本发明涉及利用放线菌次级代谢产物制备活性化合物技术领域，具体涉及一类具有降血脂作用的线性聚酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
高血脂症(hyperlipidemia，hlp)是指以血浆中一种或多种脂类物质水平过高为主要表现的一类疾病，包括胆固醇、甘油三酯、磷脂和非游离脂肪酸等，血脂异常多表现为脂蛋白异常，可直接引起一些危害人类健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、肥胖病等，临床上将血脂异常分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症和低高密度脂蛋白血症。
近年来，随着生活水平的提高，高血脂症患者数量日渐增多。目前临床上用于治疗高血脂症的多为他汀类与贝特类药物，两者均有显著的疗效，但是却具有一定的肝肾毒性与肌肉毒性，长期用药可能会导致不同程度的肝功能受损、横纹肌溶解等症状。因此很有必要去寻找一种更加安全有效的治疗高血脂症的药物。
随着相关技术的不断进步，从放线菌中筛选寻找具有降血脂、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等具有潜在医疗价值的活性化合物变得愈发快速高效，因此希望能通过对优秀放线菌次级代谢产物的挖掘，筛选到治疗高血脂症药物的突出先导化合物。
alpiniamide结构式如下式(1)，于2013年由中国研究人员从链霉菌streptomycessp.yim66017的发酵产物中分离得到，截止目前，尚未有报道从天然产物中发现alpiniamides化合物类似物，也未曾进行相关的活性研究。
技术实现要素：
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一类具有降血脂作用的线性聚酮类化合物，具有用于制备预防或治疗高血脂症药物的潜力。
一类具有降血脂作用的线性聚酮类化合物，结构式分别如下式(i)～(iv)所示：
neoalpiniamidea(式(i)化合物)和neoalpiniamideb(式(ii)化合物)在3位羟基处存在构型变化；neoalpiniamidea(式(i)化合物)和neoalpiniamidec(式(iii)化合物)在11位、13位甲基与12位羟基处存在构型变化；neoalpiniamided(式(iv)化合物)和alpiniamide(式(1)化合物)在11位、13位甲基与12位羟基处存在构型变化。
显然，上述的四个化合物通过确定绝对构型证明了其结构的新颖性，而且均具有从未被发现的降血脂作用而具有创造性。
本发明又提供了一类具有降血脂作用的线性聚酮类化合物的制备方法，包括步骤：
(a)将放线菌活化后接种于高氏一号液体培养基中，摇床恒温震荡培养，获得发酵液；所述放线菌为streptomycesbacillarisstrainatcc15855，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
(b)发酵产物过滤去除菌丝体，经有机溶剂萃取后获得有机萃取液；
(c)将所述有机萃取液浓缩后，得到粗提物并分离纯化获得如式(1)、(i)～(iv)所示线性聚酮类化合物。
作为优选，步骤(a)中，所述放线菌活化的过程包括：
将所述放线菌接种到高氏一号琼脂固体培养基上，于28～30℃恒温培养箱中静置，活化培养3～5天。
作为优选，所述高氏一号琼脂固体培养基的配制包括：
将可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、海盐与水混合均匀，再调节ph值至7.0～7.2。
作为优选，步骤(a)中：
所述高氏一号液体培养基的配制包括：
将可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、海盐与水混合均匀，再调节ph值至7.0～7.2；
所述摇床恒温震荡培养的条件为：28～32℃下，180～200rpm摇床中培养6～10天。
作为优选，步骤(b)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯，经乙酸乙酯萃取后得到的即为乙酸乙酯萃取液。
作为优选，步骤(c)中：
所述浓缩，具体为：
将有机萃取液经减压浓缩除去有机溶剂；
所述分离纯化，具体为：
(a)使用硅胶柱色谱纯化所述粗提物，并用体积比60:1至5:1的二氯甲烷/甲醇体系梯度洗脱，收集含有目标化合物的馏分并合并；
(b)将步骤(a)所得馏分使用凝胶柱色谱纯化，并用甲醇体系洗脱，收集含有目标化合物的馏分并合并；
(c)将步骤(b)所得馏分采用反相高效制备液相色谱分离纯化，分别得到如式(1)、(i)～(iv)所示线性聚酮类化合物。
步骤(a)中，所述硅胶柱色谱纯化使用的填料优选为硅胶。
步骤(b)中，所述凝胶柱色谱纯化使用的填料优选为羟丙基葡聚糖凝胶。
步骤(c)中，所述反相高效制备液相色谱分离纯化使用的填料优选为十八烷基键合硅胶。
本发明制备方法中，可通过分离纯化收集不同洗脱时间的产物即可分别得到式(1)、(i)～(iv)所示的四种化合物。
优选地，检测波长为210nm，流动相为体积浓度39％～59％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱40分钟；
收集13.0～14.0分钟的洗脱液得到如式(i)结构的线性聚酮类化合物neoalpiniamidea；
收集18.5～19.5分钟的洗脱液得到如式(ii)结构的线性聚酮类化合物neoalpiniamideb；
收集28.0～29.0分钟的洗脱液得到如式(1)结构的线性聚酮类化合物alpiniamide。
优选地，检测波长为210nm，流动相为体积浓度30％～100％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱30分钟；
收集14.0～15.0分钟的洗脱液得到如式(iii)结构的线性聚酮类化合物neoalpiniamidec；
收集17.0～18.0分钟的洗脱液得到如式(iv)结构的线性聚酮类化合物neoalpiniamided。
采用上述的制备工艺可以高产率、高纯度的分别获得如式(1)、(i)～(iv)所示的化合物。
为进一步测试本发明的五种线性聚酮类化合物的生物活性，采用hepg2细胞进行体外脂质堆积活性评价试验。
试验表明，本发明分离得到的式(1)、(i)～(iv)的五种化合物均能显著的抑制脂质积累，具有优异的降血脂作用，因此具有用于制备预防或治疗高血脂症药物的潜力。
本发明还提供了一类具有降血脂作用的线性聚酮类化合物在制备预防或治疗高血脂症药物中的应用，所述具有降血脂作用的线性聚酮类化合物的结构式分别如式(1)、(i)～(iv)所示。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明公开了四种全新的具有降血脂作用的线性聚酮类化合物neoalpiniamidesa～d，均可由同一株放线菌通过发酵培养及提纯后得到，其结构为天然产物中首次发现，绝对结构新颖。经活性测试发现，制备得到的alpiniamide化合物以及neoalpiniamidesa～d四个化合物均能显著地抑制脂质积累，可用于制备预防或治疗高血脂症药物。
附图说明
图1为实施例中式(1)化合物以及式(i)～(iv)四种线性聚酮类化合物neoalpiniamidesa～d的降血脂活性的测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
菌种来源
本发明放线菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌streptomycesbacillarisstrainatcc15855。
培养基
高氏一号琼脂固体培养基：以培养基1l计，将可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、海盐25g混合后加水至1l，再调节ph值至7.0～7.2。
高氏一号液体培养基(发酵培养基)：以发酵培养基1l计，将可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、海盐25g混合后加水至1l，再调节ph值至7.0～7.2。
实施例1
1、菌株种子液
(1)从原保存的甘油管取放线菌适量，接种到高氏一号琼脂固体培养基上，于37℃培养箱中静置，活化培养3天。
(2)将步骤(1)中已经活化的放线菌单菌落接种于含有250ml高氏一号液体培养基的500ml锥形瓶中，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养3天，获得种子液。
2、化合物的发酵
以每瓶接种10ml的量将上述种子液接种到发酵培养基中(每瓶中培养基为250ml高氏一号液体培养基，然后经高压湿热灭菌所得)，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养培养7天后终止发酵。
3、化合物的制备
(a)将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯萃取液经旋转蒸发仪减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得到浓缩液；
(b)萃取液浓缩后，使用硅胶柱色谱纯化，填料为硅胶，并用体积比60:1至5:1的二氯甲烷/甲醇体系梯度洗脱，收集含有目标化合物的馏分并合并；
(c)将包含目的化合物的洗脱产物合并后，使用sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，填料为羟丙基葡聚糖凝胶，洗脱剂为甲醇溶液，薄层色谱(tlc)分析合并含有目标化合物的馏分；
(d)所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm))色谱柱，检测波长为210nm，流动相为体积浓度39％～59％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱40分钟，收集13.0～14.0分钟的洗脱液。
将分离纯化得到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hresims计算为c17h29no6(m/z366.1887[m na] )，进一步依据核磁共振数据(表1)，其具体结构如下所示，记为neoalpiniamidea。
该化合物的核磁共振数据列于下表1中，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz，溶剂cdcl3。
表1
实施例2
与实施例1的区别仅在于，化合物的制备步骤(d)中，所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm))色谱柱，检测波长为210nm，流动相为体积浓度39％～59％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱40分钟，收集18.5～19.5分钟的洗脱液。
将分离纯化得到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hresims计算为c17h29no6(m/z366.1887[m na] )，进一步依据核磁共振数据(表2)，其具体结构如下所示，记为neoalpiniamideb。
该化合物的核磁共振数据列于下表2中，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz，溶剂cdcl3。
表2
实施例3
与实施例1的区别仅在于，化合物的制备步骤(d)中，所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm))色谱柱，检测波长为210nm，流动相为体积浓度30％～100％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱40分钟，收集14.0-15.0分钟的洗脱液。
将分离纯化得到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hresims计算为c17h29no6(m/z366.1887[m na] )，进一步依据核磁共振数据(表3)，其具体结构如下所示，记为neoalpiniamidec。
该化合物的核磁共振数据列于下表3中，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz，溶剂cdcl3。
表3
实施例4
与实施例1的区别仅在于，化合物的制备步骤(d)中，所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm))色谱柱，检测波长为210nm，流动相为体积浓度30％～100％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱40分钟，收集17.0-18.0分钟的洗脱液。
将分离纯化得到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hresims计算为c17h29no6(m/z366.1887[m na] )，进一步依据核磁共振数据(表4)，其具体结构如下所示，记为neoalpiniamided。
该化合物的核磁共振数据列于下表4中，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz，溶剂cdcl3。
表4
实施例5
与实施例1的区别仅在于，化合物的制备步骤(d)中，所得含有新化合物的馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm))色谱柱，检测波长为210nm，流动相为体积浓度39％～59％的甲醇-水溶液(含体积浓度0.5‰的三氟乙酸)，以20ml/min进行梯度洗脱40分钟，收集28.0-29.0分钟的洗脱液。
将分离纯化得到的化合物进行结构鉴定，分子式根据高分辨质谱hresims计算为c17h29no6(m/z366.1887[m na] )，进一步依据核磁共振数据(表5)，其具体结构如下所示，记为alpiniamide。
该化合物的核磁共振数据列于下表5中，核磁共振参数1h600mhz，13c150mhz，溶剂cdcl3。
表5
测试例
hepg2细胞体外脂质堆积实验。
取对数期hepg2细胞加入96孔板中(100μl,约10000～15000个细胞每孔)，待70％～80％细胞吸附后，将培养基替换成无血清的mem培养基饥饿处理24h。吸弃培养基，实验分为空白组、模型组、阳性对照组、样品组。空白组仅加入无血清的mem培养基，模型组加入含有油酸(100μm)的无血清的mem培养基，阳性对照组加入含有油酸(100μm)及辛伐他汀(10μm即4.18mg/ml)的无血清的mem培养基，样品组加入含有油酸(100μm)及式(1)、(i)～(iv)样品(10mg/ml)的无血清的mem培养基，继续培养24h后，移除培养基，pbs洗一次，用4％多聚甲醛(80μl，4g多聚甲醛/100mlpbs)固定30分钟后，pbs洗一次，用体积比为60％异丙醇/水处理10分钟后，加入50μl油红工作液(工作液由0.3g/100ml油红/异丙醇的母液与水体积比3:2配制而成)20分钟后，pbs洗三次，异丙醇溶解(70μl)后，在酶标仪520nm波长下测od值。结果见图1(注：与模型组比较，***p<0.001；###p<0.001)。
观察图1可以发现，式(1)、(i)～(iv)的五种化合物可显著抑制hepg2细胞内脂质堆积，都显示与阳性对照辛伐他汀相当的活性，说明式(1)、(i)～(iv)的五种化合物均具有优异的降血脂能力。本发明可为研制新的预防或治疗高血脂症药物提供了新的天然来源的先导化合物，具有很好的开发应用前景。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.一类线性聚酮类化合物，其特征在于，结构式分别如下式(i)～(iv)所示：
2.一类具有降血脂作用的线性聚酮类化合物在制备预防或治疗高血脂症药物中的应用，其特征在于，所述具有降血脂作用的线性聚酮类化合物的结构式分别如下式(1)、(i)～(iv)所示：
3.一种线性聚酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将放线菌活化后接种于高氏一号液体培养基中，摇床恒温震荡培养，获得发酵液；所述放线菌为streptomycesbacillarisstrainatcc15855，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
(b)发酵产物过滤去除菌丝体，经有机溶剂萃取后获得有机萃取液；
(c)将所述有机萃取液浓缩后，得到粗提物并分离纯化获得如式(1)、(i)～(iv)所示线性聚酮类化合物；
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述放线菌活化的过程包括：
将所述放线菌接种到高氏一号琼脂固体培养基上，于28～30℃恒温培养箱中静置，活化培养3～5天；
所述高氏一号琼脂固体培养基的配制包括：
将可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、海盐与水混合均匀，再调节ph值至7.0～7.2。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中：
所述高氏一号液体培养基的配制包括：
将可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、海盐与水混合均匀，再调节ph值至7.0～7.2；
所述摇床恒温震荡培养的条件为：28～32℃下，180～200rpm摇床中培养6～10天。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯，经乙酸乙酯萃取后得到的即为乙酸乙酯萃取液。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中：
所述浓缩，具体为：
将有机萃取液经减压浓缩除去有机溶剂；
所述分离纯化，具体为：
(a)使用硅胶柱色谱纯化所述粗提物，并用体积比60:1至5:1的二氯甲烷/甲醇体系梯度洗脱，收集含有目标化合物的馏分并合并；
(b)将步骤(a)所得馏分使用凝胶柱色谱纯化，并用甲醇体系洗脱，收集含有目标化合物的馏分并合并；
(c)将步骤(b)所得馏分采用反相高效制备液相色谱分离纯化，分别得到如式(1)、(i)～(iv)所示线性聚酮类化合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述硅胶柱色谱纯化使用的填料为硅胶。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述凝胶柱色谱纯化使用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述反相高效制备液相色谱分离纯化使用的填料为十八烷基键合硅胶。
技术总结