本发明属于疫苗质量检测技术领域，具体为一种基因工程亚单位油乳剂灭活疫苗的破乳方法。
背景技术：
传染性法氏囊病发病率高且病程短，传播迅速，病鸡严重腹泻、极度虚弱并有不同程度死亡，雏鸡感染后还可导致免疫抑制，并可诱发多种疫病或导致疫苗免疫失败。各品种的鸡均能感染，潜伏期2～3天。主要发生于2～15周龄的鸡，以3～6周龄为发病高峰期，近年来，该病发病日龄有增宽的趋势，从10日龄至产蛋的鸡群均有发生本病的报道。典型发病鸡群病初可见个别鸡突然发病，精神沉郁，食欲减退，羽毛蓬松，翅下垂，闭目，1～2天内可波及全群。病鸡腹泻，排出白色稀粪，随着病情的发展，病鸡出现畏寒、扎堆，严重者垂头、卧地不起，极度虚弱直至死亡。非典型病例主要见于老疫区或有一定免疫力的鸡群，症状不典型，主要引起免疫抑制，病鸡多出现食欲不振、进行性消瘦和腹泻等症状。传染性法氏囊病病毒属rna病毒，病毒颗粒为球形，无囊膜，核衣壳为二十面体立体对称，直径为55～65纳米，其基因组由两个片段的双股rna构成。该病毒有5种衣壳蛋白，即vp1～vp5，其中vp2是病毒的主要保护性抗原。
传染性法氏囊病给家禽业造成巨大的经济损失，目前尚无特效药可以治疗，主要应用疫苗进行预防，所用疫苗主要为灭活疫苗和冻干活疫苗以及新型的基因工程亚单位疫苗。中等毒力活疫苗虽然能够抵抗ibdv超强毒株的攻击,但会对鸡的法氏囊产生一定的损伤。另外,使用活疫苗还存在病毒重组和毒力返强的风险。利用大肠杆菌表达系统进行外源蛋白的表达具有明显的优点，如操作方便简捷，成本低，易于工业批量生产，生长周期短，自身背景蛋白清晰。基因工程亚单位疫苗具有较好的免疫原性，副作用相对较小。因此安全、高效、可靠、廉价的基因工程亚单位疫苗成为应用前景广阔的传染性法氏囊病疫苗。
内毒素存在于革兰氏阴性细菌细胞壁的外层，主要成分为脂多糖。当细菌处在生活状态时，它与菌体结合在一起不被释放，只有当细菌死亡、自溶或人为破坏时(如冻融、加热、超声波作用或药物浸提)，才能释放到环境中。一方面，它可以引起机体发热、白细胞增多，甚至休克死亡；另一方面，具有佐剂作用，可诱导多种细胞因子的表达，使机体非特异性免疫反应增强，从而提高免疫效果。
大肠杆菌工程菌液需经破碎，vp2蛋白才完全释放出来，破碎后内毒素含量很高，大量的内毒素随着疫苗注射进入鸡的体内对鸡是不安全的，会引起注射局部的炎症反应，产生结节，且影响疫苗吸收，所以生产的vp2蛋白半成品需要经过特定的生产工艺去除大部分内毒素后才能用于疫苗生产。国内常用的鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂灭活疫苗的制作过程是将灭活的病毒蛋白与佐剂(常用marcol52佐剂)混合制成油包水剂型疫苗。为客观的反映产品质量，需要对成品进行内毒素检测，即将油乳剂灭活疫苗破乳后取水相进行细菌内毒素含量测定。
目前已有使用三氯甲烷法进行疫苗破乳的文献报道，即将被检油乳剂疫苗与三氯甲烷等量混合，置微型漩涡振荡器震荡后，再以离心收取析出的水相。但是该法由于在破乳过程中向油乳剂疫苗中添加了有机溶剂三氯甲烷，致使破乳后析出的水相中残留有机溶剂三氯甲烷，会导致检测水相中内毒素含量时的制备的供试品阳性对照不成立，不能检测出破乳后水相中内毒素含量的范围值。所以需要寻找一种简便、快速并且不影响水相中内毒素含量检测的破乳方法。
技术实现要素：
本发明是提供一种重组抗原蛋白亚单位疫苗的破乳方法，能够简便、快速、高效将重组蛋白抗原重新分布到水相，同时可保证抗原蛋白的稳定性，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的重组抗原蛋白亚单位疫苗的破乳方法，是将使用油乳剂作为佐剂的亚单位疫苗在冰浴上进行超声破乳；
其中超声破乳，一种具体条件如下：1000-2500焦耳，超声2-5秒，停止2-5秒，共30-45个循环，超声结束后在室温条件下离心获得水相；
作为优选，超声破乳的条件如下：1500焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环。
其中离心条件如下：8000rpm/min离心10min；
所述的重组抗原蛋白亚单位疫苗，作为实施例的一种具体记载，为传染性法氏囊vp2蛋白疫苗；
其中的疫苗，佐剂为油乳剂，其中一种的具体的佐剂为marcol52。
本发明的方法简便、迅速，可在10分钟内完成；抗原分离效果好，同时可保证法氏囊病毒vp2蛋白的稳定性；破乳后分离出的水相中的vp2抗原含量可以采用琼脂扩散试验法进行检测；破乳后水相中抗原回收率高，达40％。适用于对marcol52佐剂乳化的鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗和其他基因工程亚单位疫苗进行破乳，进而对水相进行内毒素含量检测，从而评价成品疫苗的内毒素含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1超声破碎破乳法破乳参数的建立
1.1超声破碎破乳参数的建立取鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗10ml，分别使用以下三个条件进行破乳：1000焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环；1300焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环；1500焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环；超声结束后在室温条件下离心8000rpm/min离心10min，获取水相。
1.2疫苗破乳后水相的理论值鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗乳化时水相和油相的比例为1∶2，因此破乳后的水相理论值应为原油苗体积的33.3％。
1.3三种超声参数破乳后水相实际值及破乳率取鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗各10ml分别按照3个超声破乳参数进行超声破碎破乳，结果破乳率分别为28％、31％、40％，可见1500焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环这个条件破乳效率最高(表1)。
表1：超声破碎法不同参数破乳率比较试验结果
实施例2鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗制备及其破乳方法
2.1鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白的制备通过发酵罐进行重组大肠杆菌的培养及诱导表达，发酵结束后将收集的菌体湿菌加适量的pbs液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，12000r/min离心15分钟，收集上清液。通过中性盐盐析方法进行蛋白纯化。利用tritonx-114和尿囊素去除内毒素，获得vp2蛋白溶液。
2.2vp2蛋白含量检测将破菌后的上清液进行琼脂扩散试验，记录上清液中表达产物vp2的agp效价。为1∶32。
2.3灭活将vp2蛋白液置于灭菌瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒于另一灭菌瓶中，以避免瓶口附近粘附的抗原未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以瓶内温度达到37℃开始计时)后取出，放2～8℃保存。
2.4半成品检验
2.4.1无菌检验取灭活的抗原液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。
2.4.2灭活检验取灭活后的vp2蛋白抗原液，按1％的比例接种于含硫酸卡那霉素浓度为50μg/ml的液体lb培养基中，置37℃摇床震荡培养24小时。吸取200μl培养后的培养基涂布于直径为9cm的lb固体平板上(硫酸卡那霉素50μg/ml)，置于37℃温箱中培养24小时，菌检。应无菌生长。
2.5油乳剂灭活疫苗的制备
2.5.1油相制备取矿物油94份，硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80(span-80)6份，充分混匀后，121℃高压蒸气灭菌备用。
2.5.2水相制备取灭菌后的吐温-804份，加灭活的vp2蛋白液96份混匀备用。
2.5.3乳化取油相2份放入高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min乳化5分钟，即成油乳剂灭活疫苗。
2.5.4分装定量分装，加盖密封。
2.6成品内毒素含量检测吸取10ml油乳剂灭活疫苗放入15ml离心管中，置于冰浴上进行超声破乳，设置超声破碎仪参数：1500焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环，超声结束后在室温条件下离心10分钟，离心条件为8000rpm/分钟，取上清进行检测。
取鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗，按照上述的方法破乳。取破乳后得到的水相，按照2015年版《中国兽药典》(一部)凝胶法检测水相中内毒素的含量。具体步骤如下：
2.6.1供试品溶液的制备：确定最大有效稀释倍数：
有效稀释倍数(mvd)，按mvd＝cl/λ公式计算，
式中l为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当l以eu/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当l以eu/mg或eu/u表示时，c的单位需为mg/ml或u/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度(eu/ml)。
将供试品的细菌内毒素限值分别设定为1000eu/ml、800eu/ml、400eu/ml、200eu/ml，使用灵敏度为1eu/ml的鲎试剂，则：
mvd＝1.0ml/ml×1000eu/ml÷1eu/ml＝1000
mvd＝1.0ml/ml×800eu/ml÷1eu/ml＝800
mvd＝1.0ml/ml×400eu/ml÷1eu/ml＝400
mvd＝1.0ml/ml×200eu/ml÷1eu/ml＝200
将按照上述方法进行破乳后获得的水相分别做1000、800、400、200倍稀释，作为供试品溶液。
2.6.2凝胶限度试验检测：按表2制备溶液a、b、c、d。
表2：凝胶半定量试验溶液的制备表
注：a为供试品溶液；b为供试品阳性对照；c为阳性对照；d为阴性对照。
结果判断方法：保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液d的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液b的平行管均为阳性，阳性对照溶液c的平行管均为阳性，试验有效。
若溶液a的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液a的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定；若溶液a的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液a需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。
若供试品的稀释倍数小于mvd而溶液a出现不符合规定时，需将供试品稀释至mvd重新实验，再对结果进行判断。
结果判断：破乳后析出的水相400倍稀释后经凝胶试验检测为阴性，800倍稀释后经凝胶试验检测为阳性，所以破乳后获得的水相中内毒素含量为400～800eu/ml，即鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗成品中内毒素含量为400～800eu/ml。
实施例3：使用两种破乳方法对油乳剂疫苗破乳后检测水相内毒素含量
3.1三氯甲烷破乳法将被检传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂疫苗与三氯甲烷等量混合，置微型漩涡振荡器震荡6分钟，再以8000rpm离心5分钟，收取析出的水相进行内毒素检测。按照表2分别制备a、b、c、d溶液，采用凝胶限度试验检测法进行检测。
表3：凝胶半定量试验溶液的制备表
结果判断：b供试品阳性对照溶液稀释倍数为10和20时，供试品阳性对照溶液结果为阴性，表明有机溶剂对内毒素检测有影响，试验不成立。
3.2超声破碎破乳法按照实施例1建立的方法对传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂疫苗破乳后，收取析出的水相进行内毒素检测。按照表3分别制备a、b、c、d溶液，采用凝胶限度试验检测法进行检测。
结果判断：b供试品阳性对照溶液稀释倍数为10、20、50、100、200、400、800、1000时，供试品阳性对照溶液结果均为阳性，试验成立。
破乳后析出的水相400倍稀释后经凝胶试验检测为阴性，800倍稀释后经凝胶试验检测为阳性，所以破乳后获得的水相中内毒素含量为400～800eu/ml，即鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗成品中内毒素含量为400～800eu/ml。
由于三氯甲烷破乳法是使用有机溶剂对疫苗进行破乳，析出的水相中含有有机溶剂，使用凝胶半定量试验检测法当水相稀释倍数少时，供试品阳性对照溶液不成立。而超声破碎破乳法不加入任何有机溶剂，不影响破乳后析出的水相的内毒素检测。
1.一种重组抗原蛋白亚单位疫苗的破乳方法，其特征在于，所述的方法是将使用油乳剂作为佐剂的亚单位疫苗在冰浴上进行超声破乳。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超声破乳，其超声条件如下：1000-2500焦耳，超声2-5秒，停止2-5秒，共30-45个循环，超声结束后在室温条件下离心获得水相，完成破乳操作。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的超声破乳的条件如下：1500焦耳，超声4秒，停止4秒，共40个循环。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心条件如下：8000rpm/min离心10min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组抗原蛋白亚单位疫苗为传染性法氏囊vp2蛋白疫苗。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的佐剂为marcol52。
技术总结