本发明属于甲醛检测技术领域，具体涉及一种采用氨基胍基团作为新型甲醛识别基团的双光子荧光探针，以及该双光子荧光探针的制备方法及其在活体组织及细胞中甲醛荧光检测领域的应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
活性羰基化合物因其致癌毒性一直受到人类的广泛关注，其种类主要包括甲醛、乙二醛、丙二醛、丙酮醛、丙烯醛等。其中，甲醛存在于人体各个部位，当其浓度出现异常时，会引起多种疾病如癌症，心脏病，神经退行性疾病等。因此，设计开发能够快速、高选择、高灵敏地检测生物体内的甲醛的技术具有重要意义。
近年来，荧光探针因其操作简单、灵敏度高、选择性好和实时检测等优点，在细胞及活体组织甲醛的检测中具有独特的优势。用于检测甲醛的几种代表性的荧光探针有：以aza-cope重排策略构建的荧光探针(brewertf,changcj.anaza-copereactivity-basedfluorescentprobeforimagingformaldehydeinlivingcells[j].j.am.chem.soc.2015,137,10886-10889)，以及以肼基作为甲醛识别基团的荧光探针(tangy,kongx,xua,etal.developmentofatwo-photonfluorescentprobeforimagingofendogenousformaldehydeinlivingtissues[j].angew.chem.int.ed.2016,55,3356–3359)。然而上述两类探针仍然存在一些不足之处，如检测灵敏度低、响应时间过长等。因此，开发新型的能够快速、高选择、高灵敏响应甲醛的荧光探针，仍然具有十分重要的意义。
技术实现要素：
针对上述研究背景，本发明提供了一种可用于检测细胞内甲醛的荧光探针及其制备方法，该荧光探针以氨基胍基作为甲醛的识别基团，并且荧光探针具有双光子性能，经验证对于甲醛检测具有较高的灵敏度和响应速度，并且能够应用于活体样品中甲醛的荧光检测方式。
本发明第一方面，提供一种双光子荧光探针，所述双光子荧光探针结构如下式所示：
本发明第二方面，提供第一方面所述双光子荧光探针的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将羟基四苯乙烯与n-boc-溴乙胺反应，之后脱去boc，加入s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐生成产物，即为所述双光子荧光探针。
优选的，所述制备方法反应过程如下：
优选的，所述制备方法步骤如下：
(1)向羟基四苯乙烯与n-boc-溴乙胺溶剂体系中加入碳酸钾和18-冠醚-6，加热回流得到化合物1；
(2)化合物1脱去boc得到化合物2；
(3)向化合物2的溶剂体系中加入s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐及三乙胺得到检测甲醛的荧光探针。
进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤如下：将羟基四苯乙烯与n-boc-溴乙胺溶解于乙腈中，加入碳酸钾和18-冠醚-6，加热回流10～14h，蒸干溶剂后通过色谱柱洗脱分离得到化合物1。
在一些具体的实施方式中，所述洗脱剂为二氯甲烷及石油醚的混合溶液，其体积比v二氯甲烷：v石油醚＝1-5：1。
在一些具体的实施方式中，所述羟基四苯乙烯、n-boc-溴乙胺、碳酸钾、18-冠醚-6及乙腈的用量比为0.14-0.17g：0.14-0.17ml：0.11-0.14g：0.10-0.13g：4-5ml。
进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤如下：将化合物1溶于二氯甲烷中，搅拌下滴入三氟乙酸反应1.5～2.5h。
在一些具体的实施方式中，所述化合物1、二氯甲烷及三氟乙酸的比为0.16-0.20g：4-5ml：1.2-1.5ml。该投料比例有利于提高原料的转化率、提高化合物2的产率和纯度。
所述步骤(2)可通过tlc点板的方式追踪反应进程，从而控制反应结束时间。
进一步优选的，所述步骤(3)的具体操作如下：将化合物2、s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐溶于无水乙醇，并加入三乙胺，之后75～85℃回流3.5～4.5h,旋干，残余物通过色谱柱纯化，得到所述双光子荧光探针。
本发明第三方面，提供双光子荧光探针在甲醛检测领域的应用。
优选的，所述甲醛检测包括活体样品中的甲醛检测，包括具有生命的个体，活体组织及细胞等。更为具体的，该荧光探针可应用于甲醛相关疾病诊断试剂、试剂盒的开发，或应用于食物原料中甲醛残留的检测，如水发食品等。
本发明第四方面，提供一种样品中甲醛的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：向待测样品中加入所述双光子荧光探针的缓冲液进行孵育，孵育结束后洗去多余的探针，通过显微成像拍摄并测量待测样品中的荧光强度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明中提供的荧光探针具有双光子性能，对于甲醛检测的灵敏度较高，响应速度快，应用于活体组织检测对样品的伤害小并且穿透力强，成像效果清晰。并且，该双光子荧光探针的响应速度快，不需要长时间的孵育即可进行检测。
2.经本发明研究验证，该双光子荧光探针具有较高的选择性，其他生物活性分子存在的情况下不干扰本发明中双光子荧光探针的检测。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例3中探针与甲醛荧光响应光谱图。
图2为实施例3中480nm处探针荧光强度与甲醛浓度的线性关系图。
图3为实施例3中探针对甲醛的响应动力学曲线图。
图4为实施例3中探针对甲醛的选择性实验结果。
图5为实施例3中探针对hepg2细胞染色图；
其中，图5(1)为细胞荧光染色照片图；
图5a为亚硫酸氢钠清除内源甲醛的细胞染色图；
图5b为空白组细胞染色图；
图5c为甲醛处理组细胞染色图；
图5d为甲醛处理组细胞染色图；
图5(2)为hepg2细胞中平均荧光强度输出图。
图6为实施例3中小鼠腿部组织荧光照片图；
其中，图6a为正常腿部组织；图6b为lps刺激产生炎症反应的腿部组织。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种双光子荧光探针、该探针的制备方法，及其在活体组织中甲醛检测领域的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中，提供一种双光子荧光探针的制备方案：
(1)将羟基四苯乙烯(348mg)与n-boc-溴乙胺(344μl)溶解于乙腈(10ml)中，并加入碳酸钾(276mg)和18-冠醚-6(264mg)，加热回流12h，旋干，用色谱柱分离，洗脱剂比例为v二氯甲烷：v石油醚＝1：1，旋干得到化合物1。
(2)将化合物1(200mg)溶于二氯甲烷(5ml)中，搅拌下逐滴滴入三氟乙酸(1.5ml)，通过tlc点板追踪反应进程，约2h反应完毕，之后直接旋干得到化合物2；
(3)将化合物2(100mg),s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐(120mg)溶于无水乙醇(5ml)，并加入三乙胺(72μl)，之后80℃回流4h，旋干，残余物通过色谱柱纯化，洗脱剂比例为v二氯甲烷：v甲醇＝5：1。得到检测双光子荧光探针tpe-am。
实施例2
本实施例中，提供又一种双光子荧光探针的制备方案：
(1)将羟基四苯乙烯(174mg)与n-boc-溴乙胺(172μl)溶解于乙腈(5ml)中，并加入碳酸钾(138mg)和18-冠醚-6(132mg)，加热回流12h，旋干，用色谱柱分离，洗脱剂比例为v二氯甲烷：v石油醚＝5：1，旋干得到化合物1。
(2)将化合物1(100mg)溶于二氯甲烷(2.5ml)中，搅拌下逐滴滴入三氟乙酸(0.75ml)，通过tlc点板追踪反应进程，约2h反应完毕。之后直接旋干得到化合物2；
(3)将化合物2(50mg),s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐(60mg)溶于无水乙醇(2.5ml)，并加入三乙胺(36μl)，之后80℃回流4h,旋干，残余物通过色谱柱纯化，洗脱剂比例为v二氯甲烷：v甲醇＝10：1，得到双光子荧光探针tpe-am。
实施例3双光子荧光探针结构表征与性能测试
1.中间体与探针的核磁与质谱表征
化合物1：1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.14-7.05(m,9h),7.05-6.98(m,6h),6.93(d,j＝8.8hz,2h),6.62(d,j＝8.8hz,2h),4.96(brs,1h),3.93(t,j＝5.0hz,2h),3.52-3.44(m,2h),1.45(s,9h)ppm.13cnmr(100mhz,cdcl3):δ157.03,155.85,143.96,143.91,143.90,140.37,140.23,136.54,132.59,131.35,131.33,131.31,127.73,127.61,127.59,126.37,126.29,126.25,113.53,77.22,66.96,29.71,28.40ppm.hrms(esi):calculatedforc33h33no3na (m na) 514.2353,found514.2354.
化合物2：hrms(esi):calculatedforc28h26no (m h) 392.2009,found392.1989.
探针tpe-am：1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ7.19-7.07(m,9h),7.01-6.92(m,6h),6.87(dd,j＝8.8,3.5hz,2h),6.71(dd,j＝8.8,3.5hz,2h),4.74(brs,1h),3.97(t,j＝5.0hz,1h),3.92(t,j＝5.4hz,1h),3.51(brs,1h),2.96(t,j＝5.4hz,1h)ppm.13cnmr(100mhz,cdcl3):δ156.45,143.87,143.82,143.79,140.41,140.24,137.02,132.80,132.60,131.29,127.79,127.74,127.69,127.64,127.61,126.41,126.34,126.30,113.66,65.57,40.08ppm.hrms(esi):calculatedforc29h29n4o (m h) 449.2336,found449.2350.
2.效果实验
(1)荧光响应测试
分别用2.0μm实施例1和2的探针tpe-am对0,2,4,6,8,10,12,14,16和18μm甲醛进行荧光响应测试，得到探针tpe-am的荧光强度和甲醛浓度变化的关系。实验条件：50mmpbs，ph7.4，室温下孵育5min，激发波长为330nm，扫描400-600nm处的荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。探针的激发波长为330nm，最大发射波长为480nm，测试效果显示如图1，可以看出，随着甲醛浓度增大，测试溶液的荧光逐渐增强，说明该探针的荧光强度与体系中甲醛的浓度具有良好的相关性，可以用于甲醛的检测，且孵育时间短，检测速度快。
(2)实施例1和2中探针tpe-am在480nm处的荧光强度和甲醛浓度的回归曲线。
结果如图2，横坐标为甲醛的浓度，纵坐标为480nm处荧光强度，激发波长为330nm。
(3)实施例1和2的探针tpe-am的响应动力学实验。
实验条件：探针浓度为2.0μm，pbs50mm，ph7.4，加入的甲醛浓度分别为20μm(虚线所示)和50μm(实线所示)，激发波长为330nm，实时收集探针在480nm处的荧光强度，测试效果显示如图3，可以看出，加入甲醛后体系的荧光在30s时间点呈现迅速上升并在之后的30s内基本达到最大值，证明探针对于甲醛的识别在30s内反应基本完成，说明该探针用于甲醛的检测孵育时间短，响应速度快。
(4)实施例1和2的探针tpe-am的选择性实验。
将2.0μm的探针tpe-am分别与不同的生物活性物质如clo-，·oh，onoo-，h2o2，cys，gsh，ca2 ，mg2 ，乙醛，丙酮醛，甲醛(对应附图4中的27号)等孵育，测试孵育前后的480nm处荧光强度变化。测试结果如图4，可以说明本发明的探针tpe-am对甲醛的选择性高，其它生物活性小分子不干扰。
(5)实施例1和2的探针tpe-am对人肝癌细胞(hepg2)的双光子激光共聚焦显微成像。
其结果如图5所示，图5a为加100μm亚硫酸氢钠清除内源甲醛的细胞染色图，能观察到较弱的荧光；图5b为空白组细胞染色图，与图5a中清除组细胞相比，荧光略有增加，表明探针能够检测到细胞中的内源甲醛；图5c为20μm甲醛处理组染色图，与图5b中细胞相比，荧光显著增强；图5d为50μm甲醛处理组染色图，与图5b中细胞相比，荧光增强更加明显。
实验条件：激发波长为720nm，发射波长收集范围为400-600nm。细胞在整个实验过程中保持良好的细胞活性。实验结果表明该荧光探针在活体细胞内也能够对甲醛具有良好的响应性，对活体组织基本无损伤，可以实现通过荧光手段进行细胞中的甲醛检测。
(6)实施例1和2的探针tpe-am对小鼠腿部组织的双光子激光共聚焦显微成像。
其结果如图6。实验小鼠一侧腿部皮下注射100μl无菌pbs，另一侧腿部皮下注射lps(1.0mg/ml,100μl)诱发炎症，12h后腹腔注射探针(50μm,100μl)，并在1h后分别对小鼠腿部进行双光子成像，激发波长720nm，发射波长收集范围为400-600nm。图6a为正常腿部组织，只显示出微弱的荧光，图6b为lps刺激产生炎症反应的腿部组织，在激发波长下能够显示出清晰的荧光，证明该探针切实可以应用于活体组织中的甲醛检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种双光子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针结构如下式所示：
2.权利要求1所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将羟基四苯乙烯与n-boc-溴乙胺反应，之后脱去boc，加入s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐生成产物，即为所述双光子荧光探针。
3.如权利要求2所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法反应过程如下：
4.如权利要求3所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：
(1)向羟基四苯乙烯与n-boc-溴乙胺溶剂体系中加入碳酸钾和18-冠醚-6，加热回流得到化合物1；
(2)化合物1脱去boc得到化合物2；
(3)向化合物2的溶剂体系中加入s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐及三乙胺得到检测甲醛的荧光探针。
5.如权利要求4所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤如下：将羟基四苯乙烯与n-boc-溴乙胺溶解于乙腈中，加入碳酸钾和18-冠醚-6，加热回流10～14h，蒸干溶剂后通过色谱柱洗脱分离得到化合物1；
优选的，所述洗脱剂为二氯甲烷与石油醚的混合溶液，其体积比为v二氯甲烷：v石油醚＝1-5：1；
优选的，所述羟基四苯乙烯、n-boc-溴乙胺、碳酸钾、18-冠醚-6及乙腈的用量比为0.14-0.17g：0.14-0.17ml：0.11-0.14g：0.10-0.13g：4-5ml。
6.如权利要求4所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体步骤如下：将化合物1溶于二氯甲烷中，搅拌下滴入三氟乙酸反应1.5～2.5h；
优选的，所述化合物1、二氯甲烷及三氟乙酸的比为0.16-0.20g：4-5ml：1.2-1.5ml。
7.如权利要求4所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作如下：将化合物2、s-甲基异硫氨基脲氢碘酸盐溶于无水乙醇，并加入三乙胺，之后75～85℃回流3.5～4.5h，旋干，残余物通过色谱柱纯化，得到所述双光子荧光探针。
8.权利要求1所述双光子荧光探针在甲醛检测领域的应用。
9.如权利要求8所述双光子荧光探针在甲醛检测领域的应用，其特征在于，所述甲醛检测包括活体样品中的甲醛检测，包括具有生命的个体，活体组织及细胞等。
10.一种样品中甲醛的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：向待测样品中加入所述双光子荧光探针的缓冲液进行孵育，孵育结束后洗去多余的探针，通过显微成像拍摄并测量待测样品中的荧光强度。
技术总结