本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物及其制备方法。
背景技术：
目前，多功能的复合纳米材料广泛应用于肿瘤的诊断和治疗，和传统的化疗相比，复合纳米材料能够有效积累到肿瘤组织，在肿瘤部位内、外环境刺激下释放装载的药物增加肿瘤治疗效果，同时能够减少化疗带来的副作用。碳酸钙作为一种可降解、无毒的生物材料具有广泛的生物学应用，无定型的碳酸钙具有载药量高、形貌可控等特性，是很好的药物递送工具。
铁死亡是2012年由stockwell提出的铁依赖的程序性细胞死亡形式，迅速成为全球的研究热点。通过增加细胞内亚铁离子的积累和gpx4的失活，能够促进细胞内产生大量脂质过氧化物，促进铁依赖性细胞死亡。传统的肿瘤治疗手段(如化疗、放疗)通常立足于诱导肿瘤细胞凋亡，但是癌细胞易发生基因突变，导致细胞凋亡途径受阻。铁死亡可以绕过肿瘤细胞凋亡阻力，更好地杀灭肿瘤细胞，尤其是耐药性肿瘤细胞。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物的制备方法；目的之二在于提供一种具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子
将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺加入n,n-二甲基甲酰胺中，活化0.5-2h后再加入炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子，室温下搅拌反应24h后透析，制得接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子；
(2)制备聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子
首先将叠氮化聚乙二醇单甲醚、炔基化基质金属蛋白酶-2响应肽、五水硫酸铜和抗坏血酸加入n,n-二甲基甲酰胺中，室温下保护气氛中搅拌反应24h后透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽；然后将所述聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽溶于无水二氯甲烷中，加入二碳酸二叔丁酯、三乙胺后室温下搅拌反应12-24h后透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽；最后将所述聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺加入n,n-二甲基甲酰胺中，活化0.5-2h后再加入炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子，室温下搅拌反应24h后旋干，将产物溶于三氟乙酸溶液中，室温下搅拌反应12-24h后透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子；
(3)制备载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将氯化钙、阿霉素盐酸溶液、无水氯化亚铁加入无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2-3d后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(4)制备表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将步骤(3)中制备的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水乙醇中，然后加入乙二胺四乙酸、氨水，以400-800rpm的速度搅拌15min后加入正硅酸乙酯，继续以400-800rpm的速度搅拌15min后再加入水，搅拌反应12-24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(5)制备具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物
将步骤(4)中制备的表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水甲苯中，然后加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，60℃回流反应12-24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；将所述氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水乙醇中，再加入叠氮聚乙二醇对甲苯磺酰，45℃下搅拌反应12h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；将所述叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、步骤(2)中制备的聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子，步骤(1)中制备的接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子、五水硫酸铜和抗坏血酸加入n,n-二甲基甲酰胺中，室温下保护气氛中搅拌反应24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物。
优选的，步骤(1)中，所述叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、n,n-二甲基甲酰胺和炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子的质量体积比为60:80:47:25:100，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:ml:mg。
优选的，步骤(1)中，所述透析时透析袋的截留分子量为1000da。
优选的，步骤(2)中，所述炔基化基质金属蛋白酶-2响应肽的氨基酸序列如seoidno：1所示。
优选的，步骤(2)中，所述叠氮化聚乙二醇单甲醚为中聚乙二醇的分子量为4000。
优选的，步骤(2)中，所述叠氮化聚乙二醇单甲醚、炔基化基质金属蛋白酶-2响应肽、五水硫酸铜、抗坏血酸和n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为250:47:15:30:50，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mg:ml。
优选的，步骤(2)中，所述聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽、无水二氯甲烷、二碳酸二叔丁酯和三乙胺的质量体积比为100:35:18:8.1，所述质量体积比的单位为mg:ml:mg:mg。
优选的，步骤(2)中，所述聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、n,n-二甲基甲酰胺和炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子的质量体积比为100:12:7:25:15，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:ml:mg。
优选的，步骤(2)中，所述透析得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽时透析袋的截留分子量为1000da；所述透析得聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽时透析袋的截留分子量为1000da；所述透析得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子时透析袋的截留分子量为2000da。
优选的，步骤(2)中，所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸的体积分数为5-30％。
优选的，步骤(3)中，所述氯化钙、阿霉素盐酸溶液、无水氯化亚铁和无水乙醇的质量体积比为150:0.4:0.63:100，所述质量体积比的单位为mg:ml:mg:ml，所述阿霉素盐酸溶液中阿霉素的浓度为10mg/ml；步骤(4)中，所述载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水乙醇、乙二胺四乙酸、氨水、正硅酸乙酯和水的质量体积比为2:20:25:400:30:400，所述质量体积比的单位为mg:ml:μl:μl:μl:μl，所述氨水的体积分数为25％。
优选的，步骤(5)中，所述表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水甲苯和3-氨丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为20:5:10，所述质量体积比的单位为mg:ml:μl。
优选的，步骤(5)中，所述氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水乙醇和叠氮聚乙二醇对甲苯磺酰的质量体积比为20:10:5，所述质量体积比的单位为mg:ml:mg。
优选的，步骤(5)中，所述叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子、接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子、五水硫酸铜、抗坏血酸和n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为20:20:2.1:2:4:5，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mg:mg:ml。
优选的，步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中，所述离心的速度均为8000-10000rpm。
优选的，步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中，所述洗涤具体为以无水乙醇为洗涤液在8000-10000rpm的速度下离心洗涤2-3遍。
2、由所述的方法制备的具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物及其制备方法，该复合纳米药物能够在肿瘤酸性溶酶体中降解，从而快速释放亚铁离子和dox，其中，亚铁离子能够促进细胞膜的多不饱和脂肪酸转化为脂质过氧化物，诱导肿瘤细胞的铁死亡，而dox在诱导细胞凋亡的同时能够促进氧化应激增加细胞内双氧水的含量，从而进一步增强亚铁离子引发的脂质过氧化导致铁依赖性的铁死亡。具体为，当该复合纳米药物进入肿瘤微环境时，复合纳米颗粒中的基质金属蛋白酶-2响应肽在该环境中基质金属蛋白酶-2的作用下断裂，是该复合纳米颗粒中的叶酸暴露出来，再通过叶酸靶向肿瘤细胞，利用胞吞作用使复合纳米颗粒进入肿瘤细胞内部，这个过程中，复合纳米颗粒先形成内含体，然后逐步转化为溶酶体，当复合纳米颗粒进入肿瘤细胞后，借助溶酶体的酸性环境促进纳米颗粒的降解，同时通过树状大分子质子化作用将溶酶体透化释放阿霉素和亚铁离子。另外，本发明中复合纳米药物因接枝聚乙二醇单甲醚，可以有效规避体内巨噬细胞的吞噬，减少体内的排斥作用，增强了肿瘤的epr效应，使更多的复合纳米颗粒可以聚集在肿瘤细胞周围。该复合纳米颗粒不但能够增加肿瘤治疗效果，还能够减少化疗带来的副作用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为实施例1中制备的acc-dox.fe2 、acc@dox.fe2 -casi和acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000三种材料的tem图；(图1中a为acc-dox.fe2 的tem图，其中图1中b为acc@dox.fe2 -casi的tem图，其中图1中c为acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000的tem图)
图2为acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000体外药物释放性能测试结果图；
图3为acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000的细胞毒性测试结果图；
图4为溶酶体逃逸效应测试结果图。(图4中a为空白培养基测试结果图，图4中b为孵育acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000后的测试结果图，图4中c为孵育acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000 mmp-2后的测试结果图)
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
制备具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物
(1)制备接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子(pamam-fa)
将60mg叶酸、80mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和47mgn-羟基琥珀酰亚胺加入25mln,n-二甲基甲酰胺中，活化0.5h后再加入100mg炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子，室温下搅拌反应24h后以分子量为1000da的透析袋透析，制得接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子；
(2)制备聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子(pamam-gplgvrgdgg-mpeg4000)
首先将250mg叠氮化聚乙二醇4000单甲醚、47mg炔基化基质金属蛋白酶-2响应肽(氨基酸序列为：gly-pro-leu-gly-val-arg-gly-asp-gly-gly)、15mg五水硫酸铜和30mg抗坏血酸加入50mln,n-二甲基甲酰胺中，室温下氮气中搅拌反应24h后以分子量为1000da的透析袋透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽(mpeg4000-gplgvrgdgg)；然后将100mg聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽溶于35ml无水二氯甲烷中，加入18mg二碳酸二叔丁酯、8.1mg三乙胺后室温下搅拌反应12h后以分子量为1000da的透析袋透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽(mpeg4000-(boc)2gplgvrgdgg)；最后将100mg聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽、12mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和7mgn-羟基琥珀酰亚胺加入25mln,n-二甲基甲酰胺中，活化0.5h后再加入15mg炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子，室温下搅拌反应24h后旋干，将产物溶于体积分数为5％的三氟乙酸溶液中，室温下搅拌反应24h后以分子量为2000da的透析袋透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子；
(3)制备载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒(acc-dox.fe2 )
将150mg氯化钙、0.4ml阿霉素盐酸溶液(阿霉素盐酸溶液中阿霉素的浓度为10mg/ml)、0.63mg无水氯化亚铁加入100ml无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2.5d后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(4)制备表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒(acc@dox.fe2 -casi)
将步骤(3)中制备的2mg载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于20ml无水乙醇中，然后加入25μl乙二胺四乙酸、400μl体积分数为25％的氨水，以400rpm的速度搅拌15min后加入30μl正硅酸乙酯，继续以400rpm的速度搅拌15min后再加入400μl水，搅拌反应24h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(5)制备具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物(acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000)
将步骤(4)中制备的20mg表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于5ml无水甲苯中，然后加入10μl3-氨丙基三甲氧基硅烷，60℃回流反应24h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒(acc@dox.fe2 -casi-nh2)；将20mg氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于10ml无水乙醇中，再加入5mg叠氮聚乙二醇对甲苯磺酰，45℃下搅拌反应12h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒(acc@dox.fe2 -casi-n3)；将20mg叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、20mg步骤(2)中制备的聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子，2.1mg步骤(1)中制备的接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子、2mg五水硫酸铜和4mg抗坏血酸加入5mln,n-二甲基甲酰胺中，室温下氮气中搅拌反应24h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物。
图1为实施例1中制备的acc-dox.fe2 、acc@dox.fe2 -casi和acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000三种材料的tem图，其中，图1中a为acc-dox.fe2 的tem图，可知acc-dox.fe2 具有较好的分散性，形貌均匀，粒径在80-90nm；图1中b为acc@dox.fe2 -casi的tem图，该材料粒径在90-100nm是因为acc@dox.fe2 表面包裹一层较薄的钙硅复合保护层，从而导致粒径增大，该保护层能够防止无定型碳酸钙的提前降解；图1中c为acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000的tem图，该材料粒径为100-110nm，是因为acc@dox.fe2 -casi表面修饰了有机分子，从而进一步增大了粒径。
实施例2
测试实施例1中制备的acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000体外药物释放性能
将实施例1中制备的acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000分散于不同ph的缓冲液中(ph＝7.4和ph＝5.5)至浓度为0.4mg/ml。在相应时间点取0.2ml，以8000rpm速度离心5min后，利用荧光分光光度计检测上清中dox的浓度，结果如图2所示，由图2可知，在ph＝7.4的生理条件下，药物基本不会释放出来，在肿瘤细胞溶酶体酸性条件下(ph＝5.5)会使纳米颗粒解离加速药物的释放，在24小时累积释放量接近70％。
实施例3
(1)制备acc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000
与实施例1的区别在于，步骤(3)中不加入阿霉素盐酸溶液、无水氯化亚铁两种原料，制得无定型碳酸钙纳米颗粒，然后步骤(4)中将“载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒”替换为“无定型碳酸钙纳米颗粒”，制得acc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000。
(2)制备acc@dox-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000
与实施例1的区别在于，步骤(3)中不加入无水氯化亚铁，制得载阿霉素的无定型碳酸钙复合纳米颗粒，然后步骤(4)中将“载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒”替换为“载阿霉素的无定型碳酸钙复合纳米颗粒”，制得acc@dox-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000。
测试实施例1中制备的acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000的细胞毒性
将4t1细胞接在96孔板中，每个孔细胞数量为1×104，待细胞贴壁后(过夜)分别孵育相应材料(acc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000、dox、acc@dox-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000、acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000、acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000 mmp-2)，每组设6个复孔，在37℃，5％co2培养箱中培养12、24、48h后用含mtt(0.5mg/ml)的新鲜培养基孵育4h后去掉培养基，每个孔加入100μldmso用酶标仪测在吸光度490nm的吸光，测试结果见图3，由图3可知，和对照组(control)相比不同浓度的acc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000的细胞存活率均在90％以上，是因为纯碳酸钙纳米颗粒对细胞的毒性很小。药物中加入亚铁离子后细胞的存活率要比只载了阿霉素的要低，说明加入亚铁离子后能够增强药物对肿瘤细胞的杀伤效果。利用基质金属蛋白酶-2(mmp-2)预处理后的药物acc@dox.fe2 -casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000 mmp-2的细胞存活率显著低于没有加mmp-2处理过的要低。
实施例4
溶酶体逃逸效应测试
(1)制备acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000
与实施例1的区别在于，步骤(3)中以fitc替换阿霉素盐酸溶液和无水氯化亚铁，制得acc@fitc；将步骤(4)中“载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒”替换为“acc@fitc”，制得acc@fitc-casi；将步骤(5)中“表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒”替换为“acc@fitc-casi”，制得acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000。
将4t1细胞接在共聚焦皿中，接1×105细胞加1ml培养基，在37℃，5％co2培养箱培养过夜(细胞生长至占共聚焦皿面积的70％)，分别孵相应材料(acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000、acc@fitccasi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000 mmp-2)12h后，将4t1细胞用无血清培养基冲洗，然后用60nmlyso-trackerred(beyotime)无血清细胞培养基，37℃孵育60min对4t1细胞溶酶体染色标记(红色)，去掉上清用pbs清洗三遍，加入4％多聚甲醛，4℃固定30min，再用pbs清洗3次，之后用10μg/ml的h33258对4t1细胞核染色5min，pbs清洗三次后，用甘油进行封片，最后用共聚焦显微镜进检测分析，测试结果见图4，其中，图4中a为空白培养基测试结果图，图4中b为孵育acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000后的测试结果图，图4中c为孵育acc@fitc-casi-pamam-gplgvrgdgg-pamam-fa/mpeg4000 mmp-2后的测试结果图。图4中c和图4中a、图4中b相比，在金属蛋白酶(mmp-2)作用下断开聚乙二醇单甲醚的保护层，暴露聚酰胺-胺型树枝状高分子，由于聚酰胺-胺型树枝状高分子的质子化效应导致溶酶体的透化，使药物释放到胞浆中。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
1.一种具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子
将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺加入n,n-二甲基甲酰胺中，活化0.5-2h后再加入炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子，室温下搅拌反应24h后透析，制得接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子；
(2)制备聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子
首先将叠氮化聚乙二醇单甲醚、炔基化基质金属蛋白酶-2响应肽、五水硫酸铜和抗坏血酸加入n,n-二甲基甲酰胺中，室温下保护气氛中搅拌反应24h后透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽；然后将所述聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽溶于无水二氯甲烷中，加入二碳酸二叔丁酯、三乙胺后室温下搅拌反应12-24h后透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽；最后将所述聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺加入n,n-二甲基甲酰胺中，活化0.5-2h后再加入炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子，室温下搅拌反应24h后旋干，将产物溶于三氟乙酸溶液中，室温下搅拌反应12-24h后透析，制得聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子；
(3)制备载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将氯化钙、阿霉素盐酸溶液、无水氯化亚铁加入无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2-3d后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(4)制备表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将步骤(3)中制备的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水乙醇中，然后加入乙二胺四乙酸、氨水，以400-800rpm的速度搅拌15min后加入正硅酸乙酯，继续以400-800rpm的速度搅拌15min后再加入水，搅拌反应12-24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(5)制备具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物
将步骤(4)中制备的表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水甲苯中，然后加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，60℃回流反应12-24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；将所述氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水乙醇中，再加入叠氮聚乙二醇对甲苯磺酰，45℃下搅拌反应12h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒；将所述叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、步骤(2)中制备的聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子，步骤(1)中制备的接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子、五水硫酸铜和抗坏血酸加入n,n-二甲基甲酰胺中，室温下保护气氛中搅拌反应24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、n,n-二甲基甲酰胺和炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子的质量体积比为60:80:47:25:100，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:ml:mg。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述叠氮化聚乙二醇单甲醚、炔基化基质金属蛋白酶-2响应肽、五水硫酸铜、抗坏血酸和n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为250:47:15:30:50，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mg:ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽、无水二氯甲烷、二碳酸二叔丁酯和三乙胺的质量体积比为100:35:18:8.1，所述质量体积比的单位为mg:ml:mg:mg。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚乙二醇单甲醚接枝叔丁基脂保护的基质金属蛋白酶-2响应肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、n,n-二甲基甲酰胺和炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子的质量体积比为100:12:7:25:15，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:ml:mg。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氯化钙、阿霉素盐酸溶液、无水氯化亚铁和无水乙醇的质量体积比为150:0.4:0.63:100，所述质量体积比的单位为mg:ml:mg:ml，所述阿霉素盐酸溶液中阿霉素的浓度为10mg/ml；步骤(4)中，所述载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水乙醇、乙二胺四乙酸、氨水、正硅酸乙酯和水的质量体积比为2:20:25:400:30:400，所述质量体积比的单位为mg:ml:μl:μl:μl:μl，所述氨水的体积分数为25％。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述表面修饰有硅层的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水甲苯和3-氨丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为20:5:10，所述质量体积比的单位为mg:ml:μl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述氨基化载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水乙醇和叠氮聚乙二醇对甲苯磺酰的质量体积比为20:10:5，所述质量体积比的单位为mg:ml:mg。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述叠氮化聚乙二醇修饰的载阿霉素、二价铁离子的无定型碳酸钙复合纳米颗粒、聚乙二醇单甲醚接枝基质金属蛋白酶-2响应肽的炔基化二代酰胺-胺型树枝状高分子、接枝叶酸的炔基化二代聚酰胺-胺型树枝状高分子、五水硫酸铜、抗坏血酸和n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为20:20:2.1:2:4:5，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mg:mg:ml。
10.由权利要求1-9任一项所述的方法制备的具有诱导肿瘤细胞铁死亡效应的无定型碳酸钙复合纳米药物。
技术总结