一种全反式游离虾青素的生物制备方法与流程

专利2022-06-29  82


技术领域:

本发明属于生物分离技术领域,具体涉及一种全反式游离虾青素的生物制备方法。



背景技术:

虾青素是一种天然存在的类胡萝卜素,具有非常强的抗氧化活性,是维生素e的550倍,是自然界中已经发现的最强的抗氧化剂,能够有效清除细胞内的氧化产物、增强细胞再生功能,改善老年痴呆、缓解慢性疲劳、改善心血管疾病等。当前天然虾青素的主要来源是海洋甲壳类、鱼类、雨生红球藻、红发夫酵母,但天然存在的虾青素以虾青素酯形式存在,相比较于游离虾青素,消化吸收较差生物利用度低。而采用化学合成虾青素为游离形式,其生物安全性低于天然虾青素,不能直接添加应用到食品中。相比于化学合成虾青素,天然虾青素如雨生红球藻等以优良的生理功能和安全性得到更广泛的应用,但是要解决天然虾青素生物利用度低的问题,需要将酯化形式虾青素转化成游离型。

目前,国内外关于游离虾青素的制备方法主要是有机溶剂萃取后皂化或者酶解,从原料中萃取天然虾青素主要有超声提取、超临界二氧化碳提取、有机溶剂萃取等方法,这些方法中,超声法、超临界法存在设备复杂、费用高等问题;有机溶剂萃取法主要是以乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等试剂,这些方法中存在溶剂消耗量大、工艺复杂高等问题,且提取出的虾青素水溶性较差。而将虾青素酯转化为游离虾青素主要有酶解法、碱法皂化,但在食品工业中,无高效的工业生产用酶,皂化法存在虾青素氧化降解、异构化等问题,都会将虾青素氧化为虾红素,虾青素结构受到破坏。

虾青素营养强化生物制品中,禽蛋蛋黄会对虾青素进行大量富集,是对虾青素进行生物转化利用的非常好的方式。现有技术,如专利201811525974.6《一种天然虾青素蛋黄油的制造方法》中认为,经过禽蛋富集后的虾青素在蛋黄内以酯化状态存在,即虾青素酯,所以提取过程都是以提取、纯化蛋黄油为主。但其实,天然虾青素(酯)经过蛋鸡特定的生物转化后,其存在形式发生变化。虾青素酯进入肠道后,经过消化酶消化作用,脂肪酸和虾青素的酯键断开,变成游离虾青素,在血液中与载脂蛋白结合转运到组织器官。在卵黄形成过程中,脂质大量蓄积,载脂蛋白将虾青素运输到卵黄中。卵黄蛋白原参与此过程,与虾青素结合,形成游离虾青素蛋白复合物后稳定存在于卵黄中。禽蛋将虾青素酯转化为游离虾青素,增加了天然虾青素的来源多样性,为虾青素在食品原料以及食品中应用提供新途径。

天然反式游离虾青素即左旋虾青素,雨生红球藻虾青素中有5%左右为游离虾青素,其结构稳定,与人体、动物体内所需虾青素结构一致,利于吸收,能最大程度上发挥其应有的多种生物功效。而人工混合合成的虾青素只25%左右左旋虾青素,抗氧化效果只占到100%左旋虾青素的四分之一,不适合人体服用。所以如何提取得到高含量的全反式游离虾青素,是亟待解决的问题。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题是国内外关于游离虾青素的制备方法主要是有机溶剂萃取后皂化或者酶解,从原料中萃取天然虾青素主要有超声提取、超临界二氧化碳提取、有机溶剂萃取等方法,这些方法都会将虾青素氧化为虾红素,虾青素结构受到破坏。

为解决上述问题,本发明通过利用蛋鸡对天然虾青素(酯)进行生物转化,在此基础上,得到两种游离虾青素产品,一种是水溶性较高的虾青素蛋白复合物,一种是纯度高的全反式游离虾青素。

为达到上述目的,本发明具体通过以下技术手段实现,一种全反式游离虾青素的生物制备方法,收集喂养虾青素营养强化饲料后禽类的禽蛋,分离蛋黄,经第一次蛋白醇沉淀除去醇溶性蛋白后得到虾青素蛋白复合物;第一次蛋白酸沉淀后经第二次蛋白酸沉淀除去醇不溶性蛋白,得到全反式游离虾青素。

其中,经过生物转化后的虾青素主要富集在卵黄中,与卵黄蛋白结合后以虾青素蛋白复合物形式存在。而卵黄的主要成分是17.5%的蛋白质,32.5%的脂肪,还有大约48%的水和2%的矿物质,以及多种维生素等,经第一次蛋白沉淀后,醇不溶性蛋白、矿物质在沉淀被除去,醇溶性蛋白、虾青素、脂质留在提取液中。与二氯甲烷提取法相比,虾青素损失率在5.4%。

经过第二次蛋白沉淀后,去除了醇溶性蛋白,虾青素损失率在6.1%。

进一步的,第一次蛋白醇沉淀为将蛋黄液按照料液比1:(5~15)加入无水乙醇,进行搅拌提取,时间为1h,搅拌后进行37~40℃温水浴,时间为0.5~1h,进行离心,离心速度为2000~3000rpm,收集清液。无水乙醇是进行脂质提取的有效溶剂,温水浴可以使卵黄中结合态脂质更好的分散到乙醇中,提高提取效率。

进一步的,第一次蛋白醇沉淀后的上清液进行减压浓缩,浓缩温度为45~70℃,真空度小于-0.1mpa,得到水溶性虾青素蛋白复合物。浓缩与溶剂脱除时用惰性气体进行保护。虾青素蛋白复合物中,蛋白含量20%-40%,全反式游离虾青素含量0.025%~0.15%,虾青素与卵黄脂蛋白以非共价键方式结合到一起,形成虾青素卵黄脂蛋白复合物。这种非共价键结合的方式包括氢键、范德华力、弱相互作用等,结合力较弱。溶液中ph变化后,蛋白质中氨基酸一定程度的解离,其溶解度发生变化,虾青素之间的非共价键作用力受到破坏,所以后期可以通过蛋白酸沉淀的方式分离虾青素和蛋白。

进一步的,第二次蛋白酸沉淀为将第一次蛋白醇沉淀后的上层清液通入二次沉淀池,加入盐酸调节ph至4.0~4.5,离心沉淀,离心速度为2000~3000rpm。然后将离心后得到的上清液通入酸碱池,用naoh调节ph为7.0,离心沉淀,离心速度为2000~3000rpm,收集上层清液。加盐酸可以调节溶液ph值,使其处于醇溶性蛋白等电点附近,破坏醇溶性蛋白与虾青素之间的非共价键作用力,使蛋白质沉淀下来,然后将蛋白质沉淀然后通过离心去除。加入naoh可以和盐酸反应生成nacl,去除加入的盐酸,使ph值恢复到原先水平。

进一步的,第二次蛋白酸沉淀后的上清液进行减压浓缩,浓缩温度为45~70℃,真空度小于-0.1mpa,得到游离虾青素油脂。浓缩与溶剂脱除时用惰性气体进行保护。虾青素油脂中含有大量全反式游离虾青素、卵磷脂、脂溶性维生素等。

进一步的,喂养虾青素营养强化饲料时,将5%~20%雨生红球藻藻粉加入到家禽产蛋基础饲料中,用搅拌器搅拌均匀,进行禽蛋的虾青素营养强化。随着饲喂周期延长,蛋黄颜色加深,游离虾青素含量逐渐提高。饲喂15天以上,禽蛋中虾青素达到稳定水平100~600ug/g蛋黄。喂养雨生红球藻可保证得到的游离虾青素为全反式游离虾青素,具有更高、更好的生物活性。

进一步的,分离蛋黄时将富含虾青素的禽蛋作脱壳处理,将蛋清蛋黄分离,收集蛋黄;将蛋黄放入搅拌罐搅拌均匀,进入下一步的沉淀池。

本发明的有益效果:

(1)本发明以雨生红球藻为原料得到虾青素生物制品后,对禽蛋中的虾青素进行提取制备,得到的虾青素为全反式游离虾青素油脂,其结构稳定,与人体、动物体内所需虾青素结构一致,利于吸收,能最大程度上发挥其应有的多种生物功效。

(2)虾青素是脂溶性化合物,在水中溶解度低,对工业上开发利用带来一定困难。本发明制备方法制备的虾青素蛋白复合物水溶性高,虾青素蛋白复合物中虾青素溶解度达到1.3mg/ml,增加了虾青素在工业生产中的应用。

(3)经过禽蛋的生物筛作用,虾青素的安全性得到进一步提高。

(4)本发明将雨生红球藻中的虾青素经过鸡体转化后变为游离形式,增强了其生物利用度。提取过程步骤简单,两次沉淀后提取效率为89%,溶剂可回收利用,成本低。

附图说明

图1为本发明实施例1中全反式游离虾青素标准品hplc图谱;

图2为本发明实施例2中虾青素浸膏的hplc图谱;

图3为虾青素含量与hplc峰面积对应标准曲线。

具体实施方式:

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

实施例1:

(1)制备虾青素营养生物原料:将雨生红球藻破壁藻粉与基础饲料在搅拌器中混合均匀,混合比例为10:90,饲喂蛋鸡15天后,每日收集鸡蛋。

(2)收集禽蛋,分离蛋黄预处理:将禽蛋进行脱壳处理,用分蛋器将蛋清和蛋黄进行分离,收集蛋黄,取蛋黄约30g搅拌均匀,搅拌3min。

(3)第一次蛋白沉淀收集清液:加入150ml的无水乙醇,进行搅拌提取,时间为1h。搅拌提取后进行40℃温水浴,时长为1h,在离心杯中进行离心,离心转速3000rpm,3min,收集上层清液。

(5)将虾青素提取液在在真空度为-0.1mpa条件下减压浓缩,脱除溶剂。得到虾青素蛋白复合物浸膏,如图1所示,按照国标gbt31520-2015用高效液相色谱检测蛋提取的复合物中的全反式游离虾青素含量,测定含量为0.1%。

实施例2:

(1)虾青素禽蛋的获得:将雨生红球藻非破壁藻粉与蛋鸡基础饲料在搅拌器中混合均匀,比例为10:90,饲喂海蛋鸡20天,每日收集鸡蛋。

(2)蛋黄收集预处理:将虾青素禽蛋进行脱壳处理,用分蛋器将蛋清和蛋黄进行分离,收集蛋黄后将蛋黄放入搅拌罐进行充分搅拌均匀。

(3)一次蛋白沉淀:搅拌均匀后加入无水乙醇,搅拌提取,时间为1h。搅拌提取后进行37℃温水浴提取,时间为1h。提取后进行离心,离心转速2000rpm,时长5min,收集上清液。

(4)步骤3)所得清液进行二次蛋白沉淀收集清液:步骤(3)得到的清液中加入盐酸调节ph为4.0-4.5,加入盐酸后清液变浑浊,进行离心,离心转速3000rpm,时长5min,离心后的上清液用naoh调节ph至ph=7.0,搅拌混匀后进行离心处理,离心转速3000rpm,收集上层清液。

(5)浓缩脱除溶剂。将虾青素提取液在在真空度为-0.1mpa条件下减压浓缩,脱除溶剂。得到虾青素浸膏,如图2所示,按照国标gbt31520-2015用高效液相色谱检测蛋提取的虾青素浸膏中的虾青素含量,测得虾青素含量为354.9ug/g蛋黄。

以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。


技术特征:

1.一种全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:收集喂养虾青素营养强化饲料后禽类的禽蛋,分离蛋黄,经第一次蛋白醇沉淀后得到虾青素蛋白复合物;第一次蛋白醇沉淀后经第二次蛋白酸沉淀得到全反式游离虾青素。

2.如权利要求1所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:第一次蛋白醇沉淀为将蛋黄液按照料液比1:(5~15)加入无水乙醇,进行搅拌提取,搅拌后进行温水浴,然后离心,收集清液。

3.如权利要求1所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:第一次蛋白醇沉淀后的上清液进行减压浓缩得到水溶性虾青素蛋白复合物。

4.如权利要求1所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:第二次蛋白酸沉淀为将第一次蛋白醇沉淀后的上层清液内加入盐酸调节ph至4.0~4.5,离心沉淀;然后将离心后的上清液通入酸碱池,用naoh调节ph为7.0,离心沉淀,收集上层清液。

5.如权利要求1所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:第二次蛋白酸沉淀后的上清液进行减压浓缩,浓缩温度为45~70℃,真空度小于-0.1mpa,得到游离虾青素油脂。

6.如权利要求3或5所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:减压浓缩时用惰性气体进行保护。

7.如权利要求1所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:喂养虾青素营养强化饲料时,将5%~20%雨生红球藻藻粉加入到家禽产蛋基础饲料中,用搅拌器搅拌均匀,进行禽蛋的虾青素营养强化。

8.如权利要求1所述的全反式游离虾青素的生物制备方法,其特征在于:分离蛋黄时将富含虾青素的禽蛋作脱壳处理,将蛋清蛋黄分离,收集蛋黄。

技术总结
本发明属于生物分离技术领域,具体涉及一种全反式游离虾青素的生物制备方法。收集喂养虾青素营养强化饲料后禽类的禽蛋,分离蛋黄,经第一次蛋白醇沉淀后得到虾青素蛋白复合物;第一次蛋白醇沉淀后经第二次蛋白酸沉淀得到全反式游离虾青素。本发明通过利用蛋鸡对天然虾青素(酯)进行生物转化,在此基础上,得到两种游离虾青素产品,一种是水溶性较高的虾青素蛋白复合物,一种是纯度高的全反式游离虾青素。

技术研发人员:王玉明;赵英才;薛长湖;张恬恬;薛勇;李兆杰;徐杰;常耀光;王静凤;唐庆娟
受保护的技术使用者:中国海洋大学
技术研发日:2020.02.26
技术公布日:2020.06.05

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