本发明属中药提取分离领域，涉及一类双查尔酮类化合物及其制备方法，以及这类化合物作为人羧酸酯酶2抑制剂，在辅助伊立替康进行抗癌治疗中的应用。
背景技术：
盐酸伊立替康是用来治疗转移性结直肠癌、小细胞肺癌等实体肿瘤的一线药物，但在临床使用的过程中发现其会引起严重的不良反应——嗜中性白血球减少和迟发型腹泻。目前临床上一般通过服用易蒙停(盐酸洛哌丁胺，loperamide)来减缓cpt-11所导致的腹泻，但由于洛哌丁胺同时还能作用于阿片受体，服用过量可能出现肠梗阻、嗜睡、便秘、肌肉紧张、瞳孔缩小、呼吸徐缓等外周及中枢神经系统的中毒症状，因此常有治疗失败以及高剂量下引发毒副反应的案例。
研究表明伊立替康引起不良反应的机理与羧酸酯酶密切相关，抑制羧酸酯酶2的活性能够有效缓解癌症患者在使用伊立替康治疗过程中产生的腹泻等症状，因此寻找羧酸酯酶2的抑制剂，对于使用伊立替康进行抗癌治疗的患者具有重要的意义。
甘草是一种化学成分复杂、药理作用多样的传统中药，含有大量的药效活性成分。黄酮类化合物是甘草中的一类主要活性成分，目前从甘草中分离出的黄酮类化合物超过300个，其结构类型多样，几乎包含了除花青素外的所有黄酮小类。甘草黄酮类成分在抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗血小板凝集等方面作用显著。
我们在活性筛选过程中发现，甘草黄酮可以显著抑制羧酸酯酶2的活性，具用良好的辅助癌症治疗的应用前景。但由于甘草化学组成极其复杂，所含化合物多达数百种，给甘草中活性化合物的寻找带来了巨大的困难，因此如何能够快速准确的分离鉴定到活性化合物是近年来国内外学者不断探索的热点问题。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一类具有双查尔酮结构的化合物。
一种双查尔酮类衍生物，其具有通式(ⅰ)所示结构：
其中r1-r14各自独立的为h-，oh-，cn-，硝基，卤素，取代或未取代的c1-10烷基，取代或未取代的c3-10烯基，-o-pg，其中pg指的是氧保护基。
优选的，pg选自取代或未取代的c1-10烷基、-cor’、-coar，其中r’独立地为取代或未取代的c1-10烷基，ar独立地为取代或未取代的苯基。
上述“取代或未取代的c1-10烷基”指的是任选地被一个或多个取代基所取代的c1-10烷基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、-nh-(c1-10烷基)、-n(c1-10烷基)(c1-10烷基)、c2-4烯基、c2-4炔基、-cn、-cf3、卤素、苯基、或苯氧基。优选的，“取代或未取代的c1-10烷基”指的是任选地被一个或多个取代基所取代的c1-10烷基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、烯基、炔基、-f、-cl、-br、苯基、或苯氧基。
上述“取代或未取代的c3-10烯基”指的是任选地被一个或多个取代基所取代的c3-10烯基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、卤素、苯基、或苯氧基。优选的，“取代或未取代的c3-10烯基”指的是任选地被一个或多个取代基所取代的c3-10烯基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、-f、-cl、-br、苯基、或苯氧基。
上述“取代或未取代的苯基”指的是任选地被一个或多个取代基取代的苯基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷基、c1-10烷氧基、-nh-(c1-10烷基)、-n(c1-10烷基)(c1-10烷基)、c2-4烯基、-cn、卤素、或-cf3。优选的，“取代或未取代的苯基”指的是任选地被一个或多个取代基取代的苯基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷基、c1-10烷氧基、烯基、-cn、-f、-cl、-br、或-cf3。
优选的，本发明的双查尔酮类化合物为下式1-20所示的化合物：
本发明的双查尔酮类化合物，既可从豆科甘草属植物中提取分离得到，也可从廉价的原料合成得到。
本发明的另一目的是提供一种从甘草中分离得到双查尔酮类化合物的方法，包含以下步骤：
1)以豆科甘草属植物的干燥根茎为原料，粉碎后按料液比1:5～1:20加入体积分数为30％-80％的甲醇或乙醇超声或回流提取2-5次，合并提取液，减压回收溶剂，蒸干得到浸膏，浸膏重新溶解于体积分数为30％-80％的甲醇或乙醇中，得到提取浓缩液；
2)按提取浓缩液1-4倍体积加入乙酸乙酯或正庚烷萃取2-5次，将有机溶剂层合并后，减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物；；
3)将步骤2)得到的乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱法，反相高效液相色谱法，亲水高效液相色谱法中的两种或三种方式组合进行分离，即得到甘草中双查尔酮类化合物。
步骤3)中正相硅胶柱色谱法为常压或加压柱色谱，填料为正相硅胶，采用二氯甲烷：甲醇(100:0～0:100)或石油醚：乙酸乙酯(100:0～0:100)为洗脱剂，进行梯度洗脱。
步骤3)中反相高效液相色谱法为制备型或半制备型高效液相色谱法，填料为反相c18硅胶，用乙腈或甲醇梯度洗脱，梯度为0-120min，5％-95％的乙腈或甲醇，其余为0.1％甲酸/水溶液。
步骤3)中亲水高效液相色谱法为制备型或半制备型高效液相色谱法，填料为clickxion、unitarydiol或xamide中的一种，用乙醇或甲醇梯度洗脱，梯度为0-5min，5％-30％的乙醇或甲醇，5-40min，30％-50％的乙醇或甲醇，40-60min，50％-95％的乙醇或甲醇，其余为水。
本发明具有如下有益效果：
本发明的又一目的在于提供双查尔酮类化合物在作为人羧酸酯酶2抑制剂方面的活性，所述双查尔酮类化合物可以作为伊立替康的辅助用药，缓解伊立替康导致的严重副反应。
本发明中，分离双查尔酮类化合物的方法目标明确、效率高，得到的化合物结构新颖，且具有良好的抑制羧酸酯酶2活性的作用，在作为抗癌药物的辅助用药方面前景良好。
附图说明
图1为化合物6的1h-nmr光谱图
图2为化合物6的13c-nmr光谱图
图3为化合物15的1h-nmr光谱图
图4为化合物15的13c-nmr光谱图
图5为化合物6和化合物15的人羧酸酯酶2抑制活性筛选结果
本发明中，术语“烷基”本身或作为其它基团的一部分，指的是直链或支链的脂肪族碳氢化合物。
本发明中，术语“烯基”本身或作为其它基团的一部分，指的是支链或直链的含有一个或两个双键的取代基，其中，双键可以位于取代基链内或链端。
本发明中，术语“烷氧基”优选地表示具有1到10个碳原子，通过氧原子键连的直链或支链烷基c1-10。
本发明中，术语“卤素”表示-f、-cl、-br和-i。
本发明中，术语“任选被取代”或类似表达方式，例如任选被取代的烷基、任选被取代的烯基、任选被取代的苯基、以及任选被取代的杂环芳基，指的是其所修饰基团可以是取代或未取代的。一般来说，术语“取代”意指基团(例如，碳或氮原子)上至少一个氢被取代基取代。除非另有所指，当一个给定结构中有超过一个位点被取代，在每一个位点的取代基可以是相同的或不同的。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：化合物6和化合物15的制备
取甘草的干燥根茎10kg，粉碎后加入体积分数为50％的甲醇回流提取3次，每次两小时，每次提取溶剂用量为药材量的10、8、6倍，合并提取液，减压回收溶剂，蒸干得到浸膏，将浸膏重新溶解于体积分数为50％的甲醇中，得到提取浓缩液；按提取浓缩液2倍体积加入正庚烷萃取3次，将有机溶剂层合并后，减压浓缩至干，得到正庚烷萃取物；将正庚烷萃取物经正相硅胶柱色谱分离，用体积比50:1-1:1的二氯甲烷：甲醇进行梯度洗脱，将体积比20:1洗脱下来的馏分合并，浓缩后经制备型反相高效液相色谱法分离，梯度为0-120min，5％-95％的甲醇，其余为0.1％甲酸/水溶液，收集55min-60min段的洗脱液，即得到含有化合物6和化合物15的馏分，再经一步半制备型亲水高效液相色谱分离，填料为clickxion，梯度为0-5min，5％-30％的乙醇，5-40min，30％-50％的乙醇，40-60min，50％-95％的乙醇，其余为水，收集36-37min的洗脱液，减压干燥后得到化合物6，收集39-40min的洗脱液，减压干燥后得到化合物15。
上述两个化合物具有下述理化性质及波谱学特征：
化合物6：淡黄色粉末，esi-msm/z：706.2797，正离子模式。
化合物15：淡黄色粉末，esi-msm/z：706.2788，正离子模式。
化合物6和化合物15的核磁数据见表一和表二。
表一
表二
实施例二：活性筛选实验
将化合物6和化合物15分别与人羧酸酯酶2混合，于37℃振荡孵育20min，加入探针底物起始反应，于37℃振荡孵育40min后加入等体积乙腈，剧烈震荡后终止反应。将96孔板置于荧光酶标仪上进行荧光检测(ex＝308nm，em＝392，528nm)，计算荧光强度，根据化合物6和化合物15在528nm下的荧光强度与392nm下荧光强度的比值与dmso组的荧光强度比值计算人羧酸酯酶2的抑制强度(图5)。
化合物6和化合物15均对人羧酸酯酶2显示出较强的抑制活性(残余活性<20％)，在辅助癌症治疗方面具有良好的应用前景。
上述仅为本发明专利的优选实施例而已，并不对本发明专利起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明专利的技术方案的范围内，对本发明专利揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明专利的技术方案的内容，仍属于本发明专利的保护范围之内。
1.一种双查尔酮类化合物，其具有通式(ⅰ)所示结构：
其中r1-r14各自独立的为h-，oh-，cn-，硝基，卤素，取代或未取代的c1-10烷基，取代或未取代的c3-10烯基，-o-pg，其中pg指的是氧保护基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述pg选自取代或未取代的c1-10烷基、-cor’、-coar；所述r’独立地为取代或未取代的c1-10烷基；所述ar为取代或未取代的苯基；所述取代或未取代的苯基指的是任选地被一个或多个取代基取代的苯基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷基、c1-10烷氧基、-nh-(c1-10烷基)、-n(c1-10烷基)(c1-10烷基)、c2-4烯基、-cn、卤素、或-cf3；优选的每个取代基可以独立地为c1-10烷基、c1-10烷氧基、烯基、-cn、-f、-cl、-br、或-cf3。
3.根据权利要求1-2任一所述的化合物，其特征在于：所述“取代或未取代的c1-10烷基”指的是任选地被一个或多个取代基所取代的c1-10烷基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、-nh-(c1-10烷基)、-n(c1-10烷基)(c1-10烷基)、c2-4烯基、c2-4炔基、-cn、-cf3、卤素、苯基、或苯氧基；优选的每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、烯基、炔基、-f、-cl、-br、苯基、或苯氧基。
4.根据权利要求1-2任一所述的化合物，其特征在于：所述“取代或未取代的c3-10烯基”指的是任选地被一个或多个取代基所取代的c3-10烯基，其中每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、卤素、苯基、或苯氧基；优选的每个取代基可以独立地为c1-10烷氧基、-f、-cl、-br、苯基、或苯氧基。
5.按照权利要求1-4中的任一化合物，其特征在于：所述化合物通式(ⅰ)具有下式1-20中的结构：
6.一种如权利要求1-5任一所述的双查尔酮类化合物的制备方法，其特征在于：
1)以豆科甘草属植物的干燥根茎为原料，粉碎后按料液比1:5～1:20加入体积分数为30％-80％的甲醇或乙醇超声或回流提取2-5次，合并提取液，减压回收溶剂，蒸干得到浸膏，浸膏重新溶解于体积分数为30％-80％的甲醇或乙醇中，得到提取浓缩液；
2)按提取浓缩液1-4倍体积加入乙酸乙酯或正庚烷萃取2-5次，将有机溶剂层合并后，减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物；
3)将步骤2)得到的乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱法，反相高效液相色谱法，亲水高效液相色谱法中的两种或三种方式组合进行分离，即得到甘草中双查尔酮类化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述正相硅胶柱色谱法为常压或加压柱色谱，填料为正相硅胶，采用二氯甲烷：甲醇(100:0～0:100)或石油醚：乙酸乙酯(100:0～0:100)为洗脱剂，进行梯度洗脱；所述反相高效液相色谱法为制备型或半制备型高效液相色谱法，填料为反相c18硅胶，用乙腈或甲醇梯度洗脱，梯度为0-120min，5％-95％的乙腈或甲醇，其余为0.1％甲酸/水溶液；所述亲水高效液相色谱法为制备型或半制备型高效液相色谱法，填料为clickxion、unitarydiol或xamide中的一种，用乙醇或甲醇梯度洗脱，梯度为0-5min，5％-30％的乙醇或甲醇，5-40min，30％-50％的乙醇或甲醇，40-60min，50％-95％的乙醇或甲醇，其余为水。
8.由权利要求1-5所述的任一双查尔酮类化合物，与任何药学上可接受的辅料所组成的药物组合物。
9.权利要求1-5所述的任一双查尔酮类化合物或权利要求8所述的组合物在制备羧酸酯酶2抑制剂中的应用。
10.权利要求1-5所述的任一双查尔酮类化合物或权利要求8所述的组合物在一种辅助治疗抗癌药物引起的癌症患者腹泻的药物中的应用。
技术总结