本发明属于医药领域，涉及一种抗新型冠状病毒的萘醌类化合物及其医药用途；更具体的，涉及一种基于天然胡桃醌结构的萘醌类化合物及其在制备抗新型冠状病毒2019-ncov的药物中的用途。
背景技术：
2019新型冠状病毒(2019-ncov)是一种具有包膜的正链单股rna冠状病毒，它可引起急性病毒性肺炎，可在人与人之间传播，对公众健康有非常大的危害。中华人民共和国国家卫生健康委员会将此病毒感染引起的急性呼吸道疾病，定为法定乙类传染病，按照甲类管理(疾病预防控制局，《中华人民共和国国家卫生健康委员会公告》，2020年01月20日)。目前该传染性疾病的临床治疗主要以对症治疗为主，其中糖皮质激素的合理应用最为重要。近期报道的抗新型冠状病毒药物包括克立芝、干扰素及部分传统中药方剂。但这些药物疗效有限，多数缺乏大规模临床实验依据。因此，目前国内外均在积极开展抗新型冠状病毒药物的研究工作。由于目前尚没有理想的动物模型，这些研究主要以体外实验为主。因此，抗2019-ncov病毒药物的研究工作尚处于起步阶段，临床上还没有一个抗2019-ncov病毒的特效药物。因此，研发防治新型冠状病毒的有效药物是医药界面临的一项迫切任务。
理想的抗病毒药物选择性地干扰病毒复制周期中的某个环节，从而抑制其复制过程，但不影响宿主细胞的正常生理功能。新型冠状病毒的3cl水解酶(3c-likeproteinase)在其生命周期中起着至关重要的作用(gruber,c.；steinkellner,g.,wuhancoronavirus2019-ncov-whatwecanfindoutonastructuralbioinformaticslevel.innophoreenzymediscovery23january,2020)，几乎参与了病毒复制过程中所有的蛋白质剪切修饰，同时又通过损伤宿主细胞促进自身繁殖，是抗病毒药物研发的重要靶标(alex,z.,etal.,potential2019-ncov3c-likeproteaseinhibitorsdesignedusinggenerativedeeplearningapproaches.chemrxiv2020)。因此，根据新型冠状病毒的3cl水解酶的晶体结构寻找有效的酶抑制剂，对研发有效的抗新型冠状病毒药物具有重要意义。
天然药物，在我国又被称为中草药，是药物的一个重要组成部分。天然药物发挥生理作用的物质基础是其中的活性成分；从天然药物中分离活性化合物、进行结构修饰和改造是目前药物发现的重要手段。然而，到目前为止，没有任何天然药物活性成分被证实具有明确的抗新型冠状病毒活性。中药青龙衣(胡桃青皮)是胡桃楸(juglansmandshuricamaxim.)未成熟果实的外果皮，可用于疮痈肿毒等“热毒症”的治疗(山东中草药手册编写小组,《山东中草药手册》。第一版；山东省人民出版社:济南,1970年6月)。胡桃醌(juglone)及其衍生物胡桃苷、α-氢化胡桃醌、β-氢化胡桃醌是青龙衣中的主要成份(王海香，胡桃属植物青皮的化学成分及作用机理研究进展.生物质化学工程,2008,42(1):47-52)。其中，胡桃醌作为青龙衣中的活性成分具有抗肿瘤、镇痛、杀虫、抗菌及抗病毒活性(strugstad,m,etal.,asummaryofextraction,properties,andpotentialusesofjuglone:aliteraturereview.j.ecosyst.manage.2012,13,1-16.)，其抗肿瘤作用是近年来的研究热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种基于胡桃醌结构的萘醌类化合物及其制备方法和医药用途。药理学研究结果显示，本发明的萘醌类化合物对2019-ncov病毒3cl蛋白水解酶具有强抑制活性，对病毒的复制有抑制作用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明用活性追踪的方法，对中药青龙衣中的化学成分和药理活性进行了系统的研究，确定胡桃醌为其中的主要活性成分。随后以胡桃醌为先导物进行其结构改造，并测定了胡桃醌及其衍生物的抗新型冠状病毒活性。
第一方面，本发明涉及一种基于胡桃醌结构的萘醌类化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物的结构如式(ⅰ)所示：
作为本发明的一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(ii)所示：
作为本发明的又一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(ⅲ)所示：
作为本发明的又一个实施方案，所述萘醌类化合物结构如式(ⅵ)所示：
第二方面，本发明涉及一种如上述结构ⅰ～ⅵ所述的萘醌类化合物，在制备抗新型冠状病毒2019-ncov药物中的用途。
第三方面，本发明涉及一种如上述结构ⅰ～ⅵ所述的萘醌类化合物，在制备抑制新型冠状病毒2019-ncov3cl水解酶的药物中的用途。
本发明根据目前国内外对2019-ncov冠状病毒的研究现状，以其3cl水解酶为作用靶点。同时，用活性追踪的方法，对中药青龙衣中的化学成分和药理活性进行了系统的研究，确定胡桃醌为其中的主要活性成分。通过化学方法合成胡桃醌及其衍生物。所制备的化合物送上海药物研究所新药筛选中心进行高通量筛选，高通量筛选模型为2019-ncov新型冠状病毒的3cl蛋白水解酶。筛选结果表明：在体外实验中，所合成的萘醌类化合物对3cl水解酶显示了非常强的抑制活性。其中胡桃醌在1μm浓度下，对2019-ncov新型冠状病毒3cl蛋白水解酶的抑制率可达99％。此外，7-甲基胡桃醌、乙酰基胡桃醌及胡桃醌甲醚在1μm浓度下，对于靶蛋白3cl水解酶的抑制率分别为99.6％、100.9％及90.8％，显示了非常强的活性。另外，本专利所述的萘醌类化合物结构明确，其制备方法简便、收率较高。以该类化合物为新药候选物，开发高效低毒的抗2019-ncov新型冠状病毒的外用药、口服药及注射剂等药物具有良好的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本发明化合物的制备方法简便，收率较高且原料易得；
2)体外酶抑制活性实验研究表明，该类化合物对2019-ncov冠状病毒的3cl蛋白水解酶有强抑制活性，具有良好的新药开发前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例涉及一种具有结构式(ii)的5-羟基-1,4-萘醌(ii-1)的制备方法，包括以下步骤：
在250ml三颈瓶内加入75ml30％h2o2，搅拌滴加42ml乙酸酐，滴加中维持反应液温度不超过40℃。滴毕，在40℃搅拌4小时。之后，在剧烈搅拌下向反应液中滴加1,5-二羟基萘(15g,93.7mmol)的100ml甲醇溶液,控制滴加速度使反应溶液温度不超过60℃。滴加完毕后继续搅拌1小时，冷却后倒入冰水中，析出大量棕褐色沉淀，过滤干燥得暗红色固体粉末。采用硅胶柱层析(流动相：乙酸乙酯-石油醚体积比为1：5)进行纯化，得化合物ii-1约6.5g，呈橙红色针晶，收率40％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)：δ11.92(1h,oh),7.65(1h,ar-h),7.63(1h,ar-h),7.27(1h,ar-h),6.95(2h,2×ar-h)。
实施例2
本实施例涉及一种具有结构式(ii)的5-甲氧基-1,4-萘醌(胡桃醌甲醚)(ii-2)的制备方法，包括以下步骤：
将实施例1所述化合物ii-1(3g,17.2mmol)溶于90ml的thf-h2o(2：1)混合溶液中，在搅拌下依次加入四丁基溴化铵(1.6g,5.2mmol)、保险粉(11.2g,64.3mmol)及氢氧化钠(9.6g,240mmol)。加毕，在n2保护下，滴加硫酸二甲酯(10ml,103mmol)。滴加完毕后，于室温反应4h后处理。反应液用乙酸乙酯萃取(80ml×3)，合并有机层；有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。残留物经硅胶柱色谱(流动相为乙酸乙酯-石油醚，体积比1：5)纯化，得白色晶体粉末3.3g。将该白色晶体粉末于二氯甲烷-乙腈(3:1，v/v)中溶解，溶液冷却至5℃左右，搅拌下滴入2.5倍当量硝酸铈铵的水溶液，继续搅拌至反应原料消失，二氯甲烷萃取。有机层经饱和氯化钠溶液清洗，无水硫酸钠干燥后蒸干，硅胶柱层析纯化。产物ii-2呈橙色结晶，总收率74％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.74(dd,j＝7.6,1.2hz,1h),7.69(dd,j＝7.6,8.2hz,1h),7.32(dd,j＝8.2,1.2hz,1h),6.87(s,2h),4.02(s,3h,och3)。
实施例3
本实施例涉及一种具有结构式(ⅲ)的5-乙酰氧基-1,4-萘醌(5-乙酰基胡桃醌)(ⅲ-1)的制备方法，包括以下步骤：
将实施例1所述化合物ii-1(3g,17.2mmol)溶于10ml乙酸酐中，在搅拌下滴加5滴浓硫酸。将反应液置于冰水浴中搅拌反应2小时。后将反应液抽滤，依次用冰水及少量甲醇清洗，得化合物ⅲ-1约3.4g，呈淡黄色粉末结晶，收率91％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.05(dd,j＝7.9,1.0hz,1h),7.77(t,j＝7.9hz,1h),7.40(dd,j＝7.9,1.0hz,1h),6.95(d,j＝10.3hz,1h),6.85(d,j＝10.3hz,1h),2.45(s,3h,ch3co)。
实施例4
本实施例涉及一种具有结构式(ⅵ)的7-甲基-5-羟基-1,4-萘醌(7-甲基胡桃醌)(ⅵ-1)的制备方法，包括以下步骤：
本实施例步骤采用国家发明专利(申请号cn201911006433)的方法制备，以2,5-二甲氧基苯甲醛及丁二酸二乙酯为原料，产物ⅵ-1呈橙黄色粉末，总收率37％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ11.84(s,1h,oh),7.43(s,1h),7.07(s,1h),6.90(s,2h),2.43(s,3h,ch3)。
实施例5
实施例1至实施例4的萘醌类化合物对2019-ncov冠状病毒的3cl水解酶抑制活性测定。
实验原理：
3cl水解酶抑制活性测定，采用上海药物研究所和上海科技大学免疫化学研究所抗2019-ncov病毒感染联合应急攻关团队所建立的酶学测试方法。利用高通量药物筛选平台配备的96道自动加样系统，将用真核系统表达的3cl水解酶、其特征的寡肽底物(寡肽底物通过酰胺键与荧光基团连接)及待测化合物置于孵育体系中。测定中设置不含有抑制剂的空白对照组，并采用紫草素为阳性对照药物；每个抑制剂在孵育体系中的终浓度为1μmol/l，并设定3个复孔。测定中根据每孔中底物水解后的荧光强度，计算抑制率。
实验方法：
具体实验方法是将293a细胞按0.5*105个/孔浓度接种于96孔板，并于培养18～20h后进行质粒转染。每孔按3cl蛋白质粒pcdna4-3c∶pcdna3-myfp为50ng∶100ng的比例转染293a细胞，4h后更换分别含溶剂dmso、1μmol/l的待测小分子化合物或10μmol/l紫草素的新鲜培养液，每个浓度设定3个复孔。72h后倒弃培养基，用pbs洗2次，应用perkinelmerenvision多功能酶标仪，在激发波长ex(500nm)、发射波长em(535nm)下检测每孔的荧光强度，并记录分析。
细胞抑制率计算：
抑制率＝(对照组平均荧光值－给药组平均荧光值)/对照组平均荧光值，测定结果如表1所示。
表1目标化合物抑制3cl酶的抑制率
阳性对照物紫草素，为已报道的对新型冠状病毒3cl水解酶具有抑制活性的化合物，可能用于新型冠状病毒的治疗。“非典”时期的临床研究表明，口服紫草素及其衍生物，对sars病毒感染早期的患者有显著疗效(wang,f.,methodoftreatmentofvirusinfectionsusingshikonincompounds.uspatent,no.7897640)。本发明所述萘醌类化合物较阳性对照物紫草素显示了更强的3cl水解酶抑制活性，有良好的应用前景。
综上所述，本发明中的萘醌类化合物，其制备方法简便、原料易得且收率较高。体外测定结果表明，该类化合物对2019-ncov新型冠状病毒的3cl水解酶有非常强的抑制活性。可使用本发明中的萘醌类化合物，制备抗新型冠状病毒的口服、注射药物或复方药物。该药物或复方药物可抑制新型冠状病毒的3cl水解酶，进而抑制其在宿主细胞内的复制过程，用于新型冠状病毒感染的治疗。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
1.一种基于胡桃醌结构的萘醌类化合物，其特征在于，所述萘醌类化合物的结构如式(ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的基于胡桃醌结构的萘醌类化合物，在制备抑制新型冠状病毒2019-ncov3cl水解酶的药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(ⅱ)所示：
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(ⅲ)所示：
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(ⅵ)所示：
6.一种如权利要求1所述的基于胡桃醌结构的萘醌类化合物，在制备抗新型冠状病毒2019-ncov药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(ⅱ)所示：
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(ⅲ)所示：
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述萘醌类化合物结构如式(ⅵ)所示：
