本发明属于蛋白质与生物技术领域，具体涉及一种人工金属酶及其制备方法与应用，尤其是一种基于镁离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属酶及其制备方法与应用。
背景技术：
蛋白质作为生命活动的物质基础，参与体内所有关键活动。据研究，约1/3蛋白质与特定金属离子结合来维持其结构和生物功能，这类蛋白称之为金属蛋白。在过去的几十年，基因工程和蛋白质工程技术的迅猛发展，血红素蛋白质的理性设计逐渐被人们所关注，蛋白质的理性设计有助于揭示血红素蛋白的结构和功能之间的关系。
肌红蛋白(myoglobin，mb)常作为血红素蛋白质分子设计骨架，它具有分子量小、稳定性高等特点，易获得高纯度蛋白和晶体结构等。以mb为模板，通过设计调控血红素活性中心微环境，可设计获得各种人工金属蛋白酶。
基于基因工程和蛋白质工程技术的发展，运用定点突变技术可以研究特定氨基酸残基在蛋白质结构、功能和性质中的作用。
金属酶的活性部位一般都含有两个或多个协同作用的金属离子，这些金属蛋白的金属中心一般都具有独特的配位方式和配位集合结构，而正是由于配位后的这种特殊的结构和排列，使金属蛋白和金属酶具有特殊的功能和活化中心。天然金属酶的高催化活性，归因于其活性中心金属离子与周边的氨基酸残基的协同作用。因此，模拟天然金属蛋白和金属酶中的多核活性中心结构，能够合成具有降解核酸功能的人工金属水解酶。
申请人前期申请的申请号为201810251841.8.，发明名称为一种基于金属离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用的中国专利中，专利提到了锰离子mn(ii)和钴离子(ii)与l29emb形成的mnii(或coii)-l29emb复合物。但该两种复合物只具有dna内切酶活性，不具有外切酶活性，即只能将dna切割成线状和开环缺口状态，而不能降解dna。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种具有外切酶活性，能快速降解线性或环状dna分子的人工金属酶。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种人工金属酶，包括肌红蛋白突变体和金属离子，所述肌红蛋白突变体为l29emb氨基酸序列如seqidno:1所示，所述金属离子为mgii。
本发明所述肌红蛋白突变体是在野生型肌红蛋白(mb)的氨基酸序列中，第29位氨基酸由异亮氨酸(l)突变为谷氨酸(e)得到突变体蛋白l29emb，其氨基酸序列为：vlsegewqlvlhvwakveadvaghgqdieirlfkshpetlekfdrfkhlkteaemkasedlkkhgvtvltalgailkkkghheaelkplaqshatkhkipikylefiseaiihvlhsrhpgdfgadaqgamnkalelfrkdiaakykelgyqg。
本发明所述肌红蛋白突变体与金属镁离子mgii，形成金属离子-蛋白质复合物mgii-l29emb复合物，即一种新型人工金属蛋白酶。
在本发明中，所述的人工金属酶中所述的肌红蛋白突变体与金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)。在一些实施例中，所述的肌红蛋白突变体与金属离子的摩尔比为1:2。
在本发明中，所述的人工金属酶中所述的肌红蛋白突变体的终浓度为10μmol/l，金属离子的终浓度为5～20μmol/l。
本发明提供了所述人工金属酶的制备方法，将肌红蛋白突变体与mgii离子盐的水溶液混合，静置30min。
在本发明中，所述mgii离子盐为mgcl2、mgso4或mgac2。
实验结果表明，本发明所述人工金属酶能快速催化降解dna分子，水解基本单元核苷酸中的3′,5′-磷酸二酯键，实现dna分子高效降解。因此本发明提供了所述的人工金属酶在制备降解核酸的制剂中的应用。
在本发明中，所述核酸为环状dna或线状dna。所述环状dna，如puc19dna；所述线性dna，如λ-dna。
本发明还提供了一种降解核酸的方法，将核酸溶液与上述人工金属酶混合，4～40℃反应30～50min。
在一些实施方案中，所述反应温度为25℃，反应时间为40min。
在本发明中，所述降解核酸的方法中，所述核酸溶液中核酸的浓度为0.01μg/μl。
本发明公布了一种基于金属镁离子-肌红蛋白突变体复合物的人工dna降解酶的制备和应用研究。本发明中突变体肌红蛋白是在肌红蛋白血红素活性中心上方29位引入谷氨酸，与金属镁离子mg(ii)结合，形成mg(ii)-l29emb复合物，可以快速降解线性或环状dna分子，具有类似天然核酸外切酶活性。
本发明以肌红蛋白为蛋白质分子设计骨架，在活性中心血红素周围引入谷氨酸，加入mgii离子，形成金属离子-蛋白质复合物mgii-l29emb，构建了一种新型的人工金属酶。本发明所述人工金属酶利用金属离子与突变体肌红蛋白结合，形成金属-血红素活性中心双活性中心，极大程度提高了肌红蛋白的水解效率。与常见的天然内切酶不同，mnii(或coii)-l29emb复合物只能将dna切割成线状和开环缺口状态，而本发明所述mgii-l29emb复合物能连续水解dna分子中的磷酸二酯键，最终降解dna分子，从而类似于天然核酸外切酶性质，具有dna外切酶活性，能快速降解dna分子，最终实现dna完全降解。降解的dna底物分子具有广谱性，包括线性dna或环状dna分子。而且，这一催化活性是野生型mb或单独l29emb蛋白以及mnii(或coii)-l29emb复合物所不具有的。这些研究为血红素蛋白断裂dna提供了重要信息，为基于血红素蛋白分子骨架理性设计人工核酸外切酶奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为l29emb与不同比例金属镁离子结合水解断裂及降解puc19dna，lane1:puc19dna；lane2:l29e；lane3:l29e mg2 (1:0.5)；lane4:l29e mg2 (1:1)；lane5:l29e mg2 (1:1.5)；lane6:l29e mg2 (1:2)效果图；
图2为l29emb mg2 (1:2)随时间变化水解断裂及降解puc19dna效果图；
图3为wtmb mg2 (1:2)随时间变化水解断裂puc19dna效果图；
图4为29emb mn2 (1:2)随时间变化水解断裂puc19dna效果图；
图5为29emb co2 (1:2)随时间变化水解断裂puc19dna效果图；
图6为wtmb与l29emb水解断裂λ-dna效果对比图；lane1:λ-dna；lane2:wtmb；lane3:l29e；lane4:mg2 ；lane5:wt mg2 (1:2)；lane6:l29e mg2 (1:2)。
具体实施方式
本发明公开了一种人工金属酶及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1、
基于基因工程和蛋白质工程，运用定点突变技术，在肌红蛋白血红素空腔29位引入谷氨酸，在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并通过离子交换、柱层析等方法，进行蛋白质分离纯化，获得l29emb突变体蛋白。野生型蛋白分子(wild-type，wtmb)也用类似的纯化方法获得。
实施例2、
配制200μmol/l的l29emb。
配制100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l的mgcl2水溶液。
移取上述的l29emb分别与不同浓度的mgcl2溶液等体积混合(摩尔比分别为：1:0.5、1:1、1:1.5、1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液与环状puc19dna(0.01μg/μl)混匀后置于室温25℃，反应体系终体积保持在10μl。反应30min后，向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×tae电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75v恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于eb溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图1。结果显示l29emb与不同比例金属镁离子结合后dna均发生断裂。当l29emb与mgii离子摩尔当量为1:2时，断裂dna效果最好，且dna被降解。
实施例3、
配制200μmol/l的l29emb；配制400μmol/l的mgcl2水溶液。
分别移取上述的l29emb和mgcl2溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液6份分别与环状puc19dna(0.01μg/μl)混匀后置于室温25℃，各终体积保持在10μl。反应时间分别为10、20、30、40、45、50min，反应完成后向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×tae电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75v恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于eb溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，如图2。结果发现l29emb与mgii离子摩尔当量为1:2，反应时间为40min时，大于80％dna已被降解，50min是几乎完全被降解。
对比例1、
配制200μmol/l的wtmb。
配制100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l的mgcl2水溶液。
实验步骤如实施例3，实验结果如图3。反应时间为30min时，dna几乎没有断裂。
对比例2、
配制200μmol/l的l29emb。
配制100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l的mncl2水溶液。
实验步骤如实施例3，实验结果如图4。反应时间为40min时，dna只有断裂、没有被降解。
对比例3、
配制200μm的l29emb。
配制100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l的cocl2水溶液。
实验步骤如实施例3，实验结果如图5。反应时间为40min时，dna只有断裂、没有被降解。
实施例4、
配制200μmol/l的wtmb。配制200μmol/l的l29emb。配制400μmol/l的mgcl2水溶液。
分别移取上述的l29emb和mgcl2溶液等体积混合(摩尔比为1:2)，静置30min。分别移取上述的wtmb和mgcl2溶液等体积混合(摩尔当量为：1:2)，静置30min。反应体系溶液由去离子水配制。将上述混合溶液6份分别与线性λ-dna(0.01μg/μl)混匀后置于室温25℃，各终体积保持在10μl。反应时间分别为30min，反应完成后向体系中加入溴酚蓝终止液终止反应。然后将此反应液在5×tae电泳缓冲液中，0.9％的琼脂糖凝胶胶块上，于75v恒电压下电泳。电泳结束后，将胶块置于eb溶液中染色20min，然后用凝胶成像系统记录并分析结果，实验结果如图6。l29emb mgii金属蛋白酶能在30min内将线性dna完全降解。
1.一种人工金属酶，包括肌红蛋白突变体和金属离子，所述肌红蛋白突变体氨基酸序列如seqidno:1所示，所述金属离子为mgii。
2.根据权利要求1所述的人工金属酶，权利要求1所述的肌红蛋白突变体与金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)。
3.根据权利要求1所述的人工金属酶，权利要求1所述的肌红蛋白突变体的终浓度为10μmol/l，金属离子的终浓度为5～20μmol/l。
4.权利要求1-3任一项所述人工金属酶的制备方法，将肌红蛋白突变体与mgii离子盐的水溶液混合，静置30min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，所述mgii离子盐为mgcl2,mgso4或mgac2。
6.权利要求1-3任一项所述的人工金属酶在制备降解核酸的制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述核酸为环状dna或线状dna。
8.一种降解核酸的方法，将核酸溶液与权利要求1-3任一项所述的人工金属酶混合，4～40℃反应30～50min。
9.根据权利要求8所述的方法，所述反应温度为25℃，反应时间为40min。
10.根据权利要求8所述的方法，所述核酸溶液中核酸的浓度为0.01μg/μl。
技术总结