本发明涉及多肽合成
技术领域：
，具体涉及一种多肽抗原maps的制备方法。
背景技术：
：常用的疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。目前的亚单位疫苗多是采用重组dna技术用微生物或哺乳动物细胞产生。但分子量较小的抗原很难用重组dna技术制备，化学合成便成为较为简便的途径。合成肽疫苗是根据抗原的氨基酸序列设计的用化学方法合成的一种安全性很高的疫苗，但其分子量小、免疫原性弱并且仅针对单一的抗原表位，这使其应用受到限制。将合成肽疫苗与其它载体蛋白偶联虽然能提高前者免疫原性，但因为引入了无关蛋白，无法估计其对目标抗原肽结构的影响，所以效果仍不理想。分支状多抗原肽系统通常是指利用赖氨酸(lys)的两个氨基分别能与另一个氨基酸的羧基形成肽键这一特征，以数个lys(n)作为核心。将多条相同或不相同的抗原肽连接，通过化学合成方法制备的大分子分支状多肽。多抗原肽(multipleantigenpeptides,maps)最先由jamespt在1988年提出，这一系统能在不引入其它蛋白质的情况下，解决合成的抗原肽疫苗免疫原性弱的困难。map的制备可以分为分散法和汇聚法。前者直接由核心开始，逐步向外衍生合成多肽，这种方法通常通spps来实现；后者是一种间接的、模块合成方法。肽链和模板分别合成纯化后组装在一起得到最终产物，这种策略通常由spps和lpps共同来完成。在分散法合成maps多肽中，最大的一个难点就是由于普通di-fmoc-lys上链接两个氨基的分叉臂长度不一致，导致后续偶联的每一个氨基酸反应效率不均匀，偶联在α氨基上的氨基酸由于分叉臂短空间位阻大，偶联效率就低，就有可能出现缺失肽，对后期多肽提纯造成很大困难，大大降低了map多肽的成功率。目前还有一种方法在lys的α氨基上加上一个β丙氨酸得到di-fmoc-lys(β-ala)(附图4)，虽然di-fmoc-lys(β-ala)的分叉臂长度一致，但是di-fmoc-lys(β-ala)中接了β-丙氨酸的从而引入了一个酰胺键，该结构虽然能在一定程度上提高反应均一性，但仍做不到两条臂上的反应效率完全一致。因此，目前亟需开发一种能够提高maps多肽的粗品纯度及收率的合成方法。技术实现要素：本发明的第一目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型的非天然氨基酸difmoc-lys(plus)，结构式如下所示：本发明的第二方面提供了上述新型的非天然氨基酸difmoc-lys(plus)的用途，其用于合成多抗原肽maps。本发明的第三方面提供了上述新型的非天然氨基酸difmoc-lys(plus)的合成方法，包括如下步骤：(1)fmoc-丁二胺在nabr和hno2的催化下反应得到n-fmoc-4-溴丁胺；(2)n-fmoc-4-溴丁胺与金属镁反应得到fmoc-n-4-溴丁胺格氏试剂备用；(3)nh2-lys(fmoc)-otbu在nano2催化下加入i2的反应得到i-lys(fmoc)-otbu；(4)n-fmoc-4-溴丁胺格氏试剂和i-lys(fmoc)-otbu反应得到2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸叔丁酯；(5)2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸叔丁酯再经tfa酸解脱去叔丁酯，得到2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸，即difmoc-lys(plus)；具体反应式如下：本发明的第四方面提供了一种maps多肽的制备方法，包括以下步骤：a.合成一种新型的maps多肽linker，即difmoc-lys(plus)；b.将difmoc-lys(plus)装载到树脂上，得到8maps树脂；c.按照fmoc固相合成法合成8amps多肽粗品，再经hplc分离纯化得到8maps多肽精品。优选的，所述步骤b包括如下步骤：取适量空白王树脂加入反应器中，按照一次缩合→洗涤→封羟基→洗涤→脱保护→洗涤→二次缩合→洗涤→脱保护→洗涤→三次缩合的顺序，制备得到8amps树脂。优选的，所述步骤b中一次缩合的条件是以dmf做溶剂，加入摩尔比为1:1:2的difmoc-lys(plus)、tbtu、diea反应1～2小时；所述步骤b中二次缩合加入的各原料摩尔量为一次缩合2倍，步骤b中三次缩合加入的各原料摩尔量为是一次缩合的4倍。优选的，所述步骤b中使用的封羟基试剂是dmf:吡啶:乙酸酐＝2:2:1(v/v)，脱保护试剂是20％的哌啶/dmf溶液。优选的，所述步骤c中具体条件如下：取上述制得的8maps树脂，按照fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，得到8maps树脂多肽，8maps树脂多肽再经切割、结晶、干燥得到8maps多肽粗品，再经过hplc分离纯化、冻干得到8maps多肽精品。8maps树脂多肽的结构如下所示：本发明的有益效果是：本发明在现有lys的基础上开发出一种新型的非天然氨基酸difmoc-lys(plus)，使difmoc-lys(plus)的两条分叉臂无论从长度上还是结构上都完全一致，从而使后续的氨基酸偶联反应效率完全一致，从而大大提高了maps多肽的粗品纯度及成功率。附图说明图1为实施例3制备得到的maps多肽精品的质谱图；图2为实施例3制备得到的maps多肽精品的高效液相色谱图；图3为实施例4制备得到的maps多肽精品的质谱图；图4为实施例4制备得到的maps多肽精品的高效液相色谱图；图5为实施例5制备得到的maps多肽精品的质谱图；图6为实施例5制备得到的maps多肽精品的高效液相色谱图.具体实施方式以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。实施例1difmoc-lys(plus)的制备1.称取fmoc-丁二胺31g置于500ml烧瓶中，加入12.3gnabr溶于thf中，缓慢滴加hno2磁力搅拌反应2小时，tlc检测反应终点，得到n-fmoc-4-溴丁胺26.2g；再加入2g金属镁反应得到fmoc-n-4-溴丁胺格氏试剂19.8g待用；2.称取nh2-lys(fmoc)-otbu42.5g置于500ml烧瓶中，加入丙酮溶解，再加入6.9gnano2、15.2gi2搅拌反应得到i-lys(fmoc)-otbu37.5g；3.取上述步骤1中的n-fmoc-4-溴丁胺格氏试剂19.8g和步骤2中的i-lys(fmoc)-otbu37.5g反应得到2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸叔丁酯17.5g；2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸叔丁酯再经tfa酸解脱去叔丁酯，得到2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸15.6g，即difmoc-lys(plus)。mw：646.8。实施例28amps树脂的制备称取空白王树脂10g置于反应器中，加dmf溶胀30分钟，再加入0.65gdifmoc-lys(plus)，0.32gtbtu，1mldiea，反应2小时，洗涤后再加入100ml封羟基试剂，反应1小时，再加入100ml脱保护试剂，搅拌反应30分钟，再加入1.3gdifmoc-lys(plus)，0.64gtbtu，2mldiea，反应1小时；脱保护，再加入2.6gdifmoc-lys(plus)，1.28gtbtu，4mldiea，反应1小时，洗涤干燥后得到12.5g8amps树脂，用分光光度计测树脂取代度为0.36mmol/g。实施例3多肽精品的制备取上述取代度为0.36mmol/g的8maps树脂2.78g，分支多肽序列为trp-gln-pro-pro-arg-ala-arg-ile，按照fmoc固相合成法逐一偶联每一个氨基酸，每一步缩合所用的物料如表1所示：表1步骤保护氨基酸缩合剂1fmoc-ile-ohdic/hobt/diea2fmoc-arg(pbf)-ohdic/hobt/diea3fmoc-ala-ohdic/hobt/diea4fmoc-arg(pbf)-ohdic/hobt/diea5fmoc-pro-ohdic/hobt/diea6fmoc-pro-ohdic/hobt/diea7fmoc-gln(trt)-ohdic/hobt/diea8fmoc-trp(boc)-ohdic/hobt/diea偶联结束后，树脂多肽再经过切割、结晶、干燥得到maps多肽粗品9.1g，理论粗品量＝0.36*2.78*9350＝9.36g，粗品再通过hplc分离纯化得到纯度95％以上的maps多肽精品3.5g，提纯收率为38.5％，总收率为37.4％。mw：9350。实施例3制备得到的maps多肽精品的质谱图和hplc图如图1和2所示。实施例4多肽精品的制备取上述取代度为0.36mmol/g的8maps树脂2.78g，分支多肽序列为lys-lys-leu-glu-lys-lys-thr-thr，按照fmoc固相合成法逐一偶联每一个氨基酸，每一步缩合所用的物料如表2所示：表2步骤保护氨基酸缩合剂1fmoc-thr(tbu)-ohdic/hobt/diea2fmoc-thr(tbu)-ohdic/hobt/diea3fmoc-lys(boc)-ohdic/hobt/diea4fmoc-lys(boc)-ohdic/hobt/diea5fmoc-glu(otbu)-ohdic/hobt/diea6fmoc-leu-ohdic/hobt/diea7fmoc-lys(boc)-ohdic/hobt/diea8fmoc-lys(boc)-ohdic/hobt/diea偶联结束后，树脂多肽再经过切割、结晶、干燥得到maps多肽粗品8.6g，理论粗品量＝0.36*2.78*8966＝8.97g，粗品再通过hplc分离纯化得到纯度90％以上的maps多肽精品3.2g，提纯收率37.2％，总收率35.6％。mw：8966，实施例4制备得到的maps多肽精品的质谱图和hplc图如图3和4所示。实施例5多肽精品的制备取上述取代度为0.36mmol/g的8maps树脂2.78g，分支多肽序列为cys-ala-gly-lys-ala-ala-gly-arg-asn-gly，按照fmoc固相合成法逐一偶联每一个氨基酸，每一步缩合所用的物料如表3所示：表3步骤保护氨基酸缩合剂1fmoc-gly-ohdic/hobt/diea2fmoc-asn(trt)-ohdic/hobt/diea3fmoc-arg(pbf)-ohdic/hobt/diea4fmoc-gly-ohdic/hobt/diea5fmoc-ala-ohdic/hobt/diea6fmoc-ala-ohdic/hobt/diea7fmoc-lys(boc)-ohdic/hobt/diea8fmoc-gly-ohdic/hobt/diea9fmoc-ala-ohdic/hobt/diea10fmoc-cys(trt)-ohdic/hobt/diea偶联结束后，树脂多肽再经过切割、结晶、干燥得到maps多肽粗品8.2g，理论粗品量＝0.36*2.78*8396＝8.40g，粗品再通过hplc分离纯化得到纯度98％以上的maps多肽精品3.2g，提纯收率为39％，总收率是38.1％。mw：8396，实施例5制备得到的maps多肽精品的质谱图和hplc图如图5和6所示。以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种氨基酸difmoc-lys(plus)，结构式如下所示：
2.如权利要求1所述的氨基酸difmoc-lys(plus)的用途，其用于制备多抗原肽maps。
3.如权利要求1所述的氨基酸difmoc-lys(plus)的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)fmoc-丁二胺在nabr和hno2的催化下反应得到n-fmoc-4-溴丁胺；
(2)n-fmoc-4-溴丁胺与金属镁反应得到fmoc-n-4-溴丁胺格氏试剂备用；
(3)nh2-lys(fmoc)-otbu在nano2催化下加入i2的反应得到i-lys(fmoc)-otbu；
(4)n-fmoc-4-溴丁胺格氏试剂和i-lys(fmoc)-otbu反应得到2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸叔丁酯；
(5)2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸叔丁酯再经tfa酸解脱去叔丁酯，得到2-n-fmoc-丁胺-6-n-fmoc-氨基-己酸，即difmoc-lys(plus)。
4.一种maps多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a.合成maps多肽linker，即difmoc-lys(plus)；
b.将difmoc-lys(plus)装载到树脂上，得到8maps树脂；
c.按照fmoc固相合成法合成8amps多肽粗品，再经hplc分离纯化得到8maps多肽精品。
5.如权利要求4所述的maps多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤b包括如下步骤：取适量空白王树脂加入反应器中，按照一次缩合→洗涤→封羟基→洗涤→脱保护→洗涤→二次缩合→洗涤→脱保护→洗涤→三次缩合的顺序，制备得到8amps树脂。
6.如权利要求4所述的maps多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤b中一次缩合的条件是以dmf做溶剂，加入摩尔比为1:1:2的difmoc-lys(plus)、tbtu、diea反应1～2小时；所述步骤b中二次缩合加入的各原料摩尔量为一次缩合2倍，步骤b中三次缩合加入的各原料摩尔量为是一次缩合的4倍。
7.如权利要求4所述的maps多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤b中使用的封羟基试剂是dmf:吡啶:乙酸酐＝2:2:1(v/v)，脱保护试剂是20％的哌啶/dmf溶液。
8.如权利要求4所述的maps多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤c中具体条件如下：取上述制得的8maps树脂，按照fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，得到8maps树脂多肽，8maps树脂多肽再经切割、结晶、干燥得到8maps多肽粗品，再经过hplc分离纯化、冻干得到8maps多肽精品。
技术总结本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种MAPS多肽的制备方法，包括以下步骤：合成一种新型的MAPS多肽linker，即DiFmoc‑Lys(plus)；将DiFmoc‑Lys(plus)装载到树脂上，得到8MAPS树脂；按照Fmoc固相合成法合成8AMPS多肽粗品，再经HPLC分离纯化得到8MAPS多肽精品。本发明的有益效果是：本发明在现有Lys的基础上开发出一种新型的非天然氨基酸DiFmoc‑Lys(plus)，使DiFmoc‑Lys(plus)的两条分叉臂无论从长度上还是结构上都完全一致，从而使后续的氨基酸偶联反应效率完全一致，从而大大提高了MAPS多肽的粗品纯度及成功率。
技术研发人员：徐红岩;竺剑峰
受保护的技术使用者：滨海吉尔多肽有限公司;江苏洪珉药业有限公司
技术研发日：2020.03.18
技术公布日：2020.06.05
