本发明属于天然药物化学领域，涉及一类戊酸甲酯衍生物的制备方法及其在制备抗菌药物中的应用。
背景技术：
在过去近一个世纪的时间里，抗生素持续使用且具有超强的效果，可以被称得上是人类医药史上最成功的药物之一。然而，由于抗生素的大量持续使用、各种细菌本身固有的耐药基因及其横向传播，越来越多的致病菌对常用抗菌药物产生了耐药性，从而造成现有抗菌药物的治疗效果大大降低，甚至产生了对多种类型抗菌药物均有耐药性的“超级细菌”。与此同时，与二十世纪五六十年代大量抗菌药物集中上市相比，新世纪以来上市的新骨架类型抗生素只有达托霉素类环脂肽；近年来新上市的抗菌药物屈指可数，而且往往在上市短短几个月即发现有新的耐药菌株出现，人类有可能面临着无有效抗生素可用的后抗生素时代的到来。因此，开发安全高效的新类型抗耐药菌药物是当今药物研发领域的重点攻关方向之一。天然产物的结构多样性和易于与生物大分子结合的特点，决定了其在参与生命生理过程中所具有的无可比拟的优势，赋予了天然产物在新药研发中不可替代的重要地位；天然产物是发现药物先导结构和候选药物的重要来源，许多抗生素类药物都源于天然产物。毛梗豨莶作为一种重要的中药资源，其次级代谢产物已经被报道具有多种结构类型以及多样的生物活性，其中包括抗菌活性。因此，从毛梗豨莶中挖掘具有抗菌活性的代谢产物对于新型抗菌药物的研发具有重要意义。
技术实现要素：
为了进一步发掘毛梗豨莶的药用价值，本发明提供一类从毛梗豨莶中提取的戊酸甲酯衍生物，其具有抗菌活性。
本发明的另一目的是提供一种上述戊酸甲酯类化合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述戊酸甲酯类化合物在治疗感染性疾病方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一类戊酸甲酯衍生物，其结构通式如图1所示。
所述戊酸甲酯类化合物的结构类型属于2,3-双羟基-4-甲基取代的戊酸，且3-位羟基与十一烷酸或十二烷酸成酯。
上述戊酸甲酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）毛梗豨莶干燥地上部位，粉碎后用95%乙醇浸提，浸提液浓缩得到粗浸膏；
（2）粗浸膏悬浮于水中，然后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；
（3）将乙酸乙酯萃取物过mci树脂柱层析，用50%~80%v/v的甲醇-水洗脱得到主要洗脱成分；
（4）将上述mci柱层析洗脱成分过正相硅胶柱层析，依次用100:1、50:1、20:1、8:1、1:1v/v的氯仿-甲醇洗脱，得到5个组分fr.1~fr.5；
（5）将组分fr.2过正相硅胶柱层析，用40:1v/v的石油醚-丙酮洗脱得到组分fr.2.1~fr.2.3；
（6）将组分fr.2.2和fr.2.3经高效液相ymc-packods-a色谱柱，分别用88%v/v的甲醇-水洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为21和22min的组分，得到fr.2.2.1和fr.2.3.1；
（7）将组分fr.2.2.1和fr.2.3.1经高效液相手性mz(2)rh色谱柱，分别用80%和78%v/v的乙腈-水洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为6.7和8.9min的组分，得到上述戊酸甲酯类化合物纯品。
步骤（1）中，所述毛梗豨莶与95%乙醇的料液比为1:2~3（w/v）。
步骤（1）中，所述毛梗豨莶粉碎至粒度直径小于3mm。
步骤（1）中，所述浸提次数为3次，每次时间为7天。
步骤（1）中，所述粗浸膏体积为原体积的1/100~1/150。
步骤（2）中，所述粗浸膏与水的料液比为1:3~4（w/v）。
步骤（2）中，所述乙酸乙酯与水的体积比为1:1~2。
步骤（2）中，所述乙酸乙酯萃取次数为1~3次。
步骤（6）中，流速为2.0ml/min。
步骤（7）中，流速为3.0ml/min。
一类戊酸甲酯衍生物在制备抗菌药物中的应用，所述菌株选自但不限于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。
本发明具有以下优点：一类从毛梗豨莶中提取的戊酸甲酯衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用；该戊酸甲酯类化合物属于2,3-双羟基-4-甲基取代的戊酸，且3-位羟基与十一烷酸或十二烷酸成酯；该类化合物能够明显抑制金黄色葡萄球菌(atcc25923)和枯草芽孢杆菌(atcc633)；本发明提取的化合物为新型抗菌药物的研发提供了物质基础，有利于毛梗豨莶药用价值的进一步开发。
附图说明
图1.一类戊酸甲酯衍生物的结构通式。
图2.2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的高分辨质谱。
图3.2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的氢谱。
图4.2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的碳谱。
图5.2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的氢谱和碳谱数据分析。
图62-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的二维cosy谱。
图7.2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的二维hsqc谱。
图8.2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的二维hmbc谱。
图9.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的高分辨质谱。
图10.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的氢谱。
图11.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的碳谱。
图12.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的氢谱和碳谱数据分析。
图13.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的二维cosy谱。
图14.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的二维hsqc谱。
图15.2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯的二维hmbc谱。
图16.戊酸甲酯类新成分的抗菌活性（mic,μm）。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1：两个戊酸甲酯类化合物的制备。
5kg毛梗豨莶干燥地上部位，粉碎至粒度直径小于3mm，用95%的乙醇浸泡提取3次，每次10l，每次7天；将乙醇提取液合并，减压浓缩得到粗浸膏302g；粗浸膏悬浮于1.0l水中，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次0.5l；合并乙酸乙酯萃取相，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物83g；将该萃取物进行mci树脂柱层析，用甲醇-水（v/v，50%~80%）梯度洗脱，薄层层析检测合并得到主要洗脱样品32g；将该mci柱层析洗脱样品过正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇体系（v/v，100:1、50:1、20:1、8:1、1:1）洗脱，根据薄层层析分析洗脱液成分，收集得到组分fr.1~fr.5；组分fr.2经正相硅胶柱层析，用石油醚-丙酮体系（v/v，40:1）等度洗脱，根据薄层层析分析洗脱液成分，收集得到组分fr.2.1~fr.2.3；组分fr.2.2经高效液相色谱纯化（色谱柱：ymc-packods-a，10×250mm，流速：2.0ml/min，检测波长为210nm），用甲醇-水（v/v，88%）等度洗脱，收集保留时间26min的组分，得到主要含有目标成分的组分fr.2.2.1；组分fr.2.3经高效液相色谱纯化（色谱柱：ymc-packods-a，10×250mm，流速：2.0ml/min，检测波长为210nm），用甲醇-水（v/v，88%）等度洗脱，收集保留时间21min的组分，得到主要含有另一目标成分的组分fr.2.3.1；组分fr.2.2.1经高效液相色谱纯化（手性色谱柱：mz(2)rh，10×250mm，流速：3.0ml/min，检测波长为210nm），用乙腈-水（v/v，78%）等度洗脱，收集保留时间8.9min的组分，得到新成分2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯纯品（43mg），此化合物为无色油状物，易溶于二氯甲烷、氯仿等非极性溶剂，不溶于水，比旋光度[a]d28-3.0(c0.10,meoh)，圆二色谱(meoh)λmax(de)210(-0.18)nm，红外光谱(kbr)nmax3464,2926,2855,1748cm-1；组分fr.2.3.1经高效液相色谱纯化（手性色谱柱：mz(2)rh，10×250mm，流速：3.0ml/min，检测波长为210nm），用乙腈-水（v/v，80%）等度洗脱，收集保留时间6.7min的组分，得到新成分2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯纯品（8.3mg），此化合物为无色油状物，易溶于二氯甲烷、氯仿等非极性溶剂，不溶于水，比旋光度[a]d28-2.0(c0.10,meoh)，圆二色谱(meoh)λmax(de)210(-0.13)nm，红外光谱(kbr)nmax3432,2929,2860,1740cm-1。
实施例2：戊酸甲酯类衍生物新成分的鉴定。
2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯：通过分析高分辨质谱（图2）得到其加钠的准分子离子峰m/z367.2458（[m na] ,理论值367.2455），确定了该新成分的分子式为c19h36o5。红外光谱数据显示该新成分结构中含有羟基（3464cm−1）和酯羰基（3464cm−1）。分析其氢谱（图3），可以明显辨别2个连氧次甲基（δh4.87,dd,j=7.2,4.6hz;4.29,dd,j=6.7,4.6hz）、1个甲氧基（δh3.79,s）、1个脂族次甲基（δh2.17,m）和2个双重峰甲基（均为δh0.94,d,j=6.8hz）；此外1个三重峰甲基（δh0.87,t,j=7.0hz）、1个三重峰亚甲基（δh2.33，tj=7.4）和9个脂族亚甲基（δh1.61（m,2h）及1.22~1.34（m,16h））说明月桂酰基的存在；同时1个活泼氢的的信号（δh3.07,d,j=6.7hz）进一步证明了羟基的存在。进一步分析其碳谱（包括dept谱，图4），总共19个碳可明确判断为2个酯羰基（δc173.8,173.4）、2个连氧次甲基（δc79.1,71.0）、1个甲氧基（δc52.9）、1个脂族次甲基（δc28.5）和10个脂族亚甲基（δc34.4~22.8）。其氢谱（600mhz，cdcl3）和碳谱（150mhz，cdcl3）数据分析见图5，其中a同一列中归属信号可互换。通过进一步解析其二维核磁数据包括1h−1hcosy图谱（图6）、hsqc图谱（图7）和hmbc图谱（图8），则完整无误地确定了该化合物的结构为2-羟基-3-月桂酰氧基-4-甲基戊酸甲酯。通过氢氧化锂碱水解得到2,3-双羟基-4-甲基戊酸，该水解产物与文献中报道的手性合成化合物2s,3s-双羟基-4-甲基戊酸完全一致，从而最终确定了原天然产物的绝对构型。
2-羟基-3-十一烷酰氧基-4-甲基戊酸甲酯：通过分析高分辨质谱（图9）得到其加钠准分子离子峰m/z353.2296（[m na] ,理论值353.2298），确定了该新成分的分子式为c18h34o5，显示比上述同系物少1个亚甲基基团。进一步分析其氢谱（图10）和碳谱（图11）表明，这两个同系物的结构高度相似，尤其是母核戊酸甲酯片段完全一样，唯一区别就是3-位的脂肪酸酯基团在目前的分子中变成了十一烷酸酯，其氢谱（600mhz，cdcl3）和碳谱（150mhz，cdcl3）数据分析见图12，其中b同一列中归属信号可互换。最后其结构通过解析二维核磁数据（图13~15）得到了确定无误的证实；根据二者的圆二色谱数据中柯登效应的一致，绝对构型也被鉴定为一致。
实施例3：戊酸甲酯类新成分的抗菌活性测试。
采用96孔板法对两个新成分进行了抗菌活性测试。分别将staphylococcusaureusatcc25923和bacillussubtilisatcc633接种到lb培养基中于37°c摇床（180rpm）培养24小时，然后通过麦氏比浊法，用lb培养基将培养液的菌种浓度稀释到104–105cfu/ml，接种于96孔板中，每孔包含200μl（包含倍比稀释的待测样品）培养液，并于37°c放置12小时，用肉眼观察化合物显著抑制细菌生长的最低浓度mic值，盘尼西林作为阳性对照。实验结果显示，图1所示的戊酸甲酯类化合物能够明显抑制上述两种革兰氏阳性菌的生长，它们的最小抑菌浓度mic值如图16所示。因此本发明的戊酸甲酯类衍生物能用于制备抗菌药物应用于相关感染性疾病中。
1.一类戊酸甲酯衍生物，其结构通式如图1所示，其中r为(ch2)10ch3或(ch2)9ch3。
2.一类权利要求1所述的戊酸甲酯衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）毛梗豨莶干燥地上部位，粉碎后用95%乙醇浸提，浸提液浓缩得到粗浸膏；
（2）粗浸膏悬浮于水中，然后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；
（3）将乙酸乙酯萃取物过mci树脂柱层析，用50%~85%v/v的甲醇-水洗脱得到主要洗脱成分；
（4）将上述mci树脂柱层析洗脱成分过正相硅胶柱层析，依次用100:1、50:1、20:1、8:1、1:1v/v的氯仿-甲醇洗脱，得到5个组分fr.1~fr.5；
（5）将组分fr.2过正相硅胶柱层析，用40:1v/v的石油醚-丙酮洗脱得到组分fr.2.1~fr.2.3；
（6）将组分fr.2.2和fr.2.3经高效液相ymc-packods-a色谱柱，分别用88%v/v的甲醇-水洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为21和22min的组分，得到fr.2.2.1和fr.2.3.1；
（7）将组分fr.2.2.1和fr.2.3.1经高效液相手性mz(2)rh色谱柱，分别用80%和78%v/v的乙腈-水洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为6.7和8.9min的组分，得到上述戊酸甲酯类化合物纯品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述毛梗豨莶与95%乙醇的料液比为1:2~3（w/v）。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述毛梗豨莶粉碎至粒度直径小于3mm。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述浸提次数为3次，每次时间为7天。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述粗浸膏的体积为原体积的1/100~1/150。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述粗浸膏与水的料液比为1:3~4（w/v）。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙酸乙酯与水的体积比为1:3~4；所述乙酸乙酯萃取次数为1~3次。
9.一类权利要求1所述的戊酸甲酯衍生物在制备抗菌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。
技术总结