本发明涉及一种ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法与应用，属于纳米药物领域。
背景技术：
β-榄香烯是从莪术油中提取出来的有效成分，具有抗肿瘤、抗血栓、抗病毒等生理活性成分，能够在抗肿瘤、抗菌、保肝、抗银屑病等方面发挥临床疗效，临床应用和产品开发前景广阔。但是，β-榄香烯不溶于水，口服生物利用度较低，制约了β-榄香烯创新制剂的开发和临床应用。
因β-榄香烯常温下以液态形式存在，具有一定粘附性，且易于挥发，这导致了β-榄香烯制剂研究与开发过程中较难以定量，不易保存；在将β-榄香烯做成普通乳剂后仍然存在因挥发性问题导致的稳定性较差、药物有效性短等问题。
固化自微乳技术是纳米技术中改善难溶性化合物功效的重要技术，是将液体自微乳转换成固体自微乳的方法和过程，通过固体化工艺可以将自微乳进一步制备成干乳剂、片剂、微丸、栓剂、植入剂等，还可以通过包衣技术或加入高分子骨架材料制得缓释型固体自微乳。固体化方法主要有固体载体直接吸附法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等。如有文献报到，以甘露醇为吸收剂，将β-榄香烯自微乳进行固化，但存在释药部位不可控，和干燥过程中β-榄香烯容易挥发等问题(李兆明.β-榄香烯固体自微乳自微乳制剂的研究[d],山东中医药大学,2009年)。这些问题不仅导致无法控制β-榄香烯释药部位，并造成β-榄香烯制剂稳定性的下降，进而影响临床疗效。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种β-榄香烯搭载在ph响应型介孔二氧化硅纳米粒制剂及其制备方法。本发明制备的ph响应型介孔二氧化硅纳米粒对搭载的药物β-榄香烯起到保护和定位释放效果，从而提高了药物稳定性，并提高β-榄香烯的生物利用度。
本发明通过β-榄香烯搭载在ph响应型介孔二氧化硅纳米粒，实现β-榄香烯的固化和减少了挥发，提高了制剂稳定性；实现β-榄香烯ph响应型释放，在中性条件下不释放β-榄香烯，口服进入胃部时在较低的ph值下能够响应释放β-榄香烯，进而在进入小肠时实现药物的转运和吸收，提高口服给药β-榄香烯的生物利用度。
本发明中，在介孔二氧化硅表面修饰氨基基团，并通过物理方法搭载β-榄香烯和化学偶联的方式进行表面ph响应型修饰。β-榄香烯可通过聚丙烯酸中的-cooh基团与介孔二氧化硅载体上的氨基进行酰胺化反应，从而使聚丙烯酸通过化学偶联的方式与氨基化介孔二氧化硅载体共价连接，从而达到载药效果。该方法可显著提高药物的装载量，同时可提高药物的稳定性，并实现药物的定位释放，从而提高β-榄香烯的生物利用度。
本发明提供了一种ph响应型搭载β-榄香烯的介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
1)对介孔二氧化硅进行表面氨基化修饰，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
2)将β-榄香烯与所述氨基化介孔二氧化硅纳米粒混合，进行孵育，得到氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒；
3)所述氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒与聚丙烯酸水溶液混合，进行孵育，即得到ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
上述的方法中，制备所述介孔二氧化硅的方法包括如下步骤：
将十六烷基三甲基氯化铵、水、氢氧化钠混合，调节混合体系ph值可为9～12，具体可为9或11，然后滴加入正硅酸四乙酯反应，反应后分离出沉淀，将其煅烧，得到所述介孔二氧化硅。
本发明中，制备所述介孔二氧化硅的方法中，所述反应后分离出沉淀的过程为将体系自然冷却至室温，离心，用水和乙醇分别洗涤，然后干燥沉淀；
高温煅烧除去所述十六烷基三甲基氯化铵。
上述的方法中，所述十六烷基三甲基溴化铵、所述水与所述氢氧化钠的质量比可为0.1:300～500:0.02～0.08，具体可为0.1:450:0.03、0.1:450:0.027、0.1:450:0.024、0.1:450:0.024～0.03、0.1:300～450:0.02～0.08、0.1:450～500:0.02～0.08或0.1:400～500:0.02～0.05；
所述正硅酸四乙酯与所述十六烷基三甲基氯化铵的质量比可为0.25～1:0.1，具体可为0.372:0.1、0.25～0.372:0.1、0.372～1:0.1或0.3～0.75:0.1；
在温度可为70～80℃时滴加所述正硅酸四乙酯，具体可在80℃时滴加；
制备所述介孔二氧化硅的方法中，所述反应温度可为70～80℃，具体可为80℃或75～80℃，时间可为2～4小时，具体可为4小时、3～4小时或2.5～4小时；
所述煅烧的温度可为500～550℃，具体可为550℃，时间可为5～6h，具体可为5h或5～5.5h。
上述的方法中，步骤1)中所述介孔二氧化硅进行表面氨基化修饰过程如下：所述介孔二氧化硅分散于水中，然后与醋酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反应。
本发明中，所述介孔二氧化硅进行表面氨基化修饰的后处理过程具体如下：过滤处理，依次用去离子水和乙醇洗三次，置于真空干燥箱中真空30℃下干燥12h。
上述的方法中，所述介孔二氧化硅的质量与所述醋酸、所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为2mg:2μl:1～2μl，具体可为2mg:2μl:1μl或1mg:1μl:1μl；
所述介孔二氧化硅分散于水中的浓度可为4～6mg/ml，具体可为4mg/ml、4～5mg/ml或4～5.5mg/ml；
步骤1)中进行表面氨基化修饰的条件如下：室温，时间可为20～24h，具体可为24h或22～24h。
上述的方法中，所述β-榄香烯与所述氨基化介孔二氧化硅纳米粒的质量比可为1:20～30，具体可为1:30或1:25～30；
步骤2)中所述孵育的条件：室温，时间为12～24h，具体可为12h或12～20h。
本发明中，步骤2)中所述孵育结束后产物用甲醇洗涤、离心，在30℃真空干燥过夜。
上述的方法中，所述聚丙烯酸水溶液的质量浓度可为0.2～0.5％，具体可为0.2％、0.2～0.3％或0.2～0.4％；
所述氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒与所述聚丙烯酸水溶液的质量比可为20:1～2具体可为20:1；
步骤3)中所述孵育的条件：室温，时间可为2～4h，具体可为2h或2～3h。
本发明中，步骤3)中所述孵育结束后产物用甲醇洗涤、离心，在30℃真空干燥过夜。
本发明还提供了上述的方法制备得到的所述ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
本发明中，所述ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒计算体外释放试验时，在ph3.5的介质中，实验初期20小时为缓释阶段，释放速率较快；20小时之后达到释放平衡，平衡释放量为80％，但在ph7.4时，平衡释放量仅有38％，说明聚丙烯酸聚合物能够以ph响应的方式释放包埋的β-榄香烯。
本发明中，所述ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒的粒径可为120～140nm；搭载率可为8～12％。
本发明进一步提供了一种ph响应型β-榄香烯缓释药物，其活性成分为上述ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
上述ph响应型β-榄香烯缓释药物中，所述药物的剂型为口服药物。
本发明具有以下优点：
1、ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒具有良好的物理稳定性，耐热耐高温，且形状稳定；
2、介孔二氧化硅纳米粒粒径可控，无明显细胞毒性，且能够被肿瘤细胞吞噬；
3、ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒拥有巨大的比表面积和孔容，使得该类载体拥有高的载药量；
4、纳米粒的孔径有序规整，且大小可控，能通过调节孔径改变载药量，同时能制成缓释制剂实现药物的缓释控释，提高药物生物利用度；
5、内外表面易于修饰，为纳米粒的多功能化提供基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中制得的介孔二氧化硅载体的透射电镜图。
图2为本发明实施例2中制得的介孔二氧化硅载体的透射电镜图。
图3为本发明实施例8中的红外光谱图。
图4为本发明β-榄香烯在不同ph值下在磷酸盐缓冲液中的从ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒中体外释放曲线。
图5为本发明介孔二氧化硅纳米粒(a1：粒径；b1：多分散系数)和ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒(a2：粒径；b2：多分散系数)的稳定性考察图。
图6为ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒(实线)和β-榄香烯普通乳剂(虚线)大鼠灌胃给药后测得的药时曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、介孔二氧化硅的制备
(1)将0.76ml(2mol·l-1)的氢氧化钠，0.2g十六烷基三甲基氯化铵，900ml超纯水混合，控制ph为11，80℃水浴下加热，以一定的转速搅拌。
(2)溶液混合均匀且温度恒定后以一定的速度(0.05ml/min)滴加0.8ml正硅酸四乙酯(密度相对密度(水＝1)：0.93)。继续搅拌4小时，得到乳白色的悬浊液。在室温下自然冷却，10000r/min离心10min分离，用水和乙醇分别洗涤离心后干燥沉淀。最后将白色沉淀放在马弗炉中550℃高温煅烧5h，出去表面活性剂模板剂，得到介孔二氧化硅纳米粒透射电子显微镜结果见图1。
实施例2、介孔二氧化硅的制备
同本发明实施例1，将步骤(1)中加入氢氧化钠的量改为0.60ml控制ph的值为9.0，其他条件不变，制得介孔二氧化硅得到介孔二氧化硅纳米粒透射电子显微镜结果见图2。
实施例3、介孔二氧化硅的制备
同本发明实施例1，将步骤(1)中加入氢氧化钠的量改为0.68ml控制ph的值为10.0，其他条件不变，制得介孔二氧化硅纳米粒。
表1实施例1-3数据表
本发明实施例1-3的实验结果总结如表一所示。由表1结果可知：控制不同ph合成出具有不同窄分布粒径的具有六维孔道的二氧化硅纳米粒，且孔径大小适中，具有较大的比表面积及孔容。
实施例4、
取20mg本发明实施例1的介孔二氧化硅分散在5ml的去离子水中，加入20μl的醋酸，10μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌24h后过滤处理，依次用去离子水和乙醇洗涤3次，30℃下真空干燥12h，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒。
实施例5、
取20mg实施例1的介孔二氧化硅分散在5ml的去离子水中，加入20μl的醋酸，20μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌24h后过滤处理，依次用去离子水和乙醇洗涤3次，30℃下真空干燥12h，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒。
实施例6、
把β-榄香烯与表面氨基化修饰的介孔二氧化硅纳米粒按重量比为1:30；常温下摇床中孵育12h，用甲醇洗涤、离心，在30℃真空干燥过夜得的通过氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒。
实施例7、
把氨基修饰后载药的介孔二氧化硅与0.2％的聚丙烯酸按重量比20:1的比例混合，室温下于摇床中孵育2h，用甲醇洗涤、离心，30℃下真空干燥12h，通过聚丙烯酸与氨基修饰后载药的介孔二氧化硅的化学偶联方法，获得ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
实施例8、
利用红外光谱分析法对本发明实施例1、4、7中制得的介孔二氧化硅、氨基化介孔二氧化硅及表面修饰的介孔二氧化硅进行谱图分析(图3)。由红外光谱谱图结果可知：介孔二氧化硅(a)谱线中1000-1300cm-1处为si-o-si的吸收峰，750-800cm-1处为si-o-si的吸收峰；氨基化修饰的介孔二氧化硅(b)谱线中1589cm-1出的峰较(a)峰强度增加，是-nh2的峰，2800-3000cm-1出增加三个伸缩振动峰，表明介孔二氧化硅表面成功修饰上氨基；聚丙烯酸修饰的载药介孔二氧化硅纳米粒(d)谱线中3400-3450cm-1为羟基的峰，1478cm-1的振动峰(酰胺中的n-h)，1742cm-1为羧基c＝o的的振动峰和纯聚丙烯酸(c)的特征峰一样，表明介孔二氧化硅表面成功共价修饰上聚丙烯酸。
实施例9、ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒的体外释放特性研究
准确称取实施例7所制得的聚丙烯酸修饰的介孔二氧化硅纳米粒分别分散在ph值为7.4和ph值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中。各吸取5ml于透析袋(mwco＝10000)中，透析袋置于有1000ml相应介质的烧杯中，加入磁子在300rpm下搅拌。间隔一定的时间取样，通过高效液相色谱法(c18柱，流动相为乙腈：水＝92:8，紫外检测器波长为212nm)进行定量，绘制累积释放百分比与时间的关系图(图4)。
从图中可以看出ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒的药物释放曲线在不同的ph值上有显着差异(图4)。在与正常生理环境(如组织液或血液)相似的ph7.4下，在24小时内只有38.0％的药物从ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒中释放出来。但是，80.0％的药物可以在ph3.5下释放，而且在ph3.5的条件下释药速率更快，这有利于制剂口服后在胃液中快速溶出和分散，进而有利于在小肠部位的吸收。
ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒的这种ph受控释放方式表明，在酸性条件下可以逐渐打开聚丙烯酸涂层以释放所包裹的药物。这与预期的设计一致，即聚丙烯酸可以通过酸可裂解的酰胺连接基对接到介孔二氧化硅纳米粒。这些结果为设计的ph响应型释放给药系统提供了数据支持，即证明聚丙烯酸聚合物能够以ph响应的方式释放包埋的β-榄香烯。
实施例10、稳定性考察
用纳米激光粒度仪探究纳米粒的粒径和多分散系数在存放过程中，随时间的变化情况。将纳米粒(介孔二氧化硅纳米粒、氨基化的介孔二氧化硅纳米粒、ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒)在室温下存放，分别在0、3d、7d、15d、30d、45d、60d时取样将其浓度配制为0.05mg/ml。用纳米激光粒度仪测粒径和多分散系数，考察其长期稳定性。
表2是介孔二氧化硅纳米粒(a)，氨基化的介孔二氧化硅纳米粒(b)和ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒(c)的粒径、多分散系数的考察数据。数据显示介孔二氧化硅纳米粒的平均粒径为110.6±2.1nm，多分散系数为0.31±0.03，表明介孔二氧化硅纳米粒具有良好的分散性；氨基化的介孔二氧化硅纳米粒与介孔二氧化硅纳米粒的平均粒径相近为112.8±1.9nm，其多分散系数为0.29±0.02；ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒，其平均粒径为125.4±3.4nm，多分散系数为0.25±0.04，也具有良好的分散性。
表2粒径和多分散分析
图5考察了介孔二氧化硅纳米粒和ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒的稳定性。结果显示60天内，介孔二氧化硅纳米粒和ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒在粒径变化不明显，该结果说明介孔二氧化硅纳米粒和ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒在室温存放过程中具有较好的稳定性。
实施例11、大鼠口服给药生物利用度研究
为了证明ph响应型搭载β-榄香烯的介孔二氧化硅纳米粒可以提高β-榄香烯的口服生物利用度，进行了大鼠口服给药生物利用度实验。
动物实验用β-榄香烯普通乳剂制备方法：取聚山梨酯-80为4.6ml，加入93.1ml生理盐水，轻微振荡混匀，再加入2.3mlβ-榄香烯，用高速剪切机以10000r/min速度搅拌1min，即得乳状混悬液，粒径约为13μm，4小时内不破乳和合并，稳定性较好，并供用于大鼠口服给药。
ph响应型搭载β-榄香烯的介孔二氧化硅纳米粒制备方法：按照本发明实施例1-5制备得到氨基化修饰的介孔二氧化硅纳米粒。把β-榄香烯与表面氨基化修饰的介孔二氧化硅纳米粒按重量比为1:30；常温下摇床中孵育12h，用甲醇洗涤、离心，在30℃真空干燥过夜得的通过氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒。把氨基化修饰后载药的介孔二氧化硅与0.2％的聚丙烯酸按重量比20:1的比例混合，室温下于摇床中孵育2h，用甲醇洗涤、离心，30℃下真空干燥12h，通过聚丙烯酸与氨基修饰后载药的介孔二氧化硅的化学偶联方法，获得ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。所得制剂呈现了良好的ph响应型，在ph3.5条件下，24h内可溶出和释放80.0％的β-榄香烯，稳定性较好，并供用于大鼠口服给药。
将24只大鼠(300±20g)随机分为2组，每组12只，空腹分别给自制的β-榄香烯普通乳剂和ph响应型搭载β-榄香烯的介孔二氧化硅纳米粒，其给药量均为100mg/kg(以β-榄香烯计)，给药前禁食12h，给药后于预定时间间隔尾静脉取血0.5ml，用枸缘酸钠抗凝，5000r/min离心5分离血浆，-20℃保存待测。精密吸取血浆0.3ml置于具塞刻度离心管中，加入10μg/ml内标液(山奈酚)0.2ml，涡旋，再加入2ml无水乙醚，涡旋3min，于5000r/min离心，取有机相1.5ml，于30℃水浴下氮气吹干，残渣以50μl流动相溶解，hplc进样20μl进行β-榄香烯含量测定。
将测得的血药浓度-时间数据，用药物动力学软件das2.0计算药时曲线下面积(auc)等药动学参数，计算相对生物利用度f，计算方式为f＝auc(ph响应型搭载β-榄香烯的介孔二氧化硅纳米粒)/auc(β-榄香烯普通乳剂)×100％，药时曲线见图6。结果表明，本发明ph响应型搭载β-榄香烯的介孔二氧化硅纳米粒口服生物利用度为普通乳剂的1.81倍，即相对生物利用度提高了81％。
1.一种ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
1)对介孔二氧化硅进行表面氨基化修饰，得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒；
2)将β-榄香烯与所述氨基化介孔二氧化硅纳米粒混合，进行孵育，得到氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒；
3)所述氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒与聚丙烯酸水溶液混合，进行孵育，即得到ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：制备所述介孔二氧化硅的方法包括如下步骤：
将十六烷基三甲基氯化铵、水、氢氧化钠混合，调节混合体系ph值为9～12，然后滴加入正硅酸四乙酯反应，反应后分离出沉淀，将其煅烧，得到所述介孔二氧化硅。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述十六烷基三甲基氯化铵、所述水与所述氢氧化钠的质量比为0.1:300～500:0.02～0.08；
所述正硅酸四乙酯与所述十六烷基三甲基氯化铵的质量比为0.25～1:0.1；
在温度为70～80℃时滴加所述正硅酸四乙酯；
制备所述介孔二氧化硅的方法中，所述反应温度为70～80℃，时间为2～4小时；
所述煅烧的温度为500～550℃，时间为5～6h。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述介孔二氧化硅进行表面氨基化修饰过程如下：所述介孔二氧化硅分散于水中，然后与醋酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述介孔二氧化硅的质量与所述醋酸、所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为2mg:2μl:1～2μl；
所述介孔二氧化硅分散于水中的浓度为4～6mg/ml；
步骤1)中进行表面氨基化修饰的条件如下：室温，时间为12～24h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述β-榄香烯与所述氨基化介孔二氧化硅纳米粒的质量比为1～2:30；
步骤2)中所述孵育的条件：室温，时间为12～24h。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述聚丙烯酸水溶液的质量浓度为0.2％～0.5％；
所述氨基修饰后载药的介孔二氧化硅纳米粒与所述聚丙烯酸水溶液的质量比为20:1～2；
步骤3)中所述孵育的条件：室温，时间为2～4h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的所述ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
9.一种ph响应型β-榄香烯缓释药物，其活性成分为权利要求8所述ph响应型搭载β-榄香烯介孔二氧化硅纳米粒。
10.根据权利要求9中所述ph响应型β-榄香烯缓释药物，其特征在于：所述药物的剂型为口服药物。
技术总结