本发明涉及香豆素衍生物，具体属于一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在区分检测半胱氨酸和二氧化硫中的应用。
背景技术：
作为一个具有还原性巯基(-sh)基团的天然氨基酸，半胱氨酸(cys)直接参与许多复杂的生命过程，例如营养摄取，抗氧化，蛋白质合成，细胞代谢。半胱氨酸在生物体内的浓度失衡会与帕金森氏病，阿尔茨海默氏病和肝损伤等疾病密切相关。半胱氨酸在哺乳动物细胞中主要通过三种生物转化途径产生：(a)蛋氨酸代谢，(b)蛋白质水解，(c)胱氨酸(cyss)还原。在有氧条件下，半胱氨酸将被半胱氨酸双加氧酶(cdo)催化形成半胱氨酸亚磺酸盐，然后通过天冬氨酸氨基转移酶(att)进一步酶促转化为β亚磺酰基丙酮酸，最终自发分解为丙酮酸和二氧化硫(so2)。此外，生物医学研究表明，内源性二氧化硫与其它气体信号分子协同调节血管平滑肌张力并维持血液中胰岛素水平。二氧化硫也可以作为一种抗氧化剂来保护细胞内的氧化还原平衡，从而改善心血管功能。因此，鉴于半胱氨酸及其代谢产物so2的上述生理和病理作用，迫切需要一种简单，有效和可靠的策略来探测浓度波动并跟踪其在细胞、组织和生物体内的代谢途径，这对阐明二者在生理、病理等生命活动过程的复杂联系以及预防相关疾病有重大意义。
针对以上存在的问题，设计选择性好、灵敏度高、具有低细胞毒性的荧光探针用于区分检测检测活细胞和组织内半胱氨酸和二氧化硫水平变化，已成为当前生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。
在本发明中，合成了一种基于苯并吡喃氧鎓离子-香豆素的化合物，通过探针与半胱氨酸和二氧化硫在反应前后双通道荧光变化，实现对半胱氨酸和二氧化硫的区分检测。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物及其合成方法，以及将该衍生物用于半胱氨酸和二氧化硫区分检测，且检测方法简单，操作方便，选择性好，灵敏度高。
本发明提供了一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物及其合成方法和应用，所述衍生物的中文名称为7-(二乙基氨基)-2-(4-(4-(4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子，英文名称为7-(diethylamino)-2-(4-(4-(4-(3-(7-(diethylamino)-2-oxo-2h-chromen-3-yl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoyl)piperazin-1-yl)phenyl)chromenylium，命名为bpc，结构式为：
本发明提供的一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc的合成方法，步骤为：
(1)按摩尔比为1：1.5-2将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯在无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流10小时。然后将反应混合物冷却到室温，过滤、洗涤、真空干燥得到黄色固体粉末，即3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮；
(2)按摩尔比为1：1-1.5将3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮和4-甲酰基苯甲酸在无水乙醇中混合均匀，混合物在85℃加热搅拌回流72小时，然后冷却至室温，减压除去溶剂，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得紫黑色固体，即4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸；
(3)按摩尔比1：1-2将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和1-(4-甲氧基苯基)哌嗪在浓硫酸中混合，混合物在90℃搅拌回流10小时。反应完成后将混合物倒入冰水混合物，加入70％高氯酸，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得到紫黑色固体，即7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子；
(4)将4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑混合溶解于无水n，n-二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下反应0.5小时，然后向反应体系中加入7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子，混合物在室温下反应24小时。反应结束后将混合物倒入冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比30:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得得到黑红色末状目标物7-(二乙基氨基)-2-(4-(4-(4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子(bpc)，其中4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子的摩尔比为1：2-3：2-3：0.8-1。
作为优选：
所述的步骤(1)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1：2。
所述的步骤(2)中3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮和4-甲酰基苯甲酸的摩尔比为1：1.2。
所述的步骤(3)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和1-(4-甲氧基苯基)哌嗪的摩尔比为1：1.5。
所述的步骤(4)中4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子的摩尔比为1：2：2：0.8。
本发明合成的bpc可用于半胱氨酸和二氧化硫的区分检测。
本发明提供的一种检测半胱氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，用半胱氨酸配制2mm的半胱氨酸水溶液，将苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc溶于dmso配制成2mm的溶液；
(2)、取2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液、10μlbpc的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入，503nm和637nm处的荧光强度逐渐增强；
(3)、用蒸馏水配制2mm的半胱氨酸溶液，按体积比9:1将pbs缓冲溶液和dmso溶液加到2ml荧光比色皿中，逐渐加入半胱氨酸溶液的体积为0、10、30、60、90、120、150μl，同时在荧光光谱仪上测定503nm处荧光强度为433、446、471、516、560、609、639，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：f503＝1.418c 431.545，c的单位为10-6mol/l；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。
本发明提供的一种检测二氧化硫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，用亚硫酸钠配制2mm的二氧化硫水溶液，将苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc溶于dmso配制成2mm的溶液；
(2)、取2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液、10μlbpc的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样亚硫酸钠的加入，637nm处的荧光强度迅速减弱；
(3)、用蒸馏水配制2mm的二氧化硫溶液，按体积比9:1将pbs缓冲溶液和dmso溶液加到2ml荧光比色皿中，逐渐加入亚硫酸钠溶液的体积为0、10、20、30、40μl，同时在荧光光谱仪上测定637nm处荧光强度为427、310、208、98、20，以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲线；线性回归方程为：f637＝-10.260c 418.228，c的单位为10-6mol/l；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得二氧化硫的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物合成简单，成本低廉；
2、本发明苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物能实现对半胱氨酸和二氧化硫的区分检测，检测结果灵敏度高，选择性好；
3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
4、本发明采用双通道检测，检测信号明显且专一性强。
附图说明
图1实施例1制备的苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc的核磁氢谱图
图2实施例1制备的苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc的核磁碳谱图
图3实施例1制备的苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc的质谱图
图4苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc与半胱氨酸作用的荧光发射图(摘要图)
图5苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc与各种分析物的荧光柱状图
图6苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc测定半胱氨酸的工作曲线
图7苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc测定半胱氨酸样品的荧光发射图
图8苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc与二氧化硫的荧光发射图
图9苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc与各种分析物的荧光柱状图
图10苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc测定二氧化硫的工作曲线
图11苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc测定二氧化硫样品的荧光发射图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
bpc的制备与表征
将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛(1.93g,10mmol)，乙酰乙酸乙酯(2.58g,20mmol)和1ml哌啶在40ml无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流10小时。然后将反应混合物冷却到室温，过滤、洗涤、真空干燥得到黄色固体粉末(2.16g,产率:83.4％)。
将3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮(1.29g,5mmol)，4-甲酰基苯甲酸(0.90g,6mmol)和3ml哌啶在30ml无水乙醇中混合均匀，混合物在85℃加热搅拌回流72小时，然后冷却至室温，减压除去溶剂，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得暗黄色固体粉末(0.83g,产率:42.5％)。
将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛(0.96g,5mmol)和1-(4-甲氧基苯基)哌嗪(1.44g,7.5mmol)在40ml浓硫酸中混合，混合物在90℃搅拌回流10小时。反应完成后将混合物倒入50ml冰水混合物，加入2ml70％高氯酸，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得到紫黑色固体(0.75g,产率:41.2％)。
将4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸(0.39g,1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.38g,2mmol)，1-羟基苯并三唑(0.28g,2mmol)混合溶解于10ml无水n，n-二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下反应0.5小时，然后向反应体系中加入7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子(0.29g,0.8mmol)，混合物在室温下反应24小时。反应结束后将混合物倒入50ml冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比30:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得到黑红色固体粉末(0.27g,产率:46.2％)。1hnmr(600mhz,dmso)δ8.62(d,j＝8.8hz,2h),8.27(d,j＝9.0hz,2h),8.05(d,j＝15.8hz,1h),7.97(d,j＝8.5hz,1h),7.90(d,j＝9.3hz,1h),7.83(d,j＝8.0hz,2h),7.74(s,1h),7.71(s,1h),7.57(d,j＝8.0hz,2h),7.35(d,j＝9.3hz,1h),7.30(s,1h),7.16(d,j＝9.1hz,2h),6.83(d,j＝9.0hz,1h),6.62(s,1h),3.79(d,j＝30.4hz,4h),3.67(d,j＝7.0hz,6h),3.52(d,j＝7.0hz,6h),1.24(t,j＝7.0hz,6h),1.16(t,j＝7.0hz,6h).(图1)13cnmr(151mhz,dmso)δ185.31,168.53,166.88,159.89,158.19,158.06,154.84,154.22,153.00,148.56,148.37,147.81,147.64,140.52,136.87,136.12,132.46,132.30,130.75,130.59,127.80,127.67,116.68,116.23,115.12,113.60,110.23,107.84,95.90,95.77,94.66,45.07,44.39,12.27.(图2)esi-msm/z:[m h] calcdfor735.3541,found735.3543(图3).
实施例2
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；取2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液、10μlbpc的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，取半胱氨酸的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入，503nm和637nm处的荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。
实施例3
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；在荧光比色皿中，各加入2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液和10μlbpc的dmso溶液，再分别加入40倍当量的其它分析物和半胱氨酸：(1)空白；(2)so42-；(3)s2-；(4)so32-；(5)gly；(6)glu；(7)cystine；(8)cysteamine；(9)ca2 ；(10)mg2 ；(11)na ；(12)k ；(13)f-；(14)cl-；(15)i-；(16)no3-；(17)no2-；(18)clo-；(19)s2o32-；(20)gsh；(21)hcy；(22)cys的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的503nm处荧光强度柱状图(见图5)。半胱氨酸使得检测体系在503nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
实施例4
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；在7个比色皿中各加入2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液和10μlbpc的dmso溶液，然后分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、10、30、60、90、120、150μl，同时在荧光光谱仪上测定503nm处荧光强度为433、446、471、516、560、609、639，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：f503＝1.418c 431.545，c的单位为10-6mol/l；见图6。
实施例5
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；在荧光比色皿中，加入2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液和10μlbpc的dmso溶液，取半胱氨酸溶液120μl，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定503nm处荧光强度为609，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝125.14×10-6mol/l。偏差为4.28％。见图7。
实施例6
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm二氧化硫水溶液；取2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液、10μlbpc的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，取二氧化硫的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着待测样二氧化硫的加入，637nm处的荧光强度逐渐减弱。荧光发射图见图8。
实施例7
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm二氧化硫水溶液；在荧光比色皿中，各加入2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液和10μlbpc的dmso溶液，再分别加入10倍当量的其它分析物和二氧化硫：(1)空白；(2)gsh；(3)hcy；(4)cys；(5)gly；(6)glu；(7)cystine；(8)cysteamine；(9)ca2 ；(10)mg2 ；(11)na ；(12)k ；(13)f-；(14)cl-；(15)i-；(16)no3-；(17)no2-；(18)clo-；(19)s2o32-；(20)so42-；(21)s2-；(22)so32-.的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的637nm处荧光强度柱状图(见图9)。二氧化硫使得检测体系在637nm处荧光强度明显降低，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
实施例8
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm二氧化硫水溶液；在5个比色皿中各加入2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液和10μlbpc的dmso溶液，然后分别加入二氧化硫溶液的体积为0、10、20、30、40μl，同时在荧光光谱仪上测定637nm处荧光强度为427、310、208、98、20，以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲线；线性回归方程为：f637＝-10.260c 418.228，c的单位为10-6mol/l；见图10。
实施例9
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmbpc的dmso溶液，配制2mm二氧化硫水溶液；在荧光比色皿中，加入2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液和10μlbpc的dmso溶液，取二氧化硫的溶液40μl，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定637nm荧光强度为20，通过实施例9的线性回归方程，求得c＝38.81×10-6mol/l。偏差为2.97％，见图11。
1.一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc，其特征在于，结构式为：
2.如权利要求1所述的一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)按摩尔比1：1.5-2将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯在无水乙醇中混合，混合物在85℃搅拌回流10小时；然后将反应混合物冷却到室温，过滤、洗涤、真空干燥得到黄色固体粉末，即3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮；
(2)按摩尔比1：1-1.5将3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮和4-甲酰基苯甲酸在无水乙醇中混合均匀，混合物在85℃加热搅拌回流72小时，然后冷却至室温，减压除去溶剂，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化得暗黄色固体粉末，即4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸；
(3)按摩尔比为1：1-2将4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和1-(4-甲氧基苯基)哌嗪在浓硫酸中混合，混合物在90℃搅拌回流10小时；反应完成后将混合物倒入冰水混合物，加入70％高氯酸，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得到紫黑色固体，即7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子；
(4)将4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑混合溶解于无水n，n-二甲基甲酰胺中，混合物在0℃氩气保护下反应0.5小时，然后向反应体系中加入7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子，混合物在室温下反应24小时；反应结束后将混合物倒入冰水混合物，所得沉淀经过滤，洗涤、真空干燥得粗产物，粗产物用体积比30:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，得得到黑红色末状目标物7-(二乙基氨基)-2-(4-(4-(4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子(bpc)，其中4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子的摩尔比为1：2-3：2-3：0.8-1。
3.如权利要求2所述的bpc的合成方法，其特征在于，所述的步骤(1)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1：2。
4.如权利要求2所述的bpc的合成方法，其特征在于，所述的步骤(2)中3-乙酰基-7-(二乙基氨基)-2h-色烯-2-酮和4-甲酰基苯甲酸的摩尔比为1：1.2。
5.如权利要求2所述的bpc的合成方法，其特征在于，所述的步骤(3)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛和1-(4-甲氧基苯基)哌嗪的摩尔比为1：1.5。
6.如权利要求2所述的bpc的合成方法，其特征在于，所述的步骤(4)中4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-色烯-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑和7-(二乙基氨基)-2-(4-(哌嗪-1-基)苯基)色烯氧鎓离子的摩尔比为1：2：2：0.8。
7.如权利要求1所述的一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc在半胱氨酸检测中的应用。
8.一种检测半胱氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，用半胱氨酸配制2mm的半胱氨酸水溶液，将权利要求1所述的bpc溶于dmso配制成2mm的溶液；
(2)、取2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液、10μlbpc的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入，503nm和637nm处的荧光强度逐渐增强；
(3)、用蒸馏水配制2mm的半胱氨酸溶液，按体积比9:1将pbs缓冲溶液和dmso溶液加到2ml荧光比色皿中，逐渐加入半胱氨酸溶液的体积为0、10、30、60、90、120、150μl，同时在荧光光谱仪上测定503nm处荧光强度为433、446、471、516、560、609、639，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：f503＝1.418c 431.545，c的单位为10-6mol/l；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。
9.如权利要求1所述的一种苯并吡喃氧鎓离子-香豆素衍生物bpc在二氧化硫检测中的应用。
10.一种检测二氧化硫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，用亚硫酸钠配制2mm的二氧化硫水溶液，将权利要求1所述的bpc溶于dmso配制成2mm的溶液；
(2)、取2ml的dmso/pbs(v/v＝1:9,ph＝7.4)溶液、10μlbpc的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样亚硫酸钠的加入，637nm处的荧光强度迅速减弱；
(3)、用蒸馏水配制2mm的二氧化硫溶液，按体积比9:1将pbs缓冲溶液和dmso溶液加到2ml荧光比色皿中，逐渐加入亚硫酸钠溶液的体积为0、10、20、30、40μl，同时在荧光光谱仪上测定637nm处荧光强度为427、310、208、98、20，以二氧化硫浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到二氧化硫浓度的工作曲线；线性回归方程为：f637＝-10.260c 418.228，c的单位为10-6mol/l；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得二氧化硫的浓度。
技术总结