变化可发生在框架区(i.e.，cdr外)、cdr内或框架区和cdr内。seqidno：1-232所示氨基酸序列的优选变化(即，缺失、插入和/或替换至少一个氨基酸)发生在功能性结构域的边界附近。可通过将核苷酸核/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构和功能结构域。可以采用计算机化比较方法来鉴定存在于结构和/或功能已知的其他结合蛋白中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。用于鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见，例如，bowie等，science253，164(1991)；proteins，structuresandmolecularprinciples(creighton，ed.，w.h.freemanandcompany，newyork(1984))；introductiontoproteinstructure(c.branden和j.tooze，eds.，garlandpublishing，newyork，n.y.(1991))；以及thornton等，nature354，105(1991)，其全部通过引用并入本文。因此，本领域技术人员可识别可用于界定根据本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。在通过组合具有这样的氨基酸序列变化的重链和轻链获得的抗体中，可以选择与原始抗体(亲本抗体)等同的抗体或比亲本抗体更优异的抗体。如上所提及的，本发明的her3结合蛋白、抗her3抗体等保留her3结合活性，即使其氨基酸序列有变化亦如此。

在本发明中，术语“同源性”与“同一性”含义相同。两种氨基酸序列间的同源性可通过使用blastalgorithmversion2.2.2(altschul，stephenf.，thomasl.madden，alejandroa.schaeffer，jinghuizhang，zhengzhang，webbmiller，anddavidj.lipman(1997)，“gappedblastandpsi-blast：anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”，nucleicacidsres.25：3389-3402)的默认参数来确定。blastalgorithm也可通过访问互联网www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。

可以对通过前述方法获得的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体进行用于评价与抗原的结合特性的已知方法以选择优选的抗体。

在本发明的抗-her3抗体中，还包括mehd-7945a(或duligotuzumab)、rg-7116、mm-111、mm-121(或seribantumab、mm-141、ljm-716、huher3-8、三特异性抗-egfr/erbb3zybody、gsk-2849330、regn-1400、ktn-3379、av-203、单特异性surrobody(erbb3)、lumretuzumab、mp-ev-20、zw-9、dimercept^tm、抗erb3surrobody(sl-175或sl-176)、sym-013、变体、活性片段、其经修饰产物等。

作为用于比较抗体特性的其他指标的一例，可例示抗体的稳定性。差示扫描量热测量仪(dsc)是能快速且准确地测量用作蛋白质的相对构象稳定性的有利指标的热变性中点温度(tm)的装置。通过使用dsc测量tm值，比较该值，可比较热稳定性的不同。已知抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性显示一定程度的相关性(loriburton，等，pharmaceuticaldevelopmentandtechnology(2007)12，第265-273页)，使用热稳定性为指标，可选出合适的抗体。用于选择抗体的其他指标的实例包括如下特征：在适当的宿主细胞中的收量高；以及在水溶液中的凝集性低。例如，收量最高的抗体不一定总显示最高的热稳定性，因此，有必要基于上文说明的指标综合判断，选择最合适施用于人的抗体。

本发明的抗体涵盖抗体的经修饰产物。该经修饰变体是指通过对本发明的抗体进行化学修饰或生物修饰获得的变体。经化学修饰变体的实例包括通过将化学部分连接于氨基酸骨架化学地修饰的变体、连接于n-连接或o-连接的糖链化学地修饰的变体等。经生物修饰变体的实例包括翻译后经修饰(例如，n-连接或o-连接的糖基化、n末端或c末端的加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化)获得变体和通过在原核生物宿主细胞中表达向n末端添加甲硫氨酸残基而得到的变体。另外，为了能进行本发明抗体或抗原的检出或分离而标记的抗体例如酶标记的抗体、荧光标记的抗体和亲和标记的抗体也包括在所述经修饰变体的含义之内。这样的本发明抗体的经修饰变体对于改善抗体的稳定性及血中滞留性、降低其抗原性、检出或分离抗体或抗原等是有用的。

另外，通过调节连接于本发明的抗体的糖链修饰(糖基化、脱岩藻糖化等)，可增强抗体依赖性细胞毒性活性。作为抗体的糖链修饰的调节技术，已知wo1999/54342、wo2000/61739、wo2002/31140等。然而，该技术不限于此。在本发明的抗体中，还包括调节了该糖链修饰的抗体。

在首先分离抗体基因，然后将该基因导入至适当的宿主来制造抗体时，可使用适当的宿主与适当的表达载体的组合。抗体基因的具体实例包括本说明书所述编码抗体的重链序列的基因与编码其轻链序列的基因的组合。当转化宿主细胞时，可将重链序列基因和轻链序列基因插入到同一表达载体中，或者也可分别插入到不同的表达载体中。

使用真核细胞作为宿主时，可使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。作为动物细胞，可例示哺乳动物细胞，例如，类人猿cos细胞(gluzman，y.cell(1981)23，第175-182页、atcccrl-1650)、小鼠成纤维细胞nih3t3(atccno.crl-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞、atccccl-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株(urlaub，g.andchasin，l.a.proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1980)77，第4126-4220页)。

使用原核细胞时，例如，可例示大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

通过转化而向这些细胞中导入目标抗体基因，在体外培养经转化的细胞，而可得到抗体。在上述培养方法中，随着抗体的序列的不同，收量有时存在差异，因此，在具有等同结合活性的抗体中，可使用收量作为指标选出容易制造药物的抗体。因此，本发明的抗体也包括通过以下抗体制造方法得到的抗体，所述方法的特征在于，包括培养经转化的宿主细胞的步骤，及从在该培养步骤中得到的培养物中采集目标抗体或该抗体的功能性片段的步骤。

已知可缺失/消除哺乳动物培养细胞所制造的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基(journalofchromatographya，705：129-134(1995))，还已知可缺失/消除培养的哺乳动物细胞中制造的抗体的重链羧基末端的2个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)，并且可使新位于羧基末端的脯氨酸残基酰胺化(analyticalbiochemistry，360：75-83(2007))。然而，重链序列的这样的缺失/消除及修饰不影响抗体的抗原结合亲和力及效应器功能(补体的活化、抗体依赖性细胞毒性作用等)。因此，本发明的抗体还包括受到了该修饰的抗体及该抗体的功能性片段及在重链羧基末端缺失1个或2个氨基酸的缺失变体、通过使该缺失变体酰胺化得到的变体(例如，羧基末端部位的脯氨酸残基被酰胺化的重链)等。在本发明抗体的重链的羧基末端具有缺失的缺失变体的种类不限于上述变体，只要能保持抗原结合亲和力及效应器功能即可。构成本发明的抗体的2条重链可以是选自全长重链和上述缺失变体中的一种，或者可以是选自如上的两种的组合。各缺失变体的量比可受到制造本发明的抗体的哺乳动物培养细胞的种类及培养条件的影响，然而，可例示在作为本发明的抗体的主要组分的2条重链二者的羧基末端缺失1个氨基酸残基的情况。本发明完全抗体(在本发明中，也简单地称为“抗体”)的范围还包括其缺失变体、含其一种或两种或更多种缺失变体的混合物等。本发明的“抗体”包括含其中n-末端谷氨酸通过环化为焦谷氨酸形式的重链或轻链和/或其中半胱氨酸残基部分为半胱氨酸形式的抗体。

在本发明的优选实施方案中，本发明的抗her3抗体为iga、igd-、ige1、igg-或igm型，优选为igg-或igm-型，包括但不限于iggi-、igg2-、igg3-、igg4-、igmi-和igm2-型。在最优选的实施方案中，所述抗体为iggi-、igg2-或igg4-型。

作为抗体的生物活性，通常，可例示抗原结合活性、通过与抗原结合而向表达该抗原的细胞中内化的活性、将抗原的活性中和的活性、增强抗原的活性的活性、抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性、补体依赖性细胞毒性(cdc)活性及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)。本发明抗体的功能为相对于her3的结合活性，优选为通过与her3结合而向her3表达细胞中内化的活性。此外，本发明的抗体除了具有细胞内化活性之外，也可具有adcc活性、cdc活性和/或adcp活性。

在某些方面，例如，与作为针对her3的治疗性候选物的抗体的制造相关，可期望本发明的抗her3抗体能固定补体并参与补体依赖性细胞毒性(cdc)。存在许多能够实现上述的抗体同种型，包括但不限于如下：鼠igm、鼠igg2a、鼠igg2b、鼠igg3、人igm、人iggi、人igg3和人iga。应理解，所制造的抗体无需初始具有这样的同种型，而是所制造的抗体可具有任何同种型，并且该抗体可以是通过采用本领域中公知的常规分子生物学技术在合适的表达载体中将分子克隆的v区基因或cdna附接至分子克隆的恒定区基因或cdna然后采用本领域中已知的技术在宿主细胞中表达该抗体而转换的同种型。同种型改变的抗体还可具有使用本领域已知的技术经分子改造为相对于天然变体具有优越的cdc(idusogie等，jimmunol.，166，2571-2575)并在宿主细胞中重组表达的fc区。这样的技术包括采用直接重组技术(参见例如美国专利第4,816,397号)、细胞-细胞融合技术(参见，例如美国专利第5,916,771和6,207,418号)等。在细胞-细胞融合技术中，将骨髓瘤或其它细胞系(例如cho)制备成具有任何期望同种型的重链，将其它骨髓瘤或其它细胞系(例如cho)制备成具有轻链。其后，可以将这样的细胞融合并且可以分离表达完整抗体的细胞系。例如，具有与her3抗原的期望结合的人抗her3igg4抗体可容易地进行同种型转换以制造人igm、人igg1或人igg3同种型，同时仍具有相同的可变区(其定义抗体的特异性及其一些亲和性)。于是，这样的分子可能固定补体和参与cdc。

此外，还可期望本发明的抗-her3抗体能与效应细胞(例如单核细胞和天然杀伤(nk)细胞)上的fc受体结合并参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)。有许多这样的抗体的同种型，包括但不限于如下：鼠igg2a、鼠igg2b、鼠igg3、人igg1和人igg3。应理解，所制造的抗体无需初始具有这样的同种型，而是所制造的抗体可具有任何同种型，并且该抗体可以是通过采用本领域中公知的常规分子生物学技术在合适的表达载体中将分子克隆的v区基因或cdna附接至分子克隆的恒定区基因或cdna然后采用本领域中已知的技术在宿主细胞中表达该抗体而转换的同种型。同种型改变的抗体还可具有使用本领域已知的技术经分子改造为相对于天然变体具有优越的adcc(shields等，jbiolchem.，276，6591-6604)并在宿主细胞中重组表达的fc区。这样的技术包括采用直接重组技术(参见例如美国专利第4,816,397号)、细胞-细胞融合技术(参见，例如美国专利第5,916,771和6,207,418号)等。在细胞-细胞融合技术中，将骨髓瘤或其它细胞系(例如cho)制备成具有任何期望同种型的重链，将其它骨髓瘤或其它细胞系(例如cho)制备成具有轻链。其后，可以将这样的细胞融合并且可以分离表达完整抗体的细胞系。例如，具有与her3抗原的期望结合的人抗her3igg4抗体可容易地进行同种型转换以制造人igg1或人igg3同种型，同时仍具有相同的可变区(其定义抗体的特异性及其一些亲和性)。于是，这样的分子可能与效应细胞上的fcyr结合并参与adcc。

可以将所得抗体纯化至均一(homogeneous)。可使用常规的蛋白质分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可通过适当选择和组合柱色谱法、滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等对抗体进行分离和纯化(strategiesforproteinpurificationandcharacterization：alaboratorycoursemanual，danielr.marshak等编著，coldspringharborlaboratorypress(1996)；antibodies：alaboratorymanual.edharlow和davidlane，coldspringharborlaboratory(1988))，但所述方法不限于此。

这样的色谱法的实例包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法和吸附色谱法。

这样的色谱法可利用诸如hplc或fplc的液相色谱法进行。

作为亲和色谱法中使用的柱，可例示a蛋白柱、g蛋白柱。例如，作为使用了a蛋白柱的柱，可例示hyperd、poros、sepharoseff(pharmaciacorporation)等。

另外，通过使用具有固定在其上的抗原的载体，还可利用抗体与抗原的结合特性而纯化抗体。

[抗肿瘤化合物]

对本发明的抗her3抗体-药物偶联物中偶联的抗肿瘤化合物进行说明。对本发明中使用的抗肿瘤化合物没有特别限制，只要其为具有抗肿瘤效果且具有能连接于接头结构的取代基、部分结构的化合物即可。当抗肿瘤化合物的接头的一部分或全部在肿瘤细胞内被切断时，释放出抗肿瘤化合物部分，从而显示抗肿瘤效果。在与药物的连接部分切断接头时，抗肿瘤化合物以未修饰的结构释放出从而发挥其本来的抗肿瘤效果。

作为本发明中使用的抗肿瘤化合物，可优选地使用作为喜树碱衍生物的依沙替康((1s，9s)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1h，12h-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9h，15h)-二酮；如下式所示：)

[化学式16]

虽然该依沙替康具有优异的抗肿瘤活性，但并未作为抗肿瘤药商业化。该化合物可利用已知的方法容易地获得，可优选将1位氨基作为与接头结构连接的连接部位使用。另外，依沙替康也可以在仍与接头的一部分相连的情况下释放于肿瘤细胞内。然而即使是这种结构，其亦为发挥优异抗肿瘤效果的优异化合物。

因为依沙替康具有喜树碱结构，所以已知在酸性水性介质中(例如ph3左右)，平衡偏向具有闭合的内酯环的结构(闭环体)，但在碱性水性介质中(例如ph10左右)，平衡偏向具有开环的内酯环的结构(开环体)。导入了对应于上述闭环结构及开环结构的依沙替康残基的药物偶联物也有望具有同等的抗肿瘤效果，不言自明，本发明的范围中包含任意结构的该化合物。

其他的抗肿瘤化合物的实例包括多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、丝裂霉素c(mitomycinc)、博来霉素(bleomycin)、安西他滨(cyclocytidine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、铂系抗肿瘤剂(顺铂(cisplatin)或其衍生物)、紫杉醇(taxol)或其衍生物以及喜树碱或其衍生物(日本特开平6-87746号公报所述抗肿瘤剂)。

关于抗体-药物偶联物，偶联于1抗体分子的药物分子数是影响其有效性和安全性的重要因素。抗体-药物偶联物的制造通过如下进行：界定个包括反应原料和试剂的使用量在内的反应条件以使偶联的药物数为恒定的数目，与低分子量化合物的化学反应不同，通常获得含偶联不同数目的药物的混合物。用平均值即偶联的药物分子的平均数来表示或规定偶联于每1抗体分子的药物数。除非另有指明，原则上，除了表示具有不同的偶联药物分子数的抗体-药物偶联物混合物中包含的具有特定的偶联药物分子数的抗体-药物偶联物的情况之外，偶联的药物分子数是指平均值。

可控制偶联于抗体分子的依沙替康分子数，作为每1抗体偶联的药物分子数，可结合约1至10个依沙替康，优选为2至8个，更优选为3至8个。

同时，本领域技术人员可根据本申请的实施例的描述来设计用于在抗体分子上偶联所需数目的药物分子的反应，并且可得到控制了依沙替康分子的偶联数的抗体-药物偶联物。

本发明的抗体-药物偶联物不太可能发生聚集、不溶解、片段化等，即使在每个抗体分子上偶联的药物分子数增加时亦如此。

[接头结构]

关于本发明的抗her3抗体-药物偶联物，对用于将抗肿瘤化合物偶联于抗her3抗体的接头结构进行说明。该接头具有如下结构：

-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-或-l¹-l²-l^p-，

抗体连接于l¹的末端(与连接l²的一侧相反的末端)，抗肿瘤化合物连接于-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-部分的羰基或l^p的c末端。

n¹表示0至6的整数，优选为1至5的整数，更优选为1至3。

1.l¹

l¹由以下结构表示：

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)n³-c(＝o)-

其中，n³为2至8的整数，“-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-”具有下式：

[化学式17]

表示的结构。

该部分结构中的3位是与抗her3抗体的连接部位。在该3位处的与该抗体的连接的特征是形成硫醚键。该结构部分的1位的氮原子与存在于包含该结构的接头内的亚甲基的碳原子连接。具体而言，-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)n³-c(＝o)-l²-为下式表示的结构(此处，“抗体-s-”衍生自抗体。)。

[化学式18]

在该式中，n³为2至8的整数，优选为2至5。

l¹的具体实例包括如下：

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2-c(＝o)-、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-。

2.l²

l²具有下式

-nh-(ch2ch2-o)n⁴-ch2ch2-c(＝o)-

表示的结构，l²可以不存在，这种情况下，l²为单键。在本发明的药物-接头结构中，特别地，l^p可以直接与药物连接，并且在这样的情况下，l²特别优选为单键。n⁴为1至6的整数，优选为2至4。l²以其末端的氨基连接于l¹，以相反的末端的羰基与l^p连接。

l²的具体实例包括如下：

-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-c(＝o)-。

3.l^p

l^p为由2至7个氨基酸构成的肽残基。具体而言，其由其中2至7个氨基酸以肽键连接的寡肽残基构成。l^p在n末端连接于l²，在c末端与接头的-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-部分的氨基连接。

对构成l^p的氨基酸没有特别限制，其实例包括l-或d-氨基酸，优选为l-氨基酸。另外，除了α-氨基酸之外，其还可以是具有例如β-丙氨酸、ε-氨基己酸或γ-氨基丁酸的结构的氨基酸，此外，其也可以是非天然氨基酸，例如经n-甲基化氨基酸。

对l^p的氨基酸序列没有特别限制，但构成氨基酸的实例包括苯丙氨酸(phe；f)、酪氨酸(tyr；y)、亮氨酸(leu；l)、甘氨酸(gly；g)、丙氨酸(ala；a)、缬氨酸(val；v)、赖氨酸(lys；k)、瓜氨酸(cit)、丝氨酸(ser；s)、谷氨酸(glu；e)和天冬氨酸(asp；d)。其中，优选的实例包括苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。取决于氨基酸的种类，能够控制药物释放的模式。氨基酸的数目可以是2至7个。

l^p的具体实例包括如下：

-ggf-、

-dggf-、

-(d-)d-ggf-、

-eggf-、

-ggfg-、

-sggf-、

-kggf-、

-dggfg-、

-ggfgg-、

-ddggfg-、

-kdggfg-、

-ggfgggf-。

上述的“(d-)d”表示d-天冬氨酸。本发明的抗体-药物偶联物中特别优选的l^p包括四肽残基-ggfg-和-dggfg-。此外，在本发明的药物-接头结构中，l^p可直接与药物连接，并且对于这样的情况，l^p的优选实例包括五肽残基-dggfg-。

4.l^a-(ch2)n²-c(＝o)-

l^a-(ch2)n²-c(＝o)-中的l^a为-o-的结构或单键。n²为0至5的整数，优选为0至3，更优选为0或1。

l^a-(ch2)n²-c(＝o)-的实例包括如下。

-o-ch2-c(＝o)-、

-o-ch2ch2-c(＝o)-、

-o-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-o-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-o-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-ch2-c(＝o)-、

-ch2ch2-c(＝o)-、

-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-。

其中，优选具有：

-o-ch2-c(＝o)-、

-o-ch2ch2-c(＝o)-的那些

或者其中l^a为单键且n²为0的那些。

由-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-表示的接头结构的具体实例包括：

-nh-ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2ch2ch2ch2-c(＝o)-。

其中，更优选如下实例：

-nh-ch2ch2ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2-o-ch2-c(＝o)-、

-nh-ch2ch2-o-c(＝o)-。

对于接头-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-而言，优选4至7个原子的链长，更优选具有5或6个原子的链长的那些。

对于本发明的抗-her3抗体-药物偶联物而言，认为接头部分在转移至肿瘤细胞内时被切断，释放出具有nh2-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-(nh-dx)表示的结构的药物衍生物而显示抗肿瘤作用。通过从本发明的抗体-药物偶联物中释放而显示抗肿瘤效果的抗肿瘤性衍生物的实例包括具有其中接头-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-表示的结构的末端是氨基的结构部分的抗肿瘤性衍生物，特别优选包括如下。

nh2-ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

nh2-ch2ch2ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

nh2-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)、

nh2-chch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)。

同时，确认了在nh2-ch2-o-ch2-c(＝o)-(nh-dx)的情况下，由于位于该分子内的缩醛胺结构不稳定，因而再次经历自分解而释放出

ho-ch2-c(＝o)-(nh-dx)。

这些化合物也可优选地用作本发明的抗体-药物偶联物的制造中间体。

此外，在本发明的药物-接头结构中，存在l^p可直接连接至药物的情况。在这样的情况下，当l^p的c末端为甘氨酸时，待释放抗肿瘤药是依莎替康本身或具有与依莎替康的氨基结合的甘氨酸的化合物。

对于使用依沙替康作为药物的本发明的抗体-药物偶联物，优选将具有如下结构[-l¹-l²-l^p-nh-(ch2)n¹-l^a-(ch2)n²-c(＝o)-(nh-dx)]或-l¹-l²-l^p-(nh-dx)的药物-接头结构部分连接于抗体。这些药物-接头结构部分的偶联数作为每1抗体的平均偶联数可以为1至10，优选为2至8，更优选为3至8。