致谢
本发明由美国国立口腔与颅面研究所(thenationalinstituteofdentalandcraniofacialresearch)授予的拨款号2r44de024024下的政府支持而完成。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请基于2018年11月13日提交的美国临时申请序列号62/760,134主张优先权。由此该申请通过引用整体结合到本文中。
背景技术：
随手术使用的辐射治疗是诱导肿瘤退化的强有力手段。然而，很多类型的癌症最终发展出对辐射的抗性，且辐射治疗变成无效[1–6]。另外，健康组织中照射诱导的损伤导致急性和慢性疾病，如皮肤中的辐射烧伤、局部急性肺炎和口腔粘膜炎，这些可使对辐射治疗的耐受性复杂化。为了减小对健康组织的辐射诱导的损伤，通常以多个较小剂量进行照射。然而，这些分次照射策略仍导致损伤暴露的组织和器官。由于这些缺陷，对提高辐射效力和减小副作用的辐射敏化剂的兴趣日益增加。这些年来，各种类型的辐射敏化剂如化疗药、辅助剂和改良制剂已稳定使用[7–9]。目前，化疗药如5-fu和顺铂一般用作辐射敏化剂。虽然这些辐射敏化剂可提高癌症治疗的功效，但这些化疗药大多数也导致多样的不利健康后果。粘膜组织，如口腔和胃肠粘膜，对放化疗(chemoradiation)非常敏感，且患者经常出现严重疼痛的口腔和肠粘膜炎。这些放化疗诱导的疾病的严重程度可能是癌症治疗的限制因素，且缺少适当干预可导致衰弱性慢性病。开发没有严重副作用的辐射敏化剂将会改善癌症治疗的总体成功。
技术实现要素：
本文描述减小或保持受试者中肿瘤大小的方法，其中所述方法包括使肿瘤暴露于电离辐射，和给予受试者经改性透明质酸(hyaluronan)或药学上可接受的盐或酯。使用经改性透明质酸增强或加强癌症治疗中所用电离辐射的效果。另外，在使肿瘤暴露于电离辐射和给予受试者经改性透明质酸后，本文所述方法预防或减小受试者中的肿瘤再生长。
本发明的优势将在以下描述中部分阐述，并且部分将从以下描述显而易见、或者可通过实施以下所述的方面而认识到。通过在附加权利要求书中特别指出的要素及组合，将实现和获得以下所述的优势。应理解，前面的概括描述和以下详细描述二者仅为示例性和说明性，而非限制性。
附图说明
结合到本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明以下所述的数个方面。
图1显示通过检测来自经植入hscc-lu2细胞的发光而测定的肿瘤体积变化。两组动物在第0日用x-射线(30gy)照射一次。gm-1111(30mg/kg)和媒介物二者从第1日至第20日每日一次皮下给予。符号和误差条表示平均±sem。与媒介物(pbs)相比，**p<0.01和***p<0.001。
图2显示用hscc-lu2细胞植入的舌组织的显微镜图像(苏木精和伊红染色，原始放大倍率2x)。有显出肿瘤的区域用虚线图示。在研究结束时(第21日)取舌组织的前半部用于组织学检查。与来自未照射对照动物的组织比较，来自x-射线照射动物的组织证明肿瘤退化。
图3显示通过检测来自经植入hscc-lu2细胞的发光而测定的肿瘤体积变化。gm-1111(30mg/kg)和媒介物二者均从第0日至第16日每日一次皮下给予。符号和误差条表示平均±sem。在两组之间无统计学显著性(p>0.05)。
具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物和/或方法之前，应理解，下述方面不限于具体的化合物、合成方法或用途，因为其当然可以变化。还应理解，本文所用术语只为了描述具体方面，并不为限制性。
在本说明书和接着的权利要求书中将提及许多术语，这些术语应限定为具有以下含义：
必须注意到，如本说明书和附加权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数的讨论对象，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，对“一种药物载体”的提及包括两种或更多种此类载体的混合物等。
“任选”或“任选地”意味着随后描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括事件或情况发生的事例和不发生的事例。例如，短语“任选取代的低级烷基”意味着低级烷基可经取代或可不经取代，并且该描述包括未取代的低级烷基和其中有取代的低级烷基二者。
在整个本说明书中，除非上下文另外规定，应理解，词语“包括”或其变体(如包含或含有)暗示包括一个所述元素、整体(integer)或步骤或元素、整体或步骤的组，但不排除任何其它元素、整体或步骤或元素、整体或步骤的组。
范围可在本文中表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。在表达这样的范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，在将值表达为近似值时，通过使用先行的“约”，应理解该特定值形成另一个方面。还应理解，各范围的端点有意义地既与另一个端点相关，又独立于另一个端点。
在本说明书和结论性权利要求书中对组合物或制品中特定元素或组分的重量份的提及，表示该元素或组分与组合物或制品(关于其表达重量份)中的任何其它元素或组分之间的重量关系。因此，在包含2重量份组分x和5重量份组分y的复合物中，x和y以2:5的重量比存在，且无论是否在该复合物中包含另外的组分，都以此比存在。
如本文所用，为了方便，在共同清单中可存在多个项目、结构要素、组成要素和/或物质。然而，这些清单应解释为如同清单的每个成员都单独地看成分开和独特的成员一样。因此，在没有相反指明的情况下，任何此类清单的单独成员均不应只基于在共同组中的表达而解释为相同清单的任何其它成员的实际等价物。
浓度、量和其它数字数据在本文中可以范围形式表示或显示。应理解，这样的范围形式只是为了方便和简洁而使用，因此，应灵活地解释为不仅包括作为范围界限明确叙述的数值，而且包括在那个范围内包含的所有单独数值或子范围，如同明确叙述各数值和子范围一样。例如，数字范围约“1”至“约5”应解释为不仅包括明确叙述的值约1至约5，而且包括在指示的范围内的单独值和子范围。因此，在此数字范围内包括有：单独数值，如2、3和4；子范围，如1-3、2-4、3-5、约1–约3、1至约3、约1至3等；以及单独的1、2、3、4和5。同样的原则适用于只叙述一个数值作为最小值或最大值的范围。另外，不管被描述的特征的宽度或范围如何，这种解释都适用。
公开了可用于所公开的组合物和方法、可与所公开的组合物和方法结合使用、可用于制备所公开的组合物和方法、或者为所公开的组合物和方法的产品的物质和组分。本文公开这些和其它物质，且应理解，在公开这些物质的组合、亚类、相互作用、组等时，虽然可能未明确公开这些化合物的每个不同的单独和集体组合及排列的具体提及，但每个都在本文中明确预期和描述。例如，如果公开分子类a、b和c以及分子类d、e和f，且公开组合a d的实例，则即使未单独叙述每个，也单独和集体地预期每个。因此，在此实例中，从a、b和c，d、e和f的公开以及实例组合a d，具体预期且应认为公开了组合a e、a f、b d、b e、b f、c d、c e和c f的每个。同样，也具体预期和公开了这些的任何亚类或组合。因此，例如，从a、b和c，d、e和f的公开以及实例组合a d，具体预期且应认为公开了亚类a e、b f和c e。这一观念适用于本公开的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可用所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合进行的多种附加步骤，则具体预期且应认为公开了每个此类组合。
在本说明书和结论性权利要求中使用的化学物类的残基是指如下的部分，其为在具体反应方案或后续制剂或化学产品中该化学物类的所得产物，无论此部分是否实际从该化学物类获得。例如，包含至少一个-oh基的透明质酸可由式y-oh表示，其中y为透明质酸分子的剩余部分(即，残基)。
本文所用术语“治疗”定义为，与未使用本文所述方法时的相同状况比较，用本文所述方法保持或减轻先存在的状况的症状(例如，肿瘤体积)。本文所用术语“预防”定义为，与未使用本文所述方法时的相同症状比较，用本文所述方法消除或减小一种或多种症状(例如，肿瘤生长、肿瘤再生长等)发生的可能性。本文所用术语“抑制”为，与未使用本文所述方法时的相同活动比较，本文所述方法完全消除活动或减小活动(例如，肿瘤生长、肿瘤再生长等)的能力。
“受试者”指：哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类、羊、狗、啮齿类(例如，小鼠、大鼠等)、豚鼠、猫、兔、母牛；和非哺乳动物，包括鸡、两栖类和爬行类。
本文描述用电离辐射和本文所述经改性透明质酸减小或保持受试者中肿瘤大小的方法。该方法包括使肿瘤暴露于电离辐射，和给予受试者经改性透明质酸或药学上可接受的盐或酯，其中经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯包含：(a)硫酸化透明质酸或其药学上可接受的盐或酯，或(b)包含至少一个硫酸酯基(sulfategroup，硫酸根)且n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基位置包含烷基或氟烷基的透明质酸。
关于治疗癌症患者的肿瘤，与电离辐射结合使用经改性透明质酸有几个意想不到的特性。如将在本文中显示的，与只暴露于电离辐射的肿瘤大小比较，在使肿瘤暴露于电离辐射和给予受试者经改性透明质酸时，肿瘤大小和体积显著减小。可用在本领域已知的技术测量肿瘤大小(例如，体积)。因此，经改性透明质酸增强电离辐射的化疗效果。这是意想不到的，因为在癌症治疗期间用抗炎或细胞保护药物可保护癌组织免于放化疗的细胞毒性作用。
本文所述方法的另一个优势是，与应用电离辐射和给予经改性透明质酸之前的肿瘤初始体积比较，它们可预防或减小受试者中的肿瘤再生长。很多类型癌症最终发展出对辐射的抗性，且辐射治疗变成无效。本文所述方法可预防或减小肿瘤抵抗电离能量或肿瘤再生长的可能性。
本文有用的电离辐射为任何能够应用于癌症患者的肿瘤的辐射。本文所用术语“电离辐射”是被限定的辐射，其具有足够能量以从原子或分子逐出一个或多个轨道电子(例如，α粒子、β粒子、γ射线、x-射线、中子、质子和具有足够能量以在物质中产生离子对的其它粒子)。吸收的剂量一般以“戈瑞”(gy)度量。
在一个方面，电离辐射为外照射辐射(externalbeamradiation)、短距治疗辐射或其组合。在一个方面，外照射辐射包括从中电压x-射线机、钴-60机、直线加速器、质子束机、电子回旋加速器辐射、中子束机、伽马刀、喷洒辐射(sprayradiation)、立体定向辐射(stereotacticradiation)、或其任何组合递送的辐射。在另一个方面，短距治疗辐射包括组织内辐射、腔内辐射、管腔内辐射(intraluminalradiation)、放射性配体标记分子静脉内给予、或其任何组合。
电离辐射的量和持续时间可根据肿瘤的大小和性质而变化。电离辐射可以单一剂量应用或随时间以多个剂量应用。在一个方面，使肿瘤以5至100gy或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100gy的剂量暴露于x-射线照射，其中任何值可以为范围的上下端点(例如20至40gy)。
相对于应用电离辐射的时间选择，经改性透明质酸的给予可以变化。在一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射之后给予受试者经改性透明质酸。在另一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射之前给予受试者经改性透明质酸。在另一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射之前和之后给予受试者经改性透明质酸。在另一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射的同时给予受试者经改性透明质酸。在另一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射的同时给予受试者经改性透明质酸且在肿瘤暴露于电离辐射后接着给予。
在一个方面，在肿瘤初始暴露于电离辐射后0.5小时至72小时内给予受试者经改性透明质酸。在另一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射后0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、60小时或72小时初始给予受试者经改性透明质酸，其中任何值可以为范围的上下端点(例如12小时至24小时)。
可在肿瘤已暴露于电离辐射后每日1次或每日多次(例如，每日或每隔一日2x、4x、8x)给予经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯。可根据肿瘤的大小和电离辐射的量在一段时间内给予经改性透明质酸。在一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射后每日给予受试者经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯最多达28日。在另一个方面，在肿瘤暴露于电离辐射后每日或每隔一日给予受试者经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、12日、14日、16日、18日、20日、22日、24日、26日或28日，其中任何值可以为范围的上下端点(例如2日至8日)。
在一个方面，经改性透明质酸为硫酸化透明质酸或其药学上可接受的盐或酯。在一个方面，硫酸化透明质酸具有每个二糖单元0.1至4.0的硫酸化度。在另一个方面，硫酸化透明质酸具有每个二糖单元0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0的硫酸化度，其中任何值可以为范围的上下端点(例如3.0至4.0、3.2至3.8等)。
在另一个方面，硫酸化透明质酸的平均分子量小于1,000kda、小于900kda、小于800kda、小于700kda、小于600kda、小于500kda、小于400kda、小于300kda、小于200kda、小于100kda、小于50kda、小于25kda、小于10kda或小于5kda。在另一个方面，硫酸化透明质酸具有0.5kda至小于50kda、2da至20kda、或3kda至10kda的平均分子大小。在另一个方面，硫酸化透明质酸具有0.5kda至10kda、或1kda至10kda的平均分子大小。根据反应条件，可使低分子透明质酸或透明质酸低聚糖中存在的一个或多个不同羟基硫酸化。在一个方面，使低分子透明质酸或透明质酸低聚糖的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子硫酸化。在另一个方面，透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子和糖醛酸残基的至少一个c-2羟基质子或c-3羟基质子或n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个c-4羟基质子由硫酸酯基取代。在另一个方面，低分子透明质酸或透明质酸低聚糖的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子和糖醛酸残基的至少一个c-2羟基质子和c-3羟基质子和n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个c-4羟基质子由硫酸酯基取代。在另一个方面，可使低分子透明质酸或透明质酸低聚糖上存在的0.001%、0.01%、0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或小于100%或其任何范围的羟基质子脱质子，并随后硫酸化。
在另一个方面，硫酸化透明质酸具有：(1)硫酸化透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子的90%由硫酸酯基取代，(2)3.0至4.0的硫酸化度，和(3)1kda至10kda的平均分子量。在另一个方面，硫酸化透明质酸具有：(1)硫酸化透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子的100%由硫酸酯基取代，(2)3.0至4.0的硫酸化度，和(3)1kda至10kda的平均分子量。
用于制备硫酸化透明质酸的透明质酸原料可作为游离酸或其盐存在。在本文中也可使用透明质酸原料的衍生物。所述衍生物包括在硫酸化之前和/或之后透明质酸的任何改性。本文中很多种分子量透明质酸可用于解聚步骤。在一个方面，透明质酸在解聚前具有大于1,000kda的分子量。在另一个方面，透明质酸在解聚前可具有10kda至1,000kda的分子量。也可将很多种透明质酸分子量用于硫酸化步骤。在一个方面，在硫酸化以产生部分或完全硫酸化的透明质酸之前，可使透明质酸原料转化成低分子透明质酸或透明质酸低聚糖。如以下将更详细讨论的，低分子量透明质酸为已用酸或碱降解或通过在本领域已知的技术解聚的透明质酸，这些技术包括但不限于超声、臭氧分解、剪切应力或自由基介导的链断裂。或者，通过以受控方式用酶(例如透明质酸合酶或透明质酸酶)降解透明质酸来产生透明质酸低聚糖。随后，可通过gpc或离子交换分离来分离具有不同分子量的透明质酸低聚糖。从透明质酸制备低分子量透明质酸或透明质酸低聚糖的示例程序提供于wo2011/156445。
在一个方面，硫酸化的低分子透明质酸或透明质酸低聚糖具有1kda至2,000kda的分子量。在另一个方面，硫酸化的低分子透明质酸或透明质酸低聚糖具有5kda至500kda、10kda至200kda、或20kda至100kda、或小于200kda、150kda、100kda、75kda、50kda或20kda的分子量。制备低分子量透明质酸的示例程序提供于wo2011/156445。如上讨论，通过用酸或碱裂解透明质酸，可改变透明质酸的分子量，以产生较低分子量透明质酸。在某些方面，透明质酸原料或其衍生物不得自动物源。在这些方面，透明质酸可得自其它源，如细菌。例如，可用重组枯草芽孢杆菌(b.subtilis)表达系统来制备透明质酸原料。
在低分子透明质酸或透明质酸低聚糖已用碱处理后，使其与硫酸化剂反应，以产生部分或完全硫酸化的透明质酸。在此可使用常用于有机合成的硫酸化剂。硫酸化剂的实例包括但不限于吡啶-三氧化硫络合物、氯磺酸或三乙胺-三氧化硫络合物。在一个方面，可使低分子透明质酸或透明质酸低聚糖转化成三丁胺盐，冻干，重新悬浮于二甲基甲酰胺，随后用硫酸化剂(例如，吡啶-三氧化硫络合物)处理，以使一个或多个羟基质子硫酸化。
在一个方面，在硫酸化剂为吡啶-三氧化硫络合物时，产生硫酸化透明质酸的吡啶鎓加合物，其中吡啶共价连接到硫酸化透明质酸。不希望受理论约束，在使透明质酸与吡啶-三氧化硫络合物在溶剂(例如，dmf)中反应时，从原位存在的痕量水产生少量酸，这导致部分解聚，产生游离的还原性端基。最终可使半酮缩醇的羟基硫酸化，以产生硫酸化中间体，其随后与原位产生的游离吡啶反应，产生吡啶鎓加合物。因此，本文所用硫酸化透明质酸可包括没有共价连接到分子的吡啶的硫酸化透明质酸和具有共价连接到分子的吡啶的硫酸化透明质酸的混合物。在一个方面，0.01%至100%、0.1%至10%、或0.15%至2.5%的硫酸化透明质酸具有共价连接到分子的吡啶。在另一个方面，硫酸化透明质酸的吡啶鎓加合物的分子量小于或等于10kda。在其它方面，该分子量为0.1kda、0.5kda、1kda、2kda、3kda、4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda或10kda，其中任何值可用于分子量范围的上下端点。
在另一个方面，经改性透明质酸为如下的透明质酸或其药学上可接受的盐或酯，其具有：至少一个硫酸酯基，且n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基位置包含烷基或氟烷基。
在一个方面，透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基质子由烷基取代。本文所用术语“烷基”为1至24个碳原子的支链或无支链饱和烃基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。在一个方面，烷基为c1-c10支链或直链烷基。在另一个方面，烷基为甲基。烷基可未取代或经取代。在烷基经取代的情况下，烷基上存在的一个或多个氢原子可用一个或多个基团替代，所述基团包括但不限于炔基、烯基、芳基、卤素(halide，卤根)、硝基、氨基、酯、酮、醛、羟基、羧酸、芳烷基或烷氧基。
在另一个方面，透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基质子由氟烷基取代。本文所用术语“氟烷基”为1至24个碳原子的支链或无支链饱和烃基，其中至少一个氢原子由氟取代。在某些方面，氟烷基包括至少一个三氟甲基。在其它方面，氟烷基具有式-ch2(cf2)ncf3，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。在一个方面，氟烷基为-ch2cf2cf3或-ch2cf2cf2cf3。
在一个方面，甲基化/硫酸化透明质酸具有以下描绘的式：
其中r1为甲基，而其余r基团为单独的或与氢组合的硫酸酯基。在一个方面，n为5至20、5至15、5至10或7至9。
在另一个方面，经改性透明质酸可以为由第一甲基化/硫酸化透明质酸和第二甲基化/硫酸化透明质酸组成的混合物，第二甲基化/硫酸化透明质酸具有共价结合到可用于本文所述方法中的甲基化/硫酸化透明质酸的吡啶。在一个方面，混合物包括：
(a)第一经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯，其中所述第一经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯包含(i)至少一个n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基质子由甲基取代，(ii)1kda至15kda的平均分子量，(iii)每个二糖单元大于0至0.5个甲基的甲基化度，和(iv)每个二糖单元2.5至4.0个硫酸酯基的硫酸化度；和
(b)第二经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯，其中所述第二经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯包含(i)至少一个n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基质子由甲基取代，(ii)1kda至15kda的平均分子量，(iii)每个二糖单元大于0至0.5个甲基的甲基化度，和(iv)每个二糖单元2.5至4.0个硫酸酯基的硫酸化度；其中吡啶共价结合到第二经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯。
在一个方面，第一和第二经改性透明质酸中的甲基化度为每个二糖单元0.030、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300、0.325、0.350、0.375、0.400、0.425、0.45、0.475或0.500个甲基，其中任何值可以为范围的上下端点(例如0.030至0.300、0.100至0.200等)。在一个方面，第一和第二经改性透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的仅伯c-6羟基质子由甲基取代(即，甲基仅在此位置)。在其它方面，第一和第二经改性透明质酸的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子的1%至100%、5%至100%、10%至100%、20%至100%、50%至100%、60%至100%、70%至100%、80%至100%、90%至100%或95%至100%由甲基替代。
在另一个方面，第一和第二经改性透明质酸具有1kda、2kda、3kda、4kda、5kda、6kda、7kda、8kda、9kda、10kda、11kda、12kda、13kda、14kda或15kda的平均分子量，其中任何值可以为范围的上下端点(例如，1kda至10kda、3kda至7kda等)。
在另一个方面，第一和第二经改性透明质酸具有每个二糖单元2.5、2.75、3.00、3.25、3.50、3.75或4.00个硫酸酯基的硫酸化度，其中任何值可以为范围的上下端点(例如1.5至3.5,3.0至4.0等)。
在另一个方面，第一和第二经改性透明质酸的混合物中吡啶的量为混合物的0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00、3.25、3.50、3.75或4.00%重量，其中任何值可以为范围的上下端点(例如0.500至3.00、1.00至2.00等)。吡啶的量可通过1hnmr和uv光谱法定量。
在另一个方面，第一和第二经改性透明质酸中的甲基化度为每个二糖单元0.03至0.3个甲基，第一和第二经改性透明质酸具有1kda至10kda的平均分子量，第一和第二经改性透明质酸中的硫酸化度为每个二糖单元3.0至4.0个硫酸酯基，且组合物中存在的吡啶的量为组合物的0.1%重量至4.0%重量。
透明质酸原料可作为游离酸或其盐存在。在本文中也可使用透明质酸原料的衍生物。衍生物包括在烷基化或氟烷基化步骤之前透明质酸的任何改性。在本文中可使用很多种分子量透明质酸。在一个方面，透明质酸在烷基化或氟烷基化之前具有大于10kda的分子量。在另一个方面，透明质酸在烷基化或氟烷基化之前具有25kda至1,000kda、100kda至1,000kda、25kda至500kda、25kda至250kda或25kda至100kda的分子量。在某些方面，透明质酸原料或其衍生物不得自动物源。在这些方面，透明质酸可得自其它源，如细菌。例如，可用重组枯草芽孢杆菌表达系统来制备透明质酸原料。
最初使透明质酸原料或其衍生物与足量碱反应，以使n-乙酰基-葡糖胺残基的至少一个伯c-6羟基质子脱质子。碱的选择可以变化。例如，在本文中可使用碱金属氢氧化物，如氢氧化钠或氢氧化钾。碱的浓度或量可根据烷基化或氟烷基化的所需程度而变化。在一个方面，碱的量足以使透明质酸原料或其衍生物的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子的至少0.001%脱质子。在其它方面，碱的量足以使透明质酸原料或其衍生物的n-乙酰基-葡糖胺残基的伯c-6羟基质子的0.001%至50%、1%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至30%、5%至20%、10%至50%、20%至50%或30%至50%脱质子。应理解，溶液越是碱性，链断裂反应越是可能，且可达到的烷基化/氟烷基化度越高。例如，可使透明质酸上存在的其它羟基(例如，2-oh和/或3-oh)烷基化或氟烷基化。在一个方面，可使透明质酸上存在的所有羟基烷基化或氟烷基化。在其它方面，可使透明质酸上存在的羟基质子的0.001%、0.01%、0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%或其任何范围脱质子，并随后烷基化或氟烷基化。
在透明质酸原料或其衍生物已用碱处理后，使脱质子的透明质酸与烷基化剂或氟烷基化剂反应，以产生经改性透明质酸。烷基化剂的实例包括但不限于烷基卤。烷基溴和烷基碘特别有用。类似地，氟烷基化剂可包括氟烷基卤。在此可使用常用于有机合成的烷基化剂和氟烷基化剂。
在某些方面，合乎需要地使上述烷基化或氟烷基化透明质酸硫酸化。在一个方面，通过将烷基化或氟烷基化sage与硫酸化剂反应而使烷基化或氟烷基化透明质酸硫酸化，以产生硫酸化产物。硫酸化度可从部分硫酸化到完全硫酸化变化。一般可使烷基化或氟烷基化透明质酸或其衍生物上存在的游离羟基硫酸化。在一个方面，至少一个c-2羟基质子和/或c-3羟基质子由硫酸酯基取代。在另一个方面，硫酸化度为烷基化或氟烷基化透明质酸的每个二糖单元0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或其任何范围。在一个方面，可用碱处理烷基化或氟烷基化sage，以使一个或多个羟基质子脱质子，随后加硫酸化剂。硫酸化剂为任何与羟基或经脱质子羟基反应产生硫酸酯基的化合物。透明质酸的分子量可根据反应条件而变化。在一个方面，sage的分子量为2kda至500kda、2kda至250kda、2kda至100kda、2kda至50kda、2kda至25kda或2kda至10kda。
在一个方面，sage的烷基为甲基，且透明质酸的至少一个c-2羟基质子和/或c-3羟基质子由硫酸酯基取代。在另一个方面，sage的烷基为甲基，透明质酸的至少一个c-2羟基质子和/或c-3羟基质子由硫酸酯基取代，且该化合物在烷基化后具有2kda至200kda的分子量。
本文有用的任何硫酸化和烷基化/氟烷基化透明质酸可以为其药学上可接受的盐或酯。通过用适量药学上可接受的碱处理游离酸，制备药学上可接受的盐。代表性的药学上可接受的碱为氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化亚铁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铝、氢氧化铁、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。在一个方面，该反应在单独的水中或与惰性水混溶性有机溶剂组合的水中在约0℃至约100℃温度下(例如，在室温下)进行。选择结构式i化合物与所用碱的摩尔比，以提供任何具体盐所需的比率。为了制备例如游离酸原料的铵盐，可用约1当量药学上可接受的碱处理原料，以得到中性盐。
酯衍生物一般作为化合物酸形式的前体制备，如以下实施例中所示，因此可充当前药。一般这些衍生物将为低级烷基酯，如甲基、乙基等酯。通过包含羧酸的化合物与氨或经取代胺反应，可制备酰胺衍生物-(co)nh2、-(co)nhr和-(co)nr2，其中r为以上限定的烷基。酯也可以为脂肪酸酯。例如，已制备棕榈酸酯，并可用作备选的酯酶活化前药。
本文所述经改性透明质酸可在生物系统或实体能够容许的任何赋形剂中配制以制备药物组合物。这些赋形剂的实例包括但不限于水、水性透明质酸、盐水、林格(ringer’s)溶液、葡萄糖溶液、hank’s溶液和其它水性生理学平衡盐溶液。也可使用非水媒介物，如固定油、植物油(如橄榄油和芝麻油)、甘油三酯、丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯(如油酸乙酯)。其它可用制剂包括包含粘度增强剂(如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖)的悬浮液。赋形剂也可包含较小量的添加剂，如提高等渗压性和化学稳定性的物质。缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂和tris缓冲剂，而保存剂的实例包括硫柳汞(thimerosol)、甲酚、福尔马林和苄醇。在某些方面，可根据给予的方式来调节ph。例如，组合物的ph为约5至约6，这适合局部应用。另外，除本文所述化合物外，药物组合物可包含载体、增稠剂、稀释剂、保存剂、表面活性剂等。
药物组合物也可包含与本文所述经改性透明质酸组合使用的一种或多种活性成分。所得药物组合物可提供用于向邻近或远离应用部位的组织持续、连续递送药物和其它生物活性剂的系统。所述生物活性剂能够在其应用到的生物系统中提供局部或全身生物、生理或治疗效果。例如，除其它功能外，该剂可起作用控制和/或预防感染或炎症，增进细胞生长和组织再生，控制肿瘤生长，充当止痛剂，促进抗细胞粘附，减少牙槽骨和牙齿损耗，抑制软骨和承重关节退化，并增进骨生长。另外，任何本文所述化合物可包含两种或更多种药学上可接受化合物的组合。这些化合物的实例包括但不限于抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。以下详细描述将这些组合物用作药物递送装置的方法。
可用在本领域已知的技术制备药物组合物。在一个方面，通过经改性透明质酸与药学上可接受的化合物和/或载体混合，来制备组合物。术语“混合”限定为将两种组分混合在一起，因而没有化学反应或物理相互作用。术语“混合”也包括所述化合物和药学上可接受的化合物之间的化学反应或物理相互作用。可对所述化合物采取共价结合到反应性治疗药物(例如，具有亲核基的那些药物)。其次，药理学活性剂在交联多糖中的非共价包埋也是可能的。第三，静电或疏水相互作用可促进在本文所述化合物中保持药学上可接受的化合物。
可根据是否期望局部或全身治疗和根据要治疗的区域，以多种方式给予经改性透明质酸。可局部给予(包括眼、阴道、直肠、鼻内、口、颊、耳，或直接给予到皮肤或粘膜膜)。用于局部给予的制剂可包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末。常规药物载体、水性、粉末或油状基质、增稠剂等可能必要或合乎需要。通过吸入气雾剂或微粉化干粉，也可直接给予到肺中。
经改性透明质酸也可肠胃外注射(静脉内、皮下、肌肉内、皮内、鼻内、鞘内、真皮下的任一)，或通过吸入。在其它方面，经改性透明质酸通过灌肠剂、栓剂、导管、无针注射器或球形注射器直肠给予。在另一个方面，经改性透明质酸配制为气雾剂、微粉化粉末、喷剂、洗涤剂、灌洗剂，或通常用于鼻应用或通过吸入给予的其它适合制剂。在另一个方面，经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯用在本领域已知的技术肿瘤内给予。
应理解，在规定情况下经改性透明质酸的实际优选量会根据利用的特定化合物、配制的具体组合物、应用方式和被治疗的具体部位和受试者而变化。可用常规考虑事项确定用于给定宿主的剂量，例如，通过主题化合物和已知剂的差别活性的惯例比较，例如，通过适合的常规药理学规程。在确定药物化合物剂量的领域中熟练的医师和配方设计师根据标准建议(physiciansdeskreference(医师案头参考),barnhartpublishing(1999))确定剂量应没有问题。例如，在静脉内给予时，经改性透明质酸的剂量可以为25mg/kg至500mg/kg。在另一个方面，在经口给予时，经改性透明质酸的剂量可以为500mg/kg至3,000mg/kg。在另一个方面，在局部给予时，经改性透明质酸的剂量可以为1%w/v至20%w/v。在另一个方面，经改性透明质酸或其药学上可接受的盐或酯可以每单次剂量1mg/kg至500mg/kg、每单次剂量3mg/kg至300mg/kg或每单次剂量10mg/kg至100mg/kg的量给予受试者。
实施例
提出以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何制备和评价本文所述和要求保护的化合物、组合物和方法的完全公开和说明，并且旨在为完全示例性，并非旨在限制发明人认为是其发明的范围。虽然已努力保证与数字(例如量、温度等)有关的精确度，但应顾及一些误差和偏差。除非另外指明，份为重量份，温度以℃计或处于环境温度，压力处于或接近大气压。存在反应条件(例如，组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力、和可用于优化从所述过程得到的产物纯度和产率的其它反应范围和条件)的许多变化和组合。
材料和方法
动物和动物饲养
从taconicbiosciences(rensselaer,美国纽约)购买6至8周大雄性免疫缺陷ncr-裸(ncr-foxn1nu/nu)小鼠，并在环境受控设施用12小时光/暗循环饲养。将小鼠放入具有无菌bed-o’-cobs®衬垫的滤笼(filteredcage)中。可随意取得无菌食品(labdiet®5053)和水。在最少3日适应期后，检查所有动物的健康和用于研究的适合性。
药物
用以下程序合成甲基化/硫酸化透明质酸(以下称为gm-1111)。
制备低分子量透明质酸
1.在边加热(~40℃)边剧烈搅拌的同时，使20g850kdaha(1%w/v)缓慢溶解到1.7l双蒸水(ddh2o)中。在所有20gha加入时，从加热移开并搅拌直至冷却到室温，然后在搅拌的同时缓慢加入333ml6nhcl。在室温搅拌约2星期。
2.在14日时用hplc、gpc或sec监测降解反应。在分析前中和各样品，以中止反应，并通过在232nm的uv检测分析，与甲基化/硫酸化透明质酸的先前批次比较。
3.在3-5kda的分子量范围时，通过在冰上缓慢添加40%(w/v)naoh中和反应到ph7.0。
4.在1000mwco(截留分子量)渗析管中相对于ddh2o渗析24小时，每6小时更换水，以得到大于1kda的透明质酸片段。
5.冻干得到白色蓬松固体。产率：12.032g,60.2%。
制备甲基化透明质酸
1.使6.0g(4%w/vha的naoh溶液)低分子量透明质酸溶于150ml40%w/vnaoh的ddh2o溶液，并在室温搅拌该混合物2小时，这产生粘性溶液。
2.添加225ml异丙醇，并继续搅拌。
3.添加6ml(6eq)碘甲烷，并在室温搅拌该混合物24小时。
4.在24小时后，用分离漏斗从粘性水层去除有机溶剂层，并添加300mlddh2o，以稀释粗甲基化透明质酸。
5.在冰上用6nhcl将溶液调节到ph7.0。
6.让经中和溶液温热至室温，并在搅拌的同时添加3lmeoh:etoh(1:2v/v)，以沉淀甲基化透明质酸中间体。通过过滤收集产物，并在真空烘箱中干燥它。
甲基化透明质酸的硫酸化以产生gm-1111
1.将2.5g粗甲基化透明质酸加到200ml无水dmf，并搅拌1小时，之后添加1.56ml三丁胺(1eq)。在室温搅拌溶液20分钟。
2.通过一次加5g，添加25g吡啶-三氧化硫(24eq.)。
3.在40℃搅拌混合物3h。
4.在冰上冷却反应，并添加50mlddh2o，以猝灭反应。
5.通过添加250ml用无水乙酸钠饱和的冷95%乙醇，沉淀粗物质。
6.在4,500rpm离心粗产物5-10分钟，并滗去液体，以收集浅褐色胶粘固体。
7.使粗产物溶于ddh2o，并相对于20l100mmnacl渗析，在24h内一日4次更换溶液，随后在24h内相对于20l蒸馏水渗析4次。
8.冻干经渗析物质。最后产率：42.0%的甲基化/硫酸化透明质酸(gm-1111)。
甲基化/硫酸化透明质酸具有以下特征：平均分子量为3kda至7kda；每个二糖单元的平均甲基为0.3至0.3个；平均硫酸化度为3.0至4.0；且平均吡啶含量为0.1至4.0%重量(以下实验中所用的吡啶含量为0.69%重量)。
肿瘤细胞培养和植入
根据美国模式培养物集存库(atcc)建议，在融汇(confluency)下培养scc-25-luc2细胞(表达luc2荧光素酶报道基因的人舌鳞状上皮细胞癌)：dmem和ham’sf12培养基的1:1混合物，包含1.2g/l碳酸氢钠、2.5mml-谷氨酰胺、15mmhepes和0.5mm丙酮酸钠，并补充有400ng/ml氢化可的松和10%胎牛血清(dmem:f12 10
