本发明属于天然药物化学领域，涉及一种新化合物太行崖柏酸a及其制备方法和作为grr35激动剂的相关应用
背景技术：
太行崖柏是柏科侧柏属植物，主要分布在太行山脉一带。虽未将其归属于崖柏属，但其生长环境与植物学上的崖柏很相似，都生长于海拔较高的悬崖峭壁上。独特的地理环境与气候使得其外观以及内在成分都与普通的侧柏大有差别。由于崖柏是濒临灭绝得植物，在获得上较为困难，但其在本草纲目中有记载，具有特殊的药理作用。因此，针对与崖柏极其相近的太行崖柏进行研究，有望找到与崖柏相似的药效分子。目前有关太行崖柏化学成分极其药理作用的报道几乎没有。从太行崖柏中分离获得一些结构新颖的化学成分，对其物质基础进行阐明，并进一步深入研究其作用机制，将对天然单体化合物的临床应用提供重要的导向。
gpr35受体是g蛋白偶联受体家族中的1个孤儿受体[1](genomics47,310–3131998)，主要在胰腺，结肠，脾脏和小肠等组织中表达。研究表明gpr35受体与疼痛、炎症和肿瘤等疾病相关(trendsinpharmacologicalsciences,may2011,vol.32,no.5)。随着无标记细胞靶点药理学技术的发展，更多的gpr35受体激动剂被发现，其中包括犬尿喹啉酸、磷酸二酯酶-5抑制剂、敏喘宁、2-油酰lpa和各种酪氨酸代谢产物包括迷迭香酸、5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(dhica)。然而大部分配体基于gpr35受体活性都不是很高，因此，寻找gpr35的高效配体对研究gpr35的生理学及生物学功能有着极其重要的意义，这将为化合物的新临床应用提供导向。
技术实现要素：
本发明提供了一种新的有机酸化合物，或其晶型、或其手性异构体、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，其结构通式(a)如下：
其中：
r1～r8分别独立地选自为氢、卤素、羟基、烷氧基、糖基、c1～c6的烷基、c1～c6的烯基等。
进一步地，r1、r7选自氢或羟基。
进一步地，r2、r3选自甲基，所述式(a)化合物如式(b)所示
进一步地，r4、r6、r8均为氢。
进一步地，r5选自羧基，所述式(b)化合物如式(ⅰ)所示
本发明还提供一种制备上述化合物(ⅰ)的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)药材提取：太行崖柏刨花状药材1公斤～20公斤，加入10升～30升纯水,30℃～90℃加热回流提取1～3小时，趁热滤过，再重复提取1～3次，趁热过滤，合并滤液得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液采用c18ye填料(5～60um)的反相柱进行分离纯化，采用体积比为0～100：90～10的乙醇/水溶液洗脱，得到馏分f1～f6；
(3)将步骤(2)所得子馏分f1经过反相制备级hplc制备，色谱柱为常规c18固定相(5～60μm，20×250～50×250mm)，流动相a为(0％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～50分钟，5％a～95％a，共得到11个子馏分，分别为f1-1～f1-11；
(4)将步骤(3)所得子馏分f1-11经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～30分钟，95％a～10％a，得到式ⅰ化合物，命名为太行崖柏酸a。
本发明中：所述糖基是指包括但不限于葡萄糖基、葡萄糖醛酸基、甘露糖基、半乳糖基、阿洛糖基、果糖基、山梨糖基、夫糖基、鼠李糖基、鸡纳糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、木糖基、核糖基，以及由上述单糖所形成的的各种二糖基及多糖基；所述c1～c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基；c1～c6的烯基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烯基，具有1～6个双键的直链或支链的烯基。
本发明的另一个目的是，提供一种新小分子酸化合物，或其晶型、或其异构体或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物作为活性成分，或由所述的任一种或几种作为gpr35激动剂的药物组合物在制备预防和/或治疗疼痛、炎症和肿瘤等相关疾病药物中的应用。
所述疾病包括但不限于疼痛、炎症和肿瘤等。所述与gpr35受体相关疾病包括但不限于糖尿病、高血压、心力衰竭、冠状动脉疾病、哮喘、疼痛、早发性炎症性疾病、炎症、和癌症等。
所述疼痛疾病包括但不限于创伤性疼痛、、神经病理性疼痛、癌痛、精神(心理性)疼痛，优选的为炎性疼痛、癌痛；所述炎症疾病包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)，优选的为肠炎、病毒性肝炎、中毒性心肌炎、流行性乙型脑炎；所述肿瘤疾病包括但不限于结肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等。
所述药物组合物是指本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。本发明中药物组合物中活性成分(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，活性化合物的剂量或浓度在一个较宽的范围内调节，活性化合物的含量范围为药物组合物的1％～90％。
显然，根据本发明的上述内容，按照本科领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1化合物的制备流程图
图2化合物ⅰ的esi-一级质谱图
图3化合物ⅰ的1hnmr谱图
图4化合物ⅰ的13cnmr谱图
图5化合物ⅰ的h，h-cosy和hmbc相关
图6经不同浓度的化合物ⅰ作用于ht-29细胞的剂量响应曲线
图7经化合物预处理ht-29细胞1h之后，1μm的敏喘宁在ht-29细胞上的剂量响应曲线
图8经不同浓度ml145预处理10min后，化合物在ht-29细胞上的剂量响应曲线
图9化合物i的结构式
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明而不是本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。
本发明式(ⅰ)化合物的制备实施例：
化合物制备
太行崖柏药材50公斤，由河北云璟生物科技有限公司提供
(1)药材提取：太行崖柏刨花状药材5kg，按体积比1:10，加入纯水,90℃加热回流提取1.5小时，趁热滤过，再重复提取1次，趁热过滤，合并2次滤液得浓缩液
(2)将步骤(1)所得浓缩液采用反相制备柱(c18ye填料，60um)进行粗分，依次用体积比10：90、60:40、50:50、90:10的乙醇-水洗脱，分别得到馏分f1、f2、f3、f4
(3)将步骤(2)所得子馏分f1经过反相制备级hplc制备(10μm，20×250mm，常规c18色谱柱)，流速20ml/min，流动相为乙腈和水(含1％甲酸)，洗脱梯度为0min～10min，10％～20％乙腈；10min～40min，20％～50％乙腈；40min～50min，50％～90％乙腈，共得到11个子馏分，分别为f1-1～f1-11
(4)将步骤(3)所得子馏分f1-11经过制备级hplc制备(5μm，10×250mm，亲水型色谱柱)，使用流速3ml/min，80％的乙腈(含0.1％甲酸)等度洗脱，得到式ⅰ化合物：太行崖柏酸a
(5)化合物信息如下：
化合物ⅰ：3.3mg，c10h12o4，mw：196，白色粉末，溶于甲醇
1h-nmr(cd3od,600mhz)δ7.30(1h,s,h-2)，7.18(1h,s,h-4)，7.65(1h,s,h-6)，δ1.54(3h,s,h-8)，δ1.54(3h,s,h-9)
活性试验实施例：
材料上述制备的新化合物；ht-29细胞购于中国科学院上海细胞库；敏喘宁购于sigma公司。检测平台为康宁第三代
材料上述制备的新化合物；ht-29细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；敏喘宁购于sigma公司。检测平台为康宁第三代
将处于对数生长期的ht-29细胞，接种于384孔的细胞板的不同孔中，每孔的培养液体积为40μl，接种密度为3.0×104个/孔，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20-22h，至细胞融合度达95％左右，ht-29细胞进行活性实验。
通过激动、脱敏和拮抗三个角度去验证其gpr35受体激动活性。
首先是激动分析，将化合物浓度梯度为(100μm,100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm,1.563μm,0.781μm,0.391μm,0.195μm,0.098μm,0.049μm,0.024μm)作用于ht-29细胞，结果如图6所示，化合物的剂量响应曲线是单相“s”型，并且达到饱和响应，对应的ec50值分别为4.25±0.11μm。
然后使用脱敏分析的方法验证化合物作用于gpr35受体的特异性。不同浓度的化合物(浓度梯度为100μm,100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm,1.563μm,0.781μm,0.391μm,0.195μm,0.098μm,0.049μm,0.024μm)预处理ht-29细胞1h之后，再加入1μm的敏喘宁继续监测1h，结果如图7所示，化合物对gpr35受体激动剂敏喘宁的脱敏呈现剂量依赖性。而且化合物能在高浓度时将敏喘宁的dmr响应信号脱敏至最小，对应的ic50值为6.95±0.43μm。
最后使用拮抗分析方法验证化合物作用于gpr35受体的特异性。ht-29细胞经gpr35受体的拮抗剂ml145预处理10min之后，ml145的浓度梯度为32μm,16μm,8μm,4μm,2μm,1μm,0.5μm,0.25μm,0.125μm,0.063μm,0.031μm,0.016μm,0.008μm,0.004μm，再加入浓度为ec80的化合物，结果如图8所示。高浓度的ml145能够完全抑制化合物的dmr响应信号，其ic50值为0.33±0.02μm，由此可见该化合物是gpr35激动剂。
通过激动分析、脱敏分析和拮抗分析三个实验表明gpr35受体是化合物的作用靶点。
目前的研究表明gpr35受体与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，根据靶点与疾病的关联关系，可拓宽该有机酸化合物的临床应用范围。
1.一种有机酸化合物，其结构通式如式(a)所示；所述通式(a)为有机酸化合物，或其晶型、或其异构体、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物；
其中：
r1～r8分别独立地选自为氢、卤素、羟基、烷氧基、c1～c6的烷基、c1～c6的烯基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：r1、r7选自氢或羟基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：r2、r3选自甲基，所述式(a)化合物如式(b)所示
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于r4、r6、r8均为氢；
r5选自羧基，所述式(b)化合物如式(i)所示
5.一种制备权利要求4所述的化合物的方法，其特征在于：所述化合物(i)的制备方法包括以下步骤：
(1)药材提取：太行崖柏刨花状药材1公斤～20公斤，加入10升～30升纯水,30℃～90℃加热回流提取1～3小时，趁热滤过，再重复提取1～3次，趁热过滤，合并滤液得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液采用c18ye填料(5～60um)的反相柱进行分离纯化，采用体积比为0～100：90～10的乙醇/水溶液洗脱，得到馏分f1～f6；
(3)将步骤(2)所得子馏分f1经过反相制备级hplc制备，色谱柱为常规c18固定相(5～60μm，20×250～50×250mm)，流动相a为(0％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～50分钟，5％a～95％a，共得到11个子馏分，分别为f1-1～f1-11；
(4)将步骤(3)所得子馏分f1-11经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～30分钟，95％a～50％a，得到式(i)化合物，命名为太行崖柏酸a。
6.权利要求1～4任一项所述化合物，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备预防和/或治疗糖尿病、高血压、心力衰竭、冠状动脉疾病、哮喘、疼痛、代谢综合症、炎症和癌症等相关疾病药物中的应用。
7.一种药物组合物，其特征在于：权利要求1～4任一项所述化合物，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
技术总结