本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种香鳞毛蕨化合物disalbaspidinpb及其在抗菌中的应用。
背景技术：
细菌在环境中起着至关重要的作用，但同时也对人类的生命和健康带来了很大威胁。现在临床抗生素的大量使用给细菌施加了巨大的选择压力，不可避免地导致了耐药性的产生。细菌对现有的临床常用药物耐药性的惊人增加是抗菌药物选择所面临的一个严重问题，同时细菌对现有抗菌剂的耐药性也成为了全世界发病率和死亡率的主要原因之一。
此外，临床真菌感染发病率也呈不断上升的趋势，真菌感染引起人们的关注。按照国际医学界通行的标准，真菌感染大体上可分成三大类，即浅表性真菌病、皮肤真菌病以及系统性真菌病，其中系统性真菌病发病病因多系机体免疫功能受损，常病情严重，甚至危及生命。由于近年来抗生素的滥用等问题导致耐药菌株、超级细菌的不断出现，现有的抗真菌药物越来越不能满足临床的需求，而新的抗真菌药物的研发又需要很长的时间。
因此，新型抗真菌药物的研究变得越来越迫切，引起了全世界的广泛关注，寻找能够被患者更好地耐受，毒性更小，同时更有效的抗菌物质，成为我国临床和科研工作者所面临的重要问题。
中草药是中华民族几千年累积下来的文化瑰宝，与西药相比，其具有药源丰富、价格便宜、副作用小、多环节整体性治疗等优势。香鳞毛蕨(dryopterisfragrans(l.)schott)属鳞毛蕨科鳞毛蕨属，在许多国家广泛分布，特别是在中国东北的黑龙江省五大连池。香鳞毛蕨在民间广泛用于治疗皮肤病，如牛皮癣，皮疹，皮炎，脚气病等。现代药理研究表明，香鳞毛蕨是一种有价值的药用植物资源，具有广泛的生物活性，包括抗癌，抗氧化，驱蚊，抗微生物和抗炎活性。但是关于其具体有效成分的研究极少，故急需以传统中医理论和现代药理药效学为指导，研究开发天然来源的抗菌药物。
技术实现要素：
本发明旨在提供香鳞毛蕨中能够抗真菌和细菌的有效成分，即化合物disalbaspidinpb。本发明研究表明该化合物对红色毛癣菌、犬小孢子菌及石膏样小孢子菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有很好的抑菌效果，且其副作用低、不易产生耐药性，为治疗皮肤癣菌及细菌感染提供了新的天然化合物，为制备抗皮肤癣菌、细菌感染的天然新药提供有力的技术支持，具有很好的应用前景。
因此，本发明的目的在于提供一种香鳞毛蕨化合物disalbaspidinpb。
本发明的另一目的在于提供化合物disalbaspidinpb在制备抗细菌药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供化合物disalbaspidinpb在制备抗真菌药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种抗真菌的药物。
本发明的再一目的在于提供一种抗皮肤癣菌的药物。
本发明的再一目的在于提供一种抗细菌的药物。
本发明的再一目的在于提供香鳞毛蕨在制备化合物disalbaspidinpb中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种从香鳞毛蕨中分离提取disalbaspidinpb的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明从香鳞毛蕨中提取得到一种新型抗菌化合物disalbaspidinpb，其结构式如下所示：
本发明研究表明，化合物disalbaspidinpb对多种真菌和细菌致病菌表现出优良的抑菌活性。实验数据显示，disalbaspidinpb对四株临床致病菌金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为15.83、23.33、11.67和56.67μg/ml，效果均强于其阳性对照红霉素。对于溶血性葡萄球菌和表皮葡萄球菌，disalbaspidinpb的作用强于莫匹罗星；化合物disalbaspidinpb对红色毛癣菌具有较强的抑制作用，效果优于阳性对照伊曲康唑和盐酸特比萘芬；对于犬小孢子菌，disalbaspidinpb的效果优于阳性对照药盐酸特比萘芬；而对于石膏样小孢子菌，disalbaspidinpb表现出比伊曲康唑要强的抑菌活性。
因此，化合物disalbaspidinpb在制备抗细菌药物或抗真菌药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述细菌为金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
优选地，所述真菌为皮肤癣菌。
更优选地，所述真菌为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌或红色毛癣菌。
本发明还请求保护一种包含所述化合物disalbaspidinpb的抗真菌的药物。
本发明还请求保护一种包含所述化合物disalbaspidinpb的抗皮肤癣菌的药物。
本发明还请求保护一种包含所述化合物disalbaspidinpb的抗细菌的药物。
此外，本发明上述化合物disalbaspidinpb从香鳞毛蕨首分得到，因此香鳞毛蕨在制备disalbaspidinpb中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
另外，本发明的化合物disalbaspidinpb亦可通过化学手段合成。
具体地，作为一种可选择的方案，从香鳞毛蕨中提取制备化合物disalbaspidinpb的方法包括以下步骤：
s1.将香鳞毛蕨干燥粗粉用6～14倍体积50～95％乙醇冷浸提取2～3次，每次各2～3h，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得样品水溶液；
s2.用盐酸调节ph为2～4，静置18～24h，离心得到沉淀下来的浸膏；
s3.将s2所得沉淀浸膏样品溶解后，用硅胶拌样，进行硅胶色谱柱初步分离，依次采用不同比例的石油醚：丙酮(100:1,70:1,50:1,30:1,10:1,1:1)，分别得到相应的六个组分a、b、c、d、e、f；
s4.取组分a，充分溶解于乙酸乙酯中，取硅胶(60～100目)拌样后，进行硅胶(200～300目)柱色谱分离，石油醚：丙酮(200:1,150:1,100:1,50:1)梯度洗脱，tlc分析后合并相似流份，得4个组分fr-a1～a4；
s5.取组分a2，进行硅胶色谱柱(200～300目)分离，用石油醚：丙酮(200:1,150:1,120:1,90:1)梯度洗脱，得到32个流份，tlc分析后，合并lf.9-25(石油醚：丙酮＝150:1,120:1)，用sephadexlh-20凝胶柱纯化，氯仿-甲醇(1:1)洗脱，合并相同流份；再用制备液相色谱法(采用纯甲醇，v＝8ml/min，λ＝265nm)分离制备得到化合物disalbaspidinpb。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明从香鳞毛蕨中提取得到一种天然化合物disalbaspidinpb，具有较强的抗真菌及细菌的作用，可有效填补抗菌天然化合物的不足。
2.本发明提供的disalbaspidinpb结构明确，亦可通过化学手段合成，在制备抗真菌及细菌药物方面具有很好的应用前景。
3.本发明提供的disalbaspidinpb为香鳞毛蕨抗真菌及细菌方面的物质基础研究奠定了基础，明确了香鳞毛蕨抗菌活性成分，进一步促进香鳞毛蕨的有效应用，也为开发天然新型的抗真菌及细菌药物提供了新的选择和途径。
附图说明
图1为化合物disalbaspidinpb的分离流程图；
图2为化合物disalbaspidinpb的hr-esi-ms谱图；
图3为化合物disalbaspidinpb的红外谱图；
图4为化合物disalbaspidinpb的1h-nmr谱图；
图5为化合物disalbaspidinpb的13c-nmr谱图；
图6为化合物disalbaspidinpb的hmbc谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实验材料
(1)供试真菌：犬小孢子菌(cmcc(f)t5c)、红色毛癣菌(cmcc(f)t1b)、石膏样小孢子菌(cmcc(f)m2c)，由中国医学科学院皮肤病研究所(南京)提供。
(2)供试细菌：金黄色葡萄球菌质控菌株(
(3)试剂与仪器：96孔板、锥形瓶、酒精灯、超净工作台、各种量程的移液器、接种针、高温灭菌锅、培养皿、培养基恒温培养箱。
实施例1disalbaspidinpb的提取和鉴定
1、提取方法
从香鳞毛蕨中提取化合物disalbaspidinpb的方法如图1所示，具体包括以下步骤：
s1.浸膏提取：将10kg香鳞毛蕨干燥粗粉用10倍体积分数为50％的乙醇在室温下回流提取2次，时间分别为2h，用盐酸调节ph为2.4，将乙醇浸泡的药液进行浓缩提取，得到浸膏1.2kg；
s2.将s1所得沉淀浸膏样品溶解后，用硅胶拌样，进行硅胶色谱柱初步分离，依次采用不同比例的石油醚：丙酮(100:1,70:1,50:1,30:1,10:1,1:1)，得到相应的组分a(96g)、b(320g)、c(60g)、d(305g)、e(160g)、f(100g)；
s3.取组分a(30g)，充分溶解于乙酸乙酯中，取硅胶(60～100目)拌样后，进行硅胶(200～300目)柱色谱分离，石油醚：丙酮(200:1,150:1,100:1,50:1)梯度洗脱，tlc分析后合并相似流份，分别得4个组分fr.a1～a4；
s4.取组分a2(1.88g)，进行硅胶色谱柱(200～300目)分离，用石油醚：丙酮(200:1,150:1,120:1,90:1)梯度洗脱，得到32个流份，tlc分析后合并相同流分，合并流分fr.9-25(石油醚：丙酮＝150:1,120:1)，用sephadexlh-20凝胶柱纯化，氯仿-甲醇(1:1)洗脱，合并相同流份；再用制备液相色谱法(采用纯甲醇，v＝8ml/min，λ＝265nm)分离制备得到化合物disalbaspidinpb(32mg)。
化合物disalbaspidinpb为白色针状结晶，易溶于氯仿。
2、结构鉴定方法
分析所用的核磁共振仪型号varianunityinova500型超导脉冲傅里叶变换核磁共振仪(美国varian公司)；红外光谱仪型号nicolet6700(美国thermoscientific公司)；离子阱质谱仪型号lcqtmdeca。
3、鉴定结果
图2为该化合物的hr-esi-ms图谱，hr-esi-msm/z:445.1877[m-h]-(calcdfor445.1871)表明该化合物的分子式为c24h30o8。
该化合物的红外谱图如图3所示，红外数据表明化合物中存在羟基(3737cm-1)、酚羟基(3583cm-1)和苯环(1642cm-1，1565cm-1，1425cm-1)等官能团。
该化合物的1h-nmr和13c-nmr谱图分别如图4和5所示。
该化合物的谱图数据见表1。
表1化合物disalbaspidinpb的1hnmr和13cnmr数据
13c-nmr谱中δl98.6，δl87.7，δ173.2，δ44.2，δl10.7，δ107.9和δl98.6，δl87.6，δ173.2，δ44.2，δl11.1，δ107.9显示该化合物结构中含有两个绵马次酸环结构，δ17.9和1h-nmr中3.31(2h,s)说明该化合物是两个绵马次酸环通过一个亚甲基连接在一起，即此化合物结构为间苯三酚类衍生物中白绵马素结构。13c-nmr谱中δ210.5，δ44.5，δ19.2，δ19.2和1h-nmr中δ4.17(1h,m)，δ1.19(6h,d)显示化合物中连接一个异丁酰基，另外13c-nmr谱中δ207.1，δ34.7，δ8.4和1h-nmr中δ3.22(2h,q)，δ1.17(3h,t)表示该化合物连接另一个基团为丙酰基。
该化合物的hmbc谱如图6所示，从hmbc谱中可知，δ1.20(h—9)与δ36.6(c-8)，δ18.7(c-10)，δ210.5(c-7)有远程相关；δ1.19(h—10)与δ1.17(h—9)相同；δ4.17(h—8)与δ210.5(c-8)有远程相关；δ3.32(h—1″)与δ110.7(c-1′)，δ107.0(c-3′)，δ110.8(c-1)，δ107.9(c-3)，δ187.6(c-2)，δ173.3(c-6)，δ187.3(c-2′)，δ173.2(c-6′)有远程相关；δ1.47(h—11)与δ25.3(c-12)，δ44.2(c-5)，δ199.8(c-4)，δ173.3(c-6)有远程相关；δ1.55(h—12)与δ1.47(h—11)相同；δ3.22(h—8′)与δ8.4(c-9′)，δ207.1(c-7′)有远程相关；δ1.17(h—9′)与δ34.7(c-8′)，δ207.1(c-7′)有远程相关；δ1.47(h—10′)与δ25.2(c-11′)，δ44.2(c-5′)，δ198.6(c-4′)，δ173.2(c-6′)有远程相关；δ1.47(h—10′)与δ1.55(h—11′)相同。以上数据说明该化合物结构中的异丙基基团连接在羰基碳上，乙基连接在另一个羰基碳上。
综合以上数据，最终确定该化合物为2,5-cyclohexadien-1-one,2-[[2,4-dihydroxy-3,3-dimethyl-6-oxo-5-(1-isobutyl)-1,4-cyclohexadien-1-phenyl]methyl]-3,5-dihydroxy-4,4-dimethyl-6-(1-oxopropyl)，经过scifinder检索，没有发现相关报道，表明此化合物为新化合物，命名为disalbaspidinpb，其结构式如下式所示：
实施例2disalbaspidinpb对真菌的抑制作用
1、实验方法
用接种环轻刮sda培养基表面菌落，使用无菌研磨器将菌丝研碎，将皮肤癣菌悬浮于无菌生理盐水中，调整浊度至0.5麦氏浊度，并用血细胞计数板计数孢子数量及短菌丝数。使菌液浓度为1×103cfu/ml至3×103cfu/ml。即用rpmi-1640液体培养基将0.5麦氏浊度菌液稀释1000倍，并以血细胞计数板计数为准，得接种菌液。使用rpmi-1640液体培养基稀释的香鳞毛蕨单体贮备液(20μg/ml)于96孔板第一列，使用培养基进行横向2倍稀释至第10列，第11列加入100μlrpmi-1640液体培养基，第12列加入200μlrpmi-1640液体培养基。然后再于第1列至第11列加入接种菌液100μl。此时，第1-10列为梯度药物孔，单体浓度为20μg/ml至0.039μg/ml，且各孔中抗菌药物第11列为生长对照孔，第12列为阴性对照孔。将96孔板置于35℃恒温孵育后，以肉眼观察，视相当于生长对照产生了80％生长抑制的药物浓度为mic。在此基础上，吸取mic所在孔及其高浓度的菌液50μl于沙氏培养基上，35℃恒温孵育后，以肉眼观察，以没有出现菌落生长的浓度为mfc。
此外，在每次测定时应进行质量控制，qc株采用近平滑念珠菌(atcc22019)，质控药物为伊曲康唑，在平行操作条件下，qc株的mic应在0.03～0.12μg/ml范围内，如此则视为测定结果有效可信。
各菌株按以上操作平行重复测定三次，计算mic和mfc的几何平均数。
2、实验结果
本实验结果判读参考clsi的m38-a2方案，肉眼观察评分法来判定孔内真菌生长情况，取与生长对照孔相比80％生长抑制所对应的最低药物浓度为mic值，实验结果见表2所示。
表2disalbaspidinpb体外抗皮肤癣菌的作用研究(μg/ml)
实验结果表明，受试菌对disalbaspidinpb的敏感程度为：犬小孢子菌＞石膏样小孢子菌＞红色毛癣菌。disalbaspidinpb单体对红色毛癣菌具有较强的抑制作用，效果优于阳性对照伊曲康唑和盐酸特比萘芬；对于犬小孢子菌，disalbaspidinpb的效果优于阳性对照药盐酸特比萘芬；而对于石膏样小孢子菌，disalbaspidinpb表现出比伊曲康唑要强的抑菌活性。
实施例3disalbaspidinpb对细菌的抑制作用
1、实验方法
测试方法：采用微量稀释法，此方法常用于测定敏感性药物或新药对人致病菌的抑菌活性试验，操作方法简便，可用于大数量的抑菌试验。使用营养肉汤培养基，将活化好的临床致病菌株接种到培养基内配置成菌液，待测药品用dmso溶解配成64mg/ml。将待测药品在96孔板中用二倍浓度递减稀释的方法进行逐行稀释；然后再加入已稀释的菌液，留出两孔作为对照，一孔只加培养基，而另一孔只加菌液，稀释完毕后震荡混合均匀，再将96孔板放置于35℃恒温培养箱中培养18-24h，以肉眼未见细菌生长的最低浓度作为最小抑制浓度mic值。
阳性对照选用万古霉素、莫匹罗星、红霉素。根据美国临床和实验室标准协会(clsi)制定的m07-a9方案进行微量稀释法。试验方法如下：用生理盐水冲洗固体斜面培养基上面的菌落，得到菌悬液，并调整至0.5号麦氏浊度(1.5×108cfu/ml)。再用camhb将上述菌悬液浓度调节至1.0×106cfu/ml，得到试验菌悬液。用camhb培养基将药物储备液稀释至特定浓度，加200μl药液于96孔板第一列，用培养基横向2倍稀释至第10列，第11列加入100μl培养基，第12列加入200μl培养基。再往第1至11列加入100μl上述菌液。此时，第1到第10列为梯度药物孔，第11列作为生长对照孔，第12列为空白对照孔。将96孔板放置于恒温培养箱中，在35℃恒温箱中培养18h-24h后读取抑菌的结果，以肉眼看不见细菌生长的最低药物浓度的孔作为最低抑菌浓度(mic)。每组实验平行重复测定三次。
此外，每次测定时，应采用质量控制，qc株采用金黄色葡萄球菌(
2、实验结果
实验结果见表3所示，抗菌结果表明，受试菌对disalbaspidinpb的敏感程度为：金黄色葡萄球菌＞溶血性葡萄球菌＞表皮葡萄球菌＞耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。disalbaspidinpb对四株临床致病菌的最小抑菌浓度分别为15.83、23.33、11.67和56.67μg/ml，效果均强于其阳性对照红霉素。对于溶血性葡萄球菌和表皮葡萄球菌，disalbaspidinpb的作用强于莫匹罗星；而对于金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，disalbaspidinpb的作用与莫匹罗星接近。
表3disalbaspidinpb对细菌的mic值(μg/ml)
注：sha-1为溶血性葡萄球菌，sep-2为表皮葡萄球菌，sua-3为金黄色葡萄球菌，mrsa-4为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种香鳞毛蕨化合物disalbaspidinpb，其特征在于，其结构式如下所示：
2.权利要求1所述化合物disalbaspidinpb在制备抗细菌药物中的应用。
3.权利要求1所述化合物disalbaspidinpb在制备抗真菌药物中的应用。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述真菌为皮肤癣菌。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述皮肤癣菌为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌或红色毛癣菌。
7.一种抗真菌的药物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物disalbaspidinpb。
8.一种抗皮肤癣菌的药物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物disalbaspidinpb。
9.一种抗细菌的药物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物disalbaspidinpb。
10.香鳞毛蕨在制备权利要求1所述化合物disalbaspidinpb中的应用。
技术总结