本发明属于微生物领域，具体涉及一种针对性絮凝酒糟沼液的生物絮凝剂及制备方法。
背景技术：
随着酿酒行业的产业化进程不断发展，酿酒废液和废渣的处理逐渐成为难题。据统计，每生产1t白酒约产生10t废糟、15t废水。因此，选择合适的酒糟及废水处理手段对酿酒产业的健康发展具有重要意义。目前较流行的处理方式为厌氧发酵法。使用厌氧发酵法处理酒糟废弃物，不仅可以产生大量能量，还可以把酒糟中的大部分cod转化为沼气。但与此同时，如何处理剩下的沼液又成为了新的难题。但沼液存在含水量较高、储存运输困难、经济价值相对较低等缺陷。当工程规模过大、产生的沼液量远远超过当地农田最大消纳量时，沼液就变成了一种难以治理的废水。如果将这部分沼液随意排放，会对自然环境尤其是水体环境造成严重伤害。因此，对沼液进行无害化处理，使其达到相关标准尤为重要。然而，现有对沼液的处理方法均需要先絮凝沉淀去除沼液中的颗粒悬浮物(ss)。
目前广泛应用的絮凝剂主要有：以铝系为代表的无机高分子絮凝剂，及以聚丙烯酰胺为代表的有机高分子絮凝剂。无机絮凝剂有着经济、用法简单的优点；但同时也存在用量大、絮凝效果低、成本高、腐蚀性强等缺陷。有机高分子絮凝剂是20世纪60年代后期才发展起来的一类新型废水处理剂，与传统絮凝剂相比，它能成倍提高效能，且用量少，浮渣产量少，絮凝能力强，絮体容易分离，除油及除悬浮物效果好。但由于大多数有机高分子絮凝剂本身或其水解、降解产物有毒，且合成用丙烯酰胺单体有毒，会麻醉人的中枢神经，残余单体具有“三致”效应(致畸、致癌、致突变)，不符合当今环境友好发展的趋势。另外，当使用无机高分子或有机高分子作为絮凝剂时，沉淀物中的大量铝离子或聚丙烯酰胺的存在也会影响沼渣、沼液作为高品质肥料的使用。
由于微生物絮凝剂可以克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，不存在二次污染，使用安全，近年来在微生物絮凝剂的研究日益受到重视。但沼液天然具有一定的杀菌作用，能在沼液中良好生长的微生物菌种资源匮乏，絮凝效果也并不理想。另外，不同沼液由于各自组分的不同，可在一种沼液中生长良好的菌株并不一定适应另一种沼液的环境。因此，可应用于沼液的微生物絮凝剂发展受限。如能针对特定沼液提出具有特定絮凝效果的生物絮凝剂，将具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种针对性絮凝酒糟沼液的生物絮凝剂及制备方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种生物絮凝剂，所述生物絮凝剂来自粪产碱菌、蜡状芽孢杆菌和缺陷短波单胞菌混合发酵的发酵产物。
优选的，所述粪产碱菌的保藏编号为：cgmccno.17863；和/或；所述蜡状芽孢杆菌的保藏编号为：cgmccno.17865；和/或；所述缺陷短波单胞菌的保藏编号为：cgmccno.17864。
优选的，所述粪产碱菌的16srdna如seqidno.1所示；和/或；所述蜡状芽孢杆菌16srdna如seqidno.2所示；所述缺陷短波单胞菌的16srdna如seqidno.3所示。
优选的，所述发酵产物为发酵液的上清液。
相应的，所述生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用。
优选的，所述应用包括如下步骤：
(1)将粪产碱菌、蜡状芽孢杆菌和缺陷短波单胞菌接种于同一培养底物进行共同发酵，获得发酵液，从发酵液中获得发酵产物；
(2)将发酵产物加入待絮凝的酒糟沼液中，混匀，静置。
优选的，所述发酵产物为发酵液的上清液。
优选的，所述发酵产物为发酵第3天的发酵液上清液。
优选的，发酵过程中，使用木糖为碳源。
优选的，发酵过程中，使用蛋白胨为氮源。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的微生物混合发酵获得的生物絮凝剂，无毒无害，安全环保。该絮凝剂可单独使用，无需助凝剂的配合，可针对性絮凝酒糟沼液，絮凝效果在86％以上。
附图说明
图1为使用不同接种比例获得的生物絮凝剂絮凝高岭土溶液的效果展示图；
图2使用不同发酵时间的发酵液絮凝高岭土溶液的效果展示图；
图3为使用不同助凝剂絮凝高岭土溶液的效果展示图；
图4为使用不同种类絮凝剂絮凝高岭土溶液的效果展示图；
图5为使用不同外加碳源对絮凝高岭土溶液影响的效果展示图；
图6为使用不同外加氮源对絮凝高岭土溶液影响的效果展示图；
图7为絮凝剂用量对絮凝酒糟沼液影响的效果展示图；
图8为发酵液絮凝不同批次酒糟沼液照片；
图9为不同絮凝剂絮凝酒糟沼液的对比照片；
图10为市购菌株发酵获得的絮凝剂絮凝酒糟沼液的照片。
具体实施方式
本发明涉及的培养基配方为：葡萄糖10g/l；蛋白胨0.5g/l、酵母提取物0.5g/l、尿素0.5g/l、(nh4)2so40.5g/l，kh2po45g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，nacl0.1g/l，ph为7～9，115℃灭菌20min。如需固体培养基，则添加20g/l的琼脂。
本发明涉及的对高岭土溶液进行絮凝的实验方法为：取4g/l的高岭土溶液40ml，加入絮凝剂，再加入助凝剂，搅拌均匀后，静置10min后观察絮凝效果。絮凝率的计算方法为：采用分光光度计法分别测定高岭土处理前后吸光度值的变化，以计算絮凝率。具体为：取液面下2cm的液体，测定其在550nm的吸光度值，根据加入絮凝剂处理与空白的吸光度值变化得到絮凝率。计算公式为：高岭土絮凝率＝(a-b)/a×100％。其中，a为空白组在550nm下的吸光度值，b为加入絮凝剂处理后在550nm下吸光度值。
本发明涉及的对沼液进行絮凝的实验方法为：取20ml沼液，加入絮凝剂，再加入助凝剂，搅拌均匀后，静置30min后观察絮凝效果。絮凝率的计算方法为：采用浊度仪测定沼液处理前后浊度的变化来计算。具体为：取液面下2cm的液体，测定处理前后浊度的变化，从而计算出絮凝率。计算公式为：沼液絮凝率＝(m-n)/m×100％。其中，m为空白组的浊度，n为加入絮凝剂处理后的浊度。
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。
实施例一：絮凝剂产生菌的筛选与鉴定
取中国科学院成都生物研究所实验室发酵罐内保存的活性污泥10ml至装有50ml无菌水的150ml三角瓶中，摇匀后静置1min，取5ml到装有100ml所述培养基的150ml三角瓶中，在ph＝7、30℃下160r/min摇床培养24h。随后采用稀释涂布法分10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个梯度稀释发酵液后涂布于所述固体培养基上，挑取不同的单菌落，再用平板划线法分离单个菌落三次以上，直至菌落形态一致，得到纯化菌种。将纯化后的菌种接种5ml到装有100ml所述培养基的150ml三角瓶中，在ph＝7、30℃下160r/min摇床培养72h，每隔24h取一次样，以常用助凝剂氯化钙为助凝剂，测量以酒糟沼液为处理对象的絮凝率，选出絮凝效果好的菌种。本发明供获得三种絮凝剂产生菌。
对获得的三种菌种分别进行测序分析：采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16srrna通用引物进行pcr扩增，然后测序分析。
第一株菌株的16srrna基因序列如seqidno.1所示，命名为as28。测序结果经ncbi数据库中的blast比对，菌株as28与粪产碱菌alcaligenesfaecalis的同源性为100％，因此鉴定该菌株为粪产碱菌；于2019年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：cgmccno.17863。
第二株菌株的16srrna基因序列如seqidno.2所示，命名为as33。测序结果经ncbi数据库中的blast比对，as33与蜡状芽孢杆菌bacilluscereus的同源性为100％，因此鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌。于2019年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：cgmccno.17865。
第三株菌株的16srrna基因序列如seqidno.3所示，命名为as30。测序结果经ncbi数据库中的blast比对，as30与缺陷短波单胞菌brevundimonasdiminuta的同源性为100％，因此鉴定该菌株为缺陷短波单胞菌。于2019年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：cgmccno.17864。
实施例二：混合微生物发酵液絮凝高岭土溶液的条件优化
以高岭土为处理对象，以发酵液为絮凝剂，在40ml、4g/l的高岭土悬浊液体系中，采用单因素试验考察不同接种比例、不同时间、不同助凝剂对菌体生长及絮凝效果的影响。除考察因素外，发酵条件为：ph＝7、30℃、160r/min摇床培养3天。絮凝剂用量为：2％(2％指絮凝剂与絮凝体系总体积间的体积比，后文无特殊说明则与此相同。2％为一般用量)，具体如下：
1、配置相同所述培养基分装于150ml三角瓶中，分别接种不同比例的实施例一获得的三株絮凝剂产生菌株于所述培养基中进行混合培养。接种比例为，按活菌浓度比，as28：as30：as33分别为：1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、2:1:1、2:1:2、2:2:1。发酵3天后，分别取各组发酵液的上清液作为絮凝剂，测试絮凝率。结果如图1所示。as28：as30：as33＝1:1:1时絮凝效果最佳，后续试验均用此比例。
2、絮凝剂发酵时间(活菌浓度)的优化。160r/min摇床培养7d，每24h取样一次发酵液作为絮凝剂，测量絮凝率。结果如图2所示。在使用了助凝剂的情况下，第5天(发酵液中活菌浓度为1.8×108cfu/ml左右；发酵液的od600为2.2)絮凝效果最佳，第3天(发酵液中活菌浓度为2.3×108cfu/ml左右；发酵液的od600为1.7)与第5天效果相当。实际应用时，需发酵至发酵液中活菌浓度为1×106cfu/ml～5×108cfu/ml，且发酵液的od600为1～2.5。在活菌浓度为2×108cfu/ml、发酵液的od600为2.2时，絮凝效果最佳。考虑到实际使用时培养时间过长则成本过高，故后续试验中选择第三天的发酵液作为絮凝剂。
3、助凝剂的优化。取步骤2中发酵至第3天的发酵液上清液，分别选用硫酸铝、氯化铝、硫酸铁、硫酸钙、氯化钙为助凝剂，各助凝剂的添加量为万分之一(助凝剂质量g/发酵体系总体积ml)。测量絮凝率。结果如图3所示。使用助凝剂后，絮凝效果反而有所下降。因此，后续试验无特殊说明则不使用助凝剂。
4、絮凝剂种类的选择。选择步骤2中发酵3天获得发酵液，分别取发酵液的离心上清液、发酵液的离心沉淀、发酵液离心沉淀破碎后的离心上清液、发酵液离心沉淀破碎后的离心沉淀，分别作为絮凝剂以测量絮凝率。结果如图4所示。发酵液的上清液作为絮凝剂时絮凝效果最佳，后续试验均以发酵液上清液作为絮凝剂。
5、外加碳源的优化。使用葡萄糖10g/l，木糖10g/l，蔗糖9.5g/l，可溶性淀粉9.5g/l，柠檬酸钠14.3g/l，乙醇7.7g/l，乙酸钠13.7，丙酸钠10.7g/l，果糖10g/l作为外加碳源，分别替换所述培养基中10g/l的葡萄糖。使用调整后的新培养基共同培养所述三株菌株。分别测量各组絮凝率。结果如图5所示。
6、外加氮源的优化。分别使用3.2g/l蛋白胨、1.8g/l氯化铵、3.3g/l硝酸钾、1.0g/l尿素作为外加氮源，替换所述培养基中的氮源(蛋白胨0.5g/l、酵母提取物0.5g/l、尿素0.5g/l和(nh4)2so40.5g/l)。外加氮源的总量为0.5g/l的n。分别测量各组絮凝率，结果如图6所示。
根据上述试验，最终确定，在后续试验中，取复合微生物第三天的发酵液上清液作为絮凝剂；以硫酸铁作为助凝剂；以蔗糖为碳源、蛋白胨为氮源时生长良好；以木糖为碳源、蛋白胨为氮源时，絮凝率最高，达到69.98％。
实施例三：絮凝酒糟沼液的条件优化
选择遵义播州区某酒糟沼气工程的沼液，进行絮凝试验。测试酒糟沼液中初始氨氮含量约为1105mg/l，cod为19000～22000mg/l。配置相同所述培养基分装于150ml三角瓶中，接种蜡状芽孢杆菌进行培养。以所述酒糟沼液为处理对象，以发酵液离心上清液为絮凝剂，在40ml酒糟沼液体系中，采用单因素试验考察不同助凝剂用量和不同絮凝剂用量对菌体生长及絮凝效果的影响。除考察因素外，发酵条件为：ph＝7、30℃、160r/min摇床培养3天。具体为：在所述酒糟沼液中分别加入1％、2％、3％、4％、5％体积的絮凝剂。所述絮凝剂指发酵3天的混合发酵液的上清液。其中，比值指絮凝剂体积：待絮凝沼液体积。分别测量絮凝率。结果如图7所示。图7中分别使用0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml发酵液作为絮凝剂。结果表明，使用5％絮凝剂时效果最佳。
实施例四：絮凝不同批次的酒糟沼液效果展示
选择遵义播州区不同批次的酒糟沼液，进行絮凝试验。试验方法同实施例三，其中，絮凝剂用量5％。测试5组不同批次的酒糟沼液，各组絮凝率分别为80.27％、85.15％、86.35％、88.67％、87.42％、84.37％。并任意选取5瓶絮凝酒糟沼液的效果进行展示，如图8所示。证明本发明提供的絮凝剂对酒糟沼液确实存在针对性絮凝效果，与酒糟沼液批次无关。
实施例五：其它絮凝剂絮凝酒糟沼液效果展示
1、在与实施例四相同条件下，分别使用絮凝剂as28(产自粪产碱菌，cgmccno.17863) 硫酸铁助凝剂、絮凝剂as30(产自缺陷短波单胞菌，cgmccno.17864) 硫酸铁助凝剂、蜡状芽孢杆菌絮凝剂(as33) 硫酸铁助凝剂、本发明实施例四用量为5％的絮凝剂、本发明实施例四用量为5％的絮凝剂 聚合氯化铝助凝剂、聚合氯化铝和聚丙烯酰胺作为絮凝剂，对酒糟沼液进行絮凝。各助凝剂用量均为万分之一(g/ml)。
结果如图9所示。各组絮凝率分别为2.31％、5.67％、4.21％、84.39％、82.17％、72.17％、40.15％。其中，除本发明提供的絮凝剂外，聚合氯化铝的絮凝效果最佳，但获得的絮凝物比本发明絮凝剂絮凝后获得的絮凝物更加蓬松，上清液占比更少，致密性较差。因此，本发明提供的絮凝剂不仅更生态环保、絮凝率更高，且絮凝后获得的产物也更便于进行后续处理。
2、从中国微生物菌种保藏管理中心购买cgmcc1.924粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)、cgmcc1.8077缺陷短波单胞菌(brevundimonasdiminuta)、cgmcc1.9067蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)，在与实施例四相同的条件下制备絮凝剂并对酒糟沼液进行絮凝。结果如图10所示，絮凝率为21.34％，效果不理想。
序列表
<110>中国科学院成都生物研究所
<120>一种针对性絮凝酒糟沼液的生物絮凝剂及制备方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1470
<212>dna
<213>粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)
<400>1
tcagattgaacgctagcgggatgctttacacatgcaagtcgaactacagcacgcgagagc60
ttgctctcttggtggcgagtggcggacgggtgagtaatatatcggaacgtgcccagtagc120
gggggataactactcgaaagagtggctaataccgcatacgccctacgggggaaagggggg180
gatcgcaagacctctcactattggagcggccgatatcggattagctagttggtggggtaa240
aggctcaccaaggcaacgatccgtagctggtttgagaggacgaccagccacactgggact300
gagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggggaaa360
ccctgatccagccatcccgcgtgtatgatgaaggccttcgggttgtaaagtacttttggc420
agagaagaaaaggcatcccctaatacgggatgctgctgacggtatctgcagaataagcac480
cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaatta540
ctgggcgtaaagcgtgtgtaggcggttcggaaagaaagatgtgaaatcccagggctcaac600
cttggaactgcatttttaactgccgagctagagtatgtcagaggggggtagaattccacg660
tgtagcagtgaaatgcgtagatatgtggaggaataccgatggcgaaggcagccccctggg720
ataatactgacgctcagacacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtag780
tccacgccctaaacgatgtcaactagctgttggggccgttaggccttagtagcgcagcta840
acgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgac900
ggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcgaaaaaccttac960
ctacccttgacatgtctggaatgccgaagagatttggcagtgctcgcaagagaaccggaa1020
cacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaa1080
cgagcgcaacccttgtcattagttgctacgcaagagcactctaatgagactgccggtgac1140
aaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcac1200
acgtcatacaatggtcgggacagagggtcgccaacccgcgagggggagccaatctcagaa1260
acccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagt1320
aatcgcggatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtca1380
caccatgggagtgggtttcaccagaagtaggtagcctaaccgtaaggagggcgcttacca1440
cggtgggattcatgactggggtgaagtcgt1470
<210>2
<211>949
<212>dna
<213>蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)
<400>2
ggttcgacgcgtgctatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaa60
gttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactcc120
gggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcg180
gcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggc240
tcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgaga300
cacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtct360
gacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttaggg420
aagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacgg480
ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattg540
ggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgt600
ggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgt660
agcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctg720
taactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc780
acgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaa840
cgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacg900
ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcga949
<210>3
<211>949
<212>dna
<213>缺陷短波单胞菌(brevundimonasdiminuta)
<400>3
ttgctacgcggactaccatgcagtcgaacggacccttcggggttagtggcggacgggtga60
gtaacacgtgggaacgtgcctttaggttcggaatagctcctggaaacgggtggtaatgcc120
gaatgtgcccttcgggggaaagatttatcgcctttagagcggcccgcgtctgattagcta180
gttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgaccag240
ccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatcttgc300
gcaatgggcgaaagcctgacgcagccatgccgcgtgaatgatgaaggtcttaggattgta360
aaattctttcaccggggacgataatgacggtacccggagaagaagccccggctaacttcg420
tgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaattactgggcgtaaag480
ggcgcgtaggcggatcgttaagtcagaggtgaaatcccagggctcaaccctggaactgcc540
tttgatactggcgatcttgagtatgagagaggtatgtggaactccgagtgtagaggtgaa600
attcgtagatattcggaagaacaccagtggcgaaggcgacatactggctcattactgacg660
ctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaa720
acgatgattgctagttgtcgggctgcatgcagttcggtgacgcagctaacgcattaagca780
atccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcac840
aagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccaccttttgaca900
tgcctggaccgccacggagacgtggctttcccttcggggactaggacac949
1.一种生物絮凝剂，其特征在于：所述生物絮凝剂来自粪产碱菌、蜡状芽孢杆菌和缺陷短波单胞菌混合发酵的发酵产物。
2.根据权利要求1所述的生物絮凝剂，其特征在于：所述粪产碱菌的保藏编号为：cgmccno.17863；和/或；所述蜡状芽孢杆菌的保藏编号为：cgmccno.17865；和/或；所述缺陷短波单胞菌的保藏编号为：cgmccno.17864。
3.根据权利要求1所述的生物絮凝剂，其特征在于：其特征在于：所述粪产碱菌的16srdna如seqidno.1所示；和/或；所述蜡状芽孢杆菌16srdna如seqidno.2所示；所述缺陷短波单胞菌的16srdna如seqidno.3所示。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的生物絮凝剂，其特征在于：其特征在于：所述发酵产物为发酵液的上清液。
5.权利要求1～4任意一项所述生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用。
6.根据权利要求5所述生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用，其特征在于：所述应用包括如下步骤：
(1)将粪产碱菌、蜡状芽孢杆菌和缺陷短波单胞菌接种于同一培养底物中进行共同发酵，获得发酵液，从所述发酵液中获得发酵产物；
(2)将所述发酵产物加入待絮凝的酒糟沼液中，混匀，静置。
7.根据权利要求6所述的生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用，其特征在于：所述发酵产物为发酵液的上清液。
8.根据权利要求7所述的生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用，其特征在于：所述发酵产物为发酵第3天的发酵液上清液。
9.根据权利要求6所述的生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用，其特征在于：发酵过程中，使用木糖为碳源。
10.根据权利要求6所述的生物絮凝剂在絮凝酒糟沼液中的应用，其特征在于：发酵过程中，使用蛋白胨为氮源。
技术总结