本发明涉及天然产物中靶向活性分子的发现及应用，具体地说是天然产物中α1a-肾上腺素受体新拮抗剂的发现及应用，所述的α1a-肾上腺素受体的新天然拮抗剂包括黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、木犀草素、四氢小檗碱、槲皮素化合物及它们药学上可接受的成盐化合物。所述应用包括治疗高血压病、心绞痛、下尿路综合症、慢性盆底疼痛综合征、男性避孕、慢性非细菌性前列腺炎及前列腺增生等疾病中的一种或两种以上。
背景技术：
α1a肾上腺素受体(α1a-ar)是g蛋白偶联受体中家族成员，广泛分布于许多组织，如大脑、心脏、血管、肝脏、肾脏、前列腺和脾脏，并介导多种生理功能如神经传递、血管收缩、心脏变时变力作用、糖原分解等，具有调节心血管系统和中枢神经系统活动的功能。在血压调控方面，gnus,j1等通过测试兔子主动脉收缩发现，相比于α1b和α1d肾上腺素受体，突触前α1a肾上腺素受体是使血管收缩的最有效因素，说明选择性α1a肾上腺素受体可以更有效的用来治疗高血压2。在心绞痛方面，harris等提出硝酸盐或者α1a肾上腺素受体拮抗剂来治疗那些对钙离子通道阻滞剂不敏感的心绞痛患者3。在下尿路综合征和良性前列腺增生中，特异性α1a肾上腺素受体拮抗剂，如西洛多辛和坦索罗辛，用于治疗这类疾病有良好疗效4。在男性避孕方面，hellstrom5的研究表明坦洛新可以导致健康男性精子密度和精子总数的减少；刘运星6等通过临床实验发现所有服用坦洛新的受试者均发生了不射精症，且服药组均出现性欲、性高潮的减退，但是未见明显的不良反应，故α1a肾上腺素受体拮抗剂坦洛新有男性抗生育的作用，可以作为安全、有效、可逆的男性节育药7。在治疗慢性盆底疼痛综合征方面，sundaodong8等发现坦索罗辛联合氯丙嗪可以有效松弛前列腺尿道平滑肌，有效缓解患者焦虑情况，从而改善慢性盆底疼痛综合征。在慢性非细菌性前列腺炎方面，yang,yu9等发现膀胱炎患者的膀胱逼尿肌和后尿道中α1a亚型的mrna表达明显高于对照组前列腺炎患者。
天然产物是药物发现、发展的重要来源，其含有结构丰富的化合物，是发现先导化合物的重要源泉。据统计，目前约30％～40％的药物直接或间接来源于天然产物，如具有镇痛作用的吗啡、抗疟疾的青蒿素、抗肿瘤的紫杉醇、抗高血压的利血平及具有降糖作用的阿卡波糖等。近年来研究表明，中药在前列腺增生、变异性心绞痛及高血压具有很好的疗效，如野菊花栓局部给药，可通过直肠快速吸收，并可长时间直接作用于前列腺及周围组织，改善局部微循环，加强局部组织的新陈代谢，软化纤维组织，调整局部生理功能，促进前列腺炎症消退和修复；黄连可延长动作电位时程和有效不应期，可消除折返从而发挥抗心律失常的作用；参麦、刺五加、丹参、灯盏花和黄芪注射液对缓解心绞痛及血压都有一定的疗效。鉴于中药在前列腺疾病和心血管疾病的治疗效果与α1a-ar受体拮抗剂和前列腺疾病、变异性心绞痛及高血压的相关性，本发明将从中药化合物中寻找新型的α1a-ar受体拮抗剂，为安全高效的前列腺和心血管疾病药物的开发奠定基础。
目前，关于本发明发现黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、木犀草素、四氢小檗碱、槲皮素的拮抗α1a肾上腺素受体活性尚未报道。
参考文献：
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技术实现要素：
本发明提供了5个涉及天然产物中α1a-肾上腺素受体新拮抗剂或其药学上可接受的盐，其结构如下：
本发明所说的盐是指药学上可接受的盐，例如与磷酸，硫酸，盐酸，柠檬酸和琥珀酸等酸形成的盐，或者与氢氧化钠，氢氧化钾形成的盐。
本发明还提供了这几个天然化合物对α1a-肾上腺素受体的拮抗作用强弱。目前研究表明α1a-肾上腺素受体拮抗剂在治疗治疗高血压病、变异性心绞痛、充血性心力衰竭、下尿路综合症、男性避孕、慢性非细菌性前列腺炎及前列腺增生等疾病具有很好的临床疗效，据此本发明提到的α1a-肾上腺素受体的新天然拮抗剂为这些相关疾病的药物开发提供了候选化合物。
附图说明
图1a-激动剂a61603hydrobromide在hek293-α1a细胞上的实时dmr响应信号；b-a61603hydrobromide在hek293-α1a细胞上的激动剂量响应曲线、a61603hydrobromide的脱敏剂量响应；c-rs100329hydrochloride在hek293-α1a细胞上的实时dmr响应信号；d-拮抗剂rs100329hydrochloride在hek293-α1a细胞上的剂量响应曲线；
图2a-天然化合物在hek293-α1a细胞上的dmr响应信号(上)；b-化合物预处理1h后，10nma61603hydrobromide在hek293-α1a细胞上的dmr响应信号(下)；
图3a-蝙蝠葛苏林碱在hek293-α1a细胞上的剂量响应曲线(上左)；b-蝙蝠葛苏林碱预处理1h后，10nma61603hydrobromide在hek293-α1a细胞上的dmr响应信号(上右)；c-不同浓度的黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、木犀草素、四氢小檗碱、槲皮素预处理1h后，10nma61603hydrobromide在hek293-α1a细胞上的剂量响应曲线(下左)。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：α1a-肾上腺素受体筛选模型的构建
材料：a61603hydrobromide、rs100329hydrochloride购于tocris公司；天然化合物购于上海源叶生物科技有限公司，hek293-α1a细胞为本实验顺转所得。检测平台为康宁第三代
鉴于转染的hek293-α1a细胞高表达α1a-肾上腺素受体，α1a-肾上腺素受体的选择性激动探针为a61603hydrobromide，拮抗探针为rs100329hydrochloride。本发明首先基于无标记细胞整合药理学技术，在hek293-α1a细胞上使用探针a61603hydrobromide和rs100329hydrochloride建立激动分析、脱敏分析和拮抗分析的模型，为后续天然化合物的筛选奠定基础。将处于对数生长期的hek293-α1a细胞，分别接种于384孔的细胞板的不同孔中，每孔的接种体积为40μl，每孔接种的细胞数目为2.5×104个，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养24h，至细胞融合度达95％左右，进行激动、脱敏和拮抗实验。激动分析是将不同浓度的a61603hydrobromide作用于hek293-α1a细胞，浓度分别为100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm、1.562nm、0.781nm、0.391nm、0.195nm、0.098nm、0.049nm、0.024nm和0.012nm，实时监测a61603hydrobromide的dmr响应信号；脱敏分析为不同浓度的a61603hydrobromide预处理hek293-α1a细胞1h后，浓度分别为100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm、1.562nm、0.781nm、0.391nm、0.195nm、0.098nm、0.049nm、0.024nm和0.012nm，再加入恒定浓度10nm的a61603hydrobromide，实时检测脱敏的dmr响应信号；拮抗分析为不同浓度的rs100329hydrochloride预处理hek293-α1a细胞1h后，浓度分别为1000nm、500nm、250nm、125nm、62.5nm、31.25nm、15.62nm、7.81nm、3.91nm、1.95nm、0.98nm、0.49nm和0.12nm，再加入恒定浓度10nm的a61603hydrobromide，实时监测拮抗的dmr响应信号。所获得的α1a-肾上腺素受体的dmr特征谱见图1a，激动分析、脱敏分析的dmr剂量曲线见图1b,拮抗分析的dmr剂量曲线见图1c。从图1a中可以看出，α1a-肾上腺素受体的典型dmr信号特征为先产生dmr正信号最后达到一定的平台。由图1b和图1d可以得出，a61603hydrobromide激动分析的ec50值、a61603hydrobromide脱敏分析的ic50值和snap5089拮抗的a61603hydrobromideic50值分别为0.14±0.04nm、0.11±0.05nm和69.3±11.9nm。
实施例2：天然化合物在α1a-肾上腺素受体模型上的初步筛选
将处于对数生长期的hek293-α1a细胞，分别接种于384孔的细胞板的不同孔中，每孔的接种体积为40μl，每孔接种的细胞数目为2.5×104个，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养24h，至细胞融合度达95％左右，再进行实验。首先监测待筛选化合物(终浓度为100μm)作用于hek293-α1a细胞的响应信号；然后使用a61603hydrobromide(终浓度为10nm)处理hek293-α1a细胞，监测待测化合物对a61603hydrobromide在hek293-α1a细胞上响应信号的影响。
将所有化合物以100μm的终浓度作用于hek293-α1a细胞，产生的dmr响应信号强度见图2a；化合物预处理hek293-α1a细胞1h后，加入10nm的a61603hydrobromide的dmr响应信号强度见图2b。根据α1a-肾上腺素受体拮抗剂的判断依据——化合物本身没有明显的dmr响应强度且能降低a61603hydrobromide的dmr响应强度，即在图2a中没有明显的dmr响应强度且在图2b中的dmr响应强度<100pm。从图2b中可以看出23-乙酰泽泻醇b(no.5)、异甘草素(no.16)、甘草素(no.17)，木犀草素(no.34)、知母皂苷a3(no.36)山楂酸(no.37)、蝙蝠葛苏林碱(no.42)，黄芩素(no.55)、柚皮素(no.56)、槲皮素(no.61)，柴胡皂苷a(no.70)、羟基红花黄色素a(no.85)、藁本内酯(no.102)、益母草碱(no.114)、水飞蓟宾(no.115)、姜黄素(no.119)、白藜芦醇(no.120)、冬凌草甲素(no.130)、冬凌草乙素(no.136)、辛弗林(no.144)、白术内酯(no.167)、岩白菜素(no.172)、西瑞香素(no.173)、海罂粟碱(no.183)、四氢小檗碱(no.185)共25个化合物可以显著降低a61603hydrobromide的dmr响应信号。从化合物本身响应信号图2a中可以看出在这些化合物中除辛弗林外，其余化合物都没有明显的dmr信号，但辛弗林为已知的α1a受体激动剂。在拮抗强度表征实验中，除木犀草素(no.34)、蝙蝠葛苏林碱(no.42)，黄芩素(no.55)、槲皮素(no.61)、海罂粟碱(no.183)、四氢小檗碱(no.185)这6个化合物在剂量曲线中可以完全脱敏，其余化合物都不可以完全脱敏，故计算不出其ic50值。但是这6个化合物中海罂粟碱(no.183)活性已被报道，后续不再赘述。
实施例3：活性化合物对α1a-肾上腺素受体的拮抗强度表征
将木犀草素、蝙蝠葛苏林碱、骆驼蓬碱、黄芩素、槲皮素和四氢小檗碱作用于hek293-α1a细胞，每个化合物的浓度梯度都为200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm、0.7813μm、0.3906μm、0.1953μm、0.0977μm、0.0488μm和0.0244μm，化合物蝙蝠葛苏林碱本身的dmr信号图谱见图3a，化合物预处理1h后，加入10nm的a61603hydrobromide的dmr信号图谱见图3b。其他化合物的dmr谱图与蝙蝠葛苏林碱相似。木犀草素、蝙蝠葛苏林碱、骆驼蓬碱、黄芩素、槲皮素和四氢小檗碱的剂量曲线见图3c。从图3a和3b中可以看出，化合物本身没有dmr信号而能呈剂量依赖的拮抗a61603hydrobromidedmr信号，从图3c和图3d计算的木犀草素、蝙蝠葛苏林碱、黄芩素、槲皮素和四氢小檗碱的ic50值分别为：91.6±8.3um、74.3±7.4um、64.0±15.6um、133.5±25.3um、≈80um，其中ic50值越低表明化合物对α1a-肾上腺素受体的拮抗作用越强，因此上述化合物对α1a-肾上腺素受体的拮抗作用强弱顺序为黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、四氢小檗碱、木犀草素、槲皮素。
1.一种α1a-肾上腺素受体拮抗剂，其特征在于：含有下述物质中的一种或二种以上为活性成分：木犀草素、蝙蝠葛苏林碱、黄芩素、槲皮素、四氢小檗碱、木犀草素药学上可接受的盐、蝙蝠葛苏林碱药学上可接受的盐、黄芩素药学上可接受的盐、槲皮素药学上可接受的盐、四氢小檗碱药学上可接受的盐。
2.按照权利要求1所述的拮抗剂，其特征在于：所述的拮抗剂还包括有药物学上可接受的载体和/或赋形剂。
3.按照权利要求1所述的拮抗剂，其特征在于：所述化合物对α1a-肾上腺素受体的拮抗作用强弱顺序为黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、四氢小檗碱、木犀草素、槲皮素。
4.按照权利要求1所述的拮抗剂，其特征在于：所述化合物黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、木犀草素、四氢小檗碱和槲皮素对α1a-肾上腺素受体的拮抗活性在细胞水平的ic50值分别为64.0±15.6μm、74.8±7.4μm、91.6±8.3μm、117.5±41.2μm和133.5±25.3μm。
5.按照权利要求1所述的拮抗剂，其特征在于：所述化合物黄芩素、蝙蝠葛苏林碱、木犀草素、四氢小檗碱、槲皮素均来自天然产物中。
6.按照权利要求1所述的拮抗剂，其特征在于：所述药学上可接受的盐是指对应物质的k盐和/或na盐。
7.下述物质作为α1a-肾上腺素受体拮抗剂或在制备α1a-肾上腺素受体拮抗剂的应用，其特征在于：含有下述物质中的一种或二种以上为活性成分：木犀草素、蝙蝠葛苏林碱、黄芩素、槲皮素、四氢小檗碱、木犀草素药学上可接受的盐、蝙蝠葛苏林碱药学上可接受的盐、黄芩素药学上可接受的盐、槲皮素药学上可接受的盐、四氢小檗碱药学上可接受的盐。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药学上可接受的盐是指对应物质的k盐和/或na盐。
9.一种权利要求1-6任一所述α1a-肾上腺素受体拮抗剂在制备下述疾病药物中的应用，其特征在于：包括高血压病、心绞痛、下尿路综合症、慢性盆底疼痛综合征、男性避孕、慢性非细菌性前列腺炎及前列腺增生等疾病中的一种或二种以上病症的临床治疗药物。
10.一种治疗疾病的药物，其特征在于：以权利要求1-6任一所述α1a-肾上腺素受体拮抗剂为活性成分，包括高血压病、心绞痛、下尿路综合症、慢性盆底疼痛综合征、男性避孕、慢性非细菌性前列腺炎及前列腺增生等疾病中的一种或二种以上病症的临床治疗药物。
技术总结