本发明涉及纳米技术和酶催化领域，特别是涉及二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物的应用。
背景技术：
酶是生物体内产生的具有专一性和高效催化活性的生物催化剂，生物体进行的各种化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。近年来，天然酶作为酶标记物，在酶联免疫分析中得到了广泛的应用。然而天然酶具有内在的一些缺点，如制备与纯化复杂、不易保存、成本较高等。纳米模拟酶(又称为纳米酶)是指一类具有酶催化活性的纳米材料(chem.soc.rev.,2013,42,6060)。相比于天然酶，纳米酶既具有天然酶的催化活性，又克服了天然酶的内在缺点，具有化学稳定性高、价格低廉、易大量制备等优点。因此，纳米酶作为酶的替代物，在生物医学传感、细胞成像、疾病治疗和环境保护等领域具有重要的应用前景。
碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，简称alp)是一类水解酶，是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等，在碱性环境有最大活力。alp是免疫酶标技术中最为常用的酶之一，用于抗体的标记。然而，alp存在价格高、纯化和制备步骤繁琐、不稳定等缺点，因此，寻找具有alp催化活性的纳米模拟物来替代alp具有非常重要的意义。2010年，氧化铈纳米粒子首次被发现具有alp的催化活性。作为alp纳米模拟物，氧化铈纳米粒子可以催化多种底物的去磷酸化，这些底物包括对硝基苯酚磷酸盐(p-nitrophenylphosphate，简称p-npp)、三磷酸腺苷(atp)和l-磷酸酪氨酸(nanomedicine:2010,6:738-744)。然而，氧化铈纳米粒子是目前唯一报道的具有alp催化活性的纳米模拟物，其也存在着成本较高的问题。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物的应用，本发明发现二氧化锆纳米粒子具有类似碱性磷酸酶的催化活性，可以作为碱性磷酸酶的替代物，且成本低，有望在免疫分析、生物传感和细胞成像等领域得到广泛的应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种二氧化锆纳米粒子碱性磷酸酶纳米模拟物，所述二氧化锆纳米粒子具有碱性磷酸酶的特性，其能催化碱性磷酸酶比色底物显色和/或催化碱性磷酸酶荧光底物发光。
进一步，所述碱性磷酸酶比色底物为对硝基苯磷酸盐(pnpp)，二氧化锆纳米粒子通过催化对硝基苯磷酸盐(pnpp)去磷酸化生成产物对硝基苯酚，所述产物为黄色，在405nm处有最大吸收峰。
进一步，所述碱性磷酸酶荧光底物为4-甲基伞形酮磷酸酯(4-mup)，二氧化锆纳米粒子通过催化4-甲基伞形酮磷酸酯(4-mup)去磷酸化生成产物4-甲基伞形酮，所述产物可以在450nm处产生荧光。
进一步，所述二氧化锆纳米粒子的ph适用范围为2.5～10.0，优选为8.5。
进一步，所述二氧化锆纳米粒子的温度适用范围为15～90℃。
本发明第二方面提供一种采用二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物在制备碱性磷酸酶免疫试剂盒上的应用。
进一步，所述碱性磷酸酶免疫试剂盒包括碱性磷酸酶比色免疫试剂盒和碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒。
进一步，所述碱性磷酸酶比色免疫试剂盒通过405nm处吸光度值的变化，来对目标蛋白进行检测；所述碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒通过450nm处荧光强度值的变化，来对目标蛋白进行检测。
进一步，所述碱性磷酸酶比色免疫试剂盒的比色底物为对硝基苯磷酸盐(pnpp)，所述碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒的荧光底物为4-甲基伞形酮磷酸酯(4-mup)。
本发明第三方面提供二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物在免疫分析、生物传感检测、细胞成像中的应用。
如上所述，本发明的二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物的应用，具有以下有益效果：
本发明发现二氧化锆纳米粒子具有类似碱性磷酸酶的催化活性，可以作为碱性磷酸酶的替代物。使用二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶的代替物，具有以下优点：首先，碱性磷酸酶价格较贵，这是因为其需要从细胞内提取，纯化步骤复杂，而二氧化锆纳米粒子可以在实验室大规模合成，其成本大大降低。其次，碱性磷酸酶容易失活变性，不容易保存，通常碱性磷酸酶需要保存在冰箱零下二十度，而二氧化锆纳米粒子作为一种无机材料，化学性质稳定，可以保存在室温条件下不变性。
本发明可应用于免疫分析、生物传感检测、细胞成像等领域。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中二氧化锆纳米粒子催化荧光底物4-mup的荧光发射曲线图。
图2显示为本发明实施例2中二氧化锆纳米粒子催化比色底物pnpp的吸收曲线图。
图3显示为本发明实施例3中二氧化锆纳米粒子和碱性磷酸酶(alp)的活性受ph及温度的影响结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
碱性磷酸酶在商品化的免疫分析中得到了广泛的应用，是通过其催化比色底物变色，或者催化荧光底物发光来实验的。常用的碱性磷酸酶比色底物为对硝基苯磷酸盐(即pnpp)，常用的碱性磷酸酶荧光底物为4-甲基伞形酮磷酸酯(即4-mup)。在比色分析中，碱性磷酸酶可以催化pnpp的去磷酸化，生产的产物为对硝基苯酚，该产物为黄色，吸收峰在405nm。商品化的碱性磷酸酶比色免疫试剂盒，是通过405nm吸光度值的变化，来对目标蛋白进行检测的。商品化的碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒，是通过碱性磷酸酶催化4-mup去磷酸化，产生可以在450nm处发射荧光的物质4-甲基伞形酮，来实现对目标蛋白的检测。本发明在实验中发现，二氧化锆纳米粒子也可以催化pnpp和4-mup的去磷酸反应，产生相应的黄色或者荧光产物。因此，二氧化锆纳米粒子可以作为碱性磷酸酶的代替物，在相关领域得到应用。
以下实施例中采用的二氧化锆纳米粒子为购买的商品化二氧化锆纳米粒子，其来自与南京先丰纳米材料科技有限公司，编号：xfi01。
当然，本发明所用的二氧化锆纳米粒子，也可以通过热分解氢氧化锆得到，相关的合成方法已经成熟，途径很多，就不在此举例说明。
实施例1
实验方法：
在室温下，将50μl100μm的4-mup，50μl2mg/ml的二氧化锆纳米粒子和900μl20mmhepes缓冲溶液(ph8.5)混合，然后测量混合溶液在450nm处的荧光强度随时间的变化，所用荧光激发波长为360nm。
图1显示为二氧化锆纳米粒子催化荧光底物4-mup的荧光发射曲线图。其中，曲线a为缓冲溶液；曲线b为缓冲溶液中加入了5μm4-mup；曲线c为缓冲溶液同时加入了5μm4-mup和100μg/ml二氧化锆纳米粒子。内插图为曲线a\b\c相应的照片，是在反应进行10分钟后，在紫外灯下拍摄得到。
从图1可以看到，二氧化锆纳米粒子可以催化4-mup发光，这一性质和碱性磷酸酶类似。
实施例2
实验方法：
在室温下，将50μl10mm的pnpp，50μl2mg/ml的二氧化锆纳米粒子和900μl20mmhepes缓冲溶液(ph8.5)混合，然后测量混合溶液在405nm处的可见光吸收值随时间的变化。
图2显示为二氧化锆纳米粒子催化比色底物pnpp的吸收曲线图。其中，曲线a为缓冲溶液；曲线b为缓冲溶液中加入了500μmpnpp；曲线c为缓冲溶液同时加入了500μmpnpp和100μg/ml二氧化锆纳米粒子。内插图为为曲线a\b\c相应的照片，是在反应进行30分钟后拍摄得到。
从图2可以看到，二氧化锆纳米粒子可以催化pnpp变色，这一性质和碱性磷酸酶类似。
实施例3
1、将二氧化锆纳米粒子和碱性磷酸酶放置到不同ph值(ph分别为2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10.0)的20mmhepes缓冲溶液中(二氧化锆纳米粒子和碱性磷酸酶在缓冲溶液中的最终浓度均为100μg/ml)，静置2个小时，然后检测其催化活性(使用4-mup底物为例子，最高活性设置为100％)，结果如图3a所示。
由图3可知，二氧化锆纳米粒子和碱性磷酸酶都是在ph为8.5的条件下催化活性最高，即ph＝8.5是二氧化锆纳米粒子和碱性磷酸酶催化活性表现的最优ph条件。同时，发现如果把alp先在酸性条件(ph＜7.0)下保存2个小时，再来测活性，其活性损失很大，说明alp溶液受溶液ph的影响而变性，这与酶的基本性质是一致的，如果溶液的ph值改变，酶活性受到的影响很大；相比之下，把二氧化锆纳米粒子在酸性溶液中保存2个小时，其活性基本不受影响，说明其稳定性非常好。
2、我们将100μg/ml二氧化锆纳米粒子溶液和100μg/ml碱性磷酸酶溶液加热到不同温度(温度分别为15、30、45、60、75、90℃)，并保持2个小时，然后在室温下测它们的催化活性(使用4-mup底物为例子，最高活性设置为100％)。结果如图3b所示，发现如果把alp加热后，再来测活性，虽然已经冷却到室温，其活性损失很大，说明alp容易受热变性，不易保存；相比之下，把二氧化锆纳米粒子加热2个小时，其活性基本不受影响，说明其对温度的稳定性非常好。
这与酶的基本性质是一致的，一般来说，碱性磷酸酶不用时应放到冰箱零下二十度，无法常温保存，而二氧化锆纳米粒子对温度不敏感，不需要特殊保存。
综上所述，本发明发现二氧化锆纳米粒子也可以催化pnpp和4-mup的去磷酸反应，产生相应的黄色或者荧光产物。使用二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶的代替物，具有以下优点：首先，碱性磷酸酶价格较贵，这是因为其需要从细胞内提取，纯化步骤复杂，而二氧化锆纳米粒子可以在实验室大规模合成，其成本大大降低。其次，碱性磷酸酶容易失活变性，不容易保存，通常碱性磷酸酶需要保存在冰箱零下二十度，而二氧化锆纳米粒子作为一种无机材料，化学性质稳定，可以保存在室温条件下不变性。因此，二氧化锆纳米粒子可以作为碱性磷酸酶的代替物，在免疫分析、生物传感检测、细胞成像等相关领域得到广泛应用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
1.一种二氧化锆纳米粒子碱性磷酸酶纳米模拟物，其特征在于，所述二氧化锆纳米粒子具有碱性磷酸酶的特性，其能催化碱性磷酸酶比色底物显色和/或催化碱性磷酸酶荧光底物发光。
2.根据权利要求1所述的二氧化锆纳米粒子碱性磷酸酶纳米模拟物，其特征在于：所述碱性磷酸酶比色底物为对硝基苯磷酸盐，二氧化锆纳米粒子通过催化对硝基苯磷酸盐去磷酸化生成产物对硝基苯酚，所述产物为黄色，在405nm处有最大吸收峰。
3.根据权利要求1所述的二氧化锆纳米粒子碱性磷酸酶纳米模拟物，其特征在于：所述碱性磷酸酶荧光底物为4-甲基伞形酮磷酸酯，二氧化锆纳米粒子通过催化4-甲基伞形酮磷酸酯去磷酸化生成产物4-甲基伞形酮，所述产物在450nm处产生荧光。
4.根据权利要求1所述的二氧化锆纳米粒子碱性磷酸酶纳米模拟物，其特征在于：所述二氧化锆纳米粒子的ph适用范围为2.5～10.0，优选为8.5。
5.根据权利要求1所述的二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物的应用，其特征在于：所述二氧化锆纳米粒子的温度适用范围为15～90℃。
6.一种采用二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物在制备碱性磷酸酶免疫试剂盒上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述碱性磷酸酶免疫试剂盒包括碱性磷酸酶比色免疫试剂盒和碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述碱性磷酸酶比色免疫试剂盒通过405nm处吸光度值的变化，来对目标蛋白进行检测；所述碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒通过450nm处荧光强度值的变化，来对目标蛋白进行检测。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述碱性磷酸酶比色免疫试剂盒的比色底物为对硝基苯磷酸盐，所述碱性磷酸酶荧光免疫试剂盒的荧光底物为4-甲基伞形酮磷酸酯。
10.二氧化锆纳米粒子作为碱性磷酸酶纳米模拟物在免疫分析、生物传感检测、细胞成像中的应用。
技术总结