本发明属于天然药物化学领域，更具体的涉及一种新双黄酮化合物云璟素及其制备方法和作为grr35激动活性成分，用于治疗与其相关疾病如糖尿病、心力衰竭、高血压、冠状动脉疾病、哮喘、疼痛、早发性炎症性疾病、炎症和癌症等用途
背景技术：
黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。主要以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性。能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、抗肿瘤等药理作用。双黄酮是其中的一个亚型，大量研究表明，这类化合物具有良好的药理作用，包括抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等，具有潜在的应用价值。目前，从植物中分离获得的双黄酮化合物大约有80余种，按其连接类型，主要分为三类，c-c连接，c-o-c连接，c-c-c连接。其中，以c-c-c方式连接的化合物发现最少。因此，从天然产物中分离获得具有新结构的双黄酮类化合物是有意义也是具有挑战的。
太行崖柏是柏科侧柏属植物，主要分布在太行山脉一带。它与传统的侧柏在枝叶和树干等形态上极其相似，有些研究者认为其就是侧柏，但也有很多人认为其与普通的侧柏不同。侧柏是传统的中药，具有止血凉血、清肺止咳、生发乌发等多种功效。据报道，侧柏的主要成分为黄酮、萜类、多糖及挥发油等。目前，从侧柏中已经分离获得了多种双黄酮成分比如阿曼托黄素、扁柏双黄酮等。而对于太行崖柏，一方面，其生长环境较普通的侧柏苛刻，多生长在悬崖的岩石缝隙中，经过自然作用，在成分上会有一定的特殊性。另一方面，险峻的地理环境也造成了对该药材的获取有一定的难度，因此，尚未见有关太行崖柏化学成分极其药理作用的报道。因此，从太行崖柏中分离获得一些结构新颖的化学成分，在此基础上，再继续深入研究其作用机制，将对化合物的临床应用提供重要的导向。
gpr35受体是g蛋白偶联受体家族中的1个孤儿受体[1](genomics47,310–3131998)，主要在包括人免疫细胞如白细胞、单核细胞、中性粒细胞、t细胞和树突细胞等免疫细胞，胰腺，小肠，结肠和脾脏等组织中高表达。与糖尿病、心力衰竭和高血压、冠状动脉疾病、哮喘、疼痛、早发性炎症性疾病、炎症和癌症等疾病密切相关(trendsinpharmacologicalsciences,may2011,vol.32,no.5)。在阐明gpr35受体的生物学和药理学的研究中发现了多种化学类型的gpr35受体激动剂，其中包括犬尿喹啉酸、磷酸二酯酶-5抑制剂、敏喘宁、2-油酰lpa和各种酪氨酸代谢产物包括迷迭香酸、5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(dhica)。然而大部分配体基于gpr35受体活性都不是很高，因此，寻找gpr35的高效配体对研究gpr35的生理学及生物学功能有着极其重要的意义，这将为化合物的新临床应用提供导向。
目前，关于太行崖柏的化学成分没有相关报道，与本化合物结构相似的化合物报道也极其少。因此，该双黄酮化合物的结构具有一定的新颖性，并且相似结构的gpr35激动剂化合物也未见相关报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种结构新颖的双黄酮化合物，或其晶型、或其手性异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，其结构通式(a)如下：
其中：
r1～r20分别独立地选自为氢、卤素、羟基、烷氧基、糖基、c1～c6的烷基、c1～c6的烯基等。
进一步地，r1选自氢或羟基。
进一步地，r3、r4、r7、r8、r13、r18选自羟基，所述式(a)化合物如式(b)所示
进一步地，r2、r5、r6、r9、r11、r12、r14、r15、r16、r17、r19、r20均为氢，所述式(b)化合物如式(c)所示：
进一步地，r10选自羧基，所述化合物如式(ⅰ)所示：
进一步地，所述化合物(ⅰ)对应的异构体具有以下几种构型：
本发明还提供一种制备上述化合物(ⅰ)的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)药材提取：太行崖柏刨花状药材1公斤～20公斤，每公斤药材加入5～20升纯水，30℃～90℃加热回流提取1～3小时，趁热滤过，再重复提取1～3次，趁热过滤，合并滤液得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液采用c18ye填料(5～60um)的反相柱进行分离纯化，采用体积比为0～100：90～10的乙醇/水溶液洗脱，得到馏分f1～f6；
(3)将步骤(2)所得馏分f2进行常压硅胶柱层析，溶剂体系为二氯甲烷/甲醇/水(9:1:0～5:5:0)洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，得到5个子馏分f2-a～f2-e；
(4)将步骤(3)所得子馏分f2-d再次进行常压硅胶柱层析，溶剂体系为二氯甲烷/甲醇/水(8:1:0～6:4:0)洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，得到4个子馏分f2-d-a～f2-d-d；
(5)将步骤(4)所得子馏分f2-d-c经过反相制备级hplc制备，色谱柱为常规c18固定相(5～60μm，20×250～50×250mm)，流动相a为(0％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40分钟，5％a～95％a，共得到10个子馏分，分别为f2-d-c-1～f2-d-c-10；
(6)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-6经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～30分钟，95％a～50％a，，得到式1化合物，命名为云璟素a；
(7)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-7经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0％～1％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～50分钟，95％a～10％a，得到式2化合物，命名为云璟素b；
(8)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-8经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～2％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40分钟，95％a～60％a，得到式3化合物，命名为云璟素c；
(9)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-9经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～1％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～30分钟，95％a～50％a，得到式4化合物，命名为云璟素d；
本发明中：所述糖基是指包括但不限于葡萄糖基、葡萄糖醛酸基、甘露糖基、半乳糖基、阿洛糖基、果糖基、山梨糖基、夫糖基、鼠李糖基、鸡纳糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、木糖基、核糖基，以及由上述单糖所形成的的各种二糖基及多糖基；所述c1～c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基；c1～c6的烯基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烯基，具有1～6个双键的直链或支链的烯基。
本发明的另一个目的是，提供一种新双黄酮化合物云璟素，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物作为活性成分，或由所述的任一种或几种作为gpr35激动剂的药物组合物在制备预防和/或治疗疼痛、炎症和肿瘤等相关疾病药物中的应用。所述疾病包括但不限于疼痛、炎症和肿瘤等。所述与gpr35受体相关疾病包括但不限于糖尿病、高血压、心力衰竭、冠状动脉疾病、哮喘、疼痛、早发性炎症性疾病、炎症、和癌症等；所述疼痛疾病包括但不限于创伤性疼痛、神经病理性疼痛、癌痛、精神(心理性)疼痛，优选的为炎性疼痛、癌痛；所述炎症疾病包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)，优选的为肠炎、病毒性肝炎、中毒性心肌炎、流行性乙型脑炎；所述肿瘤疾病包括但不限于结肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等。
所述药物组合物是指本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。本发明中药物组合物中活性成分(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，活性化合物的剂量或浓度在一个较宽的范围内调节，活性化合物的含量范围为药物组合物的1％～90％。
显然，根据本发明的上述内容，按照本科领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1化合物的制备流程图
图2化合物ⅰ的esi-一级质谱图
图3化合物ⅰ的1hnmr谱图
图4化合物ⅰ的13cnmr谱图
图5化合物ⅰ的h,h-cosy和hmbc相关
图6化合物1、2、3、4作用于ht-29细胞产生的正向dmr响应信号(a)化合物预处理ht-29细胞1h后，1μm的敏喘宁在ht-29细胞上的dmr响应信(b)
图7经不同浓度的化合物1、2、3、4作用于ht-29细胞的剂量响应曲线
图8经化合物预处理ht-29细胞1h之后，1μm的敏喘宁在ht-29细胞上的剂量响应曲线
图9经不同浓度ml145预处理10min后，化合物1、2、3、4在ht-29细胞上的剂量响应曲线
图10化合物i的结构式
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明而不是本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。
本发明式(ⅰ)化合物的制备实施例：
化合物制备
太行崖柏药材50公斤，由河北云璟生物科技有限公司提供
(1)药材提取：太行崖柏刨花状药材5kg，每公斤药材加入纯水10l,90℃加热回流提取1.5小时，趁热滤过，再重复提取1次，趁热过滤，合并2次滤液得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液采用反相制备柱(c18ye填料，60um)进行粗分，依次用体积比10：90、60:40、50:50、90:10的乙醇-水洗脱，分别得到馏分f1、f2、f3、f4；
(3)将步骤(2)所得馏分f2进行常压硅胶柱层析，依次采用体积比为9:1:0.1、8:2:0.2、7:5:0.5、6:4:0.4的二氯甲烷:甲醇:水洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，得到4个子馏分f2-a、f2-b、f2-c、f2-d；
(4)将步骤(3)所得子馏分f2-d再次进行常压硅胶柱层析，依次采用体积比为8:1、8:2:0.2、7:0.5、6:4:0.4的二氯甲烷:甲醇:水洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，分别得到4个子馏分f2-d-a、f2-d-b、f2-d-c、f2-d-d；
(5)将步骤(4)所得子馏分f2-d-c经过反相制备级hplc制备(10μm，20×250mm，常规c18色谱柱)，流速20ml/min，流动相为乙腈和水(含1％甲酸)，洗脱梯度为0min～10min，10％～20％乙腈；10min～40min，20％～50％乙腈；40min～50min，50％～90％乙腈，共得到10个子馏分，分别为f2-d-c-1～f2-d-c-10；(6)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-6经过制备级hplc制备(5μm，10×250mm，亲水型色谱柱)，使用流速3ml/min，80％的乙腈(含0.1％甲酸)等度洗脱，得到式1化合物：云璟素a；
(7)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-7经过反相制备级hplc制备(5μm，10×250mm，亲水型色谱柱)，流速3ml/min，流动相a为乙腈(含0.1％甲酸)，b为纯水(含1％甲酸)，洗脱梯度为0～30分钟，90％～75％乙腈(含0.1％甲酸)；30～50分钟，75％a～30％a，得到式2化合物：云璟素b；
(8)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-8经过反相制备级hplc制备(5μm，10×250mm，亲水型色谱柱)，流速3ml/min，流动相a为乙腈(含1％甲酸)，b为纯水(含1％甲酸)，洗脱梯度为0～40分钟，92％a～90％a(含1％甲酸)，得到式3化合物：云璟素c；
(9)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-9经过反相制备级hplc制备(5μm，10×250mm，亲水型色谱柱)，使用流速3ml/min，流动相a为乙腈(含1％甲酸)，b为纯水(含1％甲酸)，95％a～70％a等度洗脱，得到式4化合物：云璟素d；
(10)化合物信息如下：
化合物1：1mg，c32h26o12，mw：602，白色粉末，溶于甲醇
化合物2：1.5mg，c32h26o12，mw：602，白色粉末，溶于甲醇
化合物3：3mg，c32h26o12，mw：602，白色粉末，溶于甲醇
化合物4：2.3mg，c32h26o12，mw：602，白色粉末，溶于甲醇
1h-nmr(cd3od,600mhz)δ4.65(1h,d,j＝11.7hz,h-2)，4.36(1h,d,j＝11.7hz,h-3)，5.72(1h,s,h-8)，3.34(1h,d,j＝14.1hz,h-11)，3.27(1h,d,j＝14.1hz,h-11)，4.02(1h,d,j＝17.2hz，h-13)，3.48(1h,d,j＝17.2hz，h-13)，7.85(2h,d,j＝8.6hz，h-16/h-20)，6.82(2h,d,j＝8.6hz，h-17/h-19)，6.91(1h,d,j＝1.8hz,h-2′)，6.77(1h,d,j＝8.0hz,h-5′)，6.80(1h,dd,j＝8.0hz,1.8hz,h-6′)，7.16(2h,d,j＝8.8hz，h-2″/h-6″)，6.69(2h,d,j＝8.8hz，h-3″/h-5″)。
活性试验实施例：
材料上述制备的4个新化合物；ht-29细胞购于中国科学院上海细胞库；敏喘宁购于sigma公司。检测平台为康宁第三代
材料上述制备的4个新化合物；ht-29细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；敏喘宁购于sigma公司。检测平台为康宁第三代
将处于对数生长期的ht-29细胞，接种于384孔的细胞板的不同孔中，每孔的培养液体积为40μl，接种密度为3.0×104个/孔，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20-22h，至细胞融合度达95％左右，ht-29细胞进行活性实验。
将4个新化合物1、2、3、4以10μm的浓度作用于ht-29细胞(图6a)，结果显示化合物1、2、3和4在ht-29细胞上产生不同程度的正向dmr信号，且与gpr35激动剂敏喘宁在ht-29细胞上的dmr信号类似。各化合物预处理ht-29细胞1h后，加入浓度1μm的gpr35激动剂敏喘宁继续监测1h，结果如图6b所示，化合物1、2、3和4对敏喘宁有不同程度的脱敏效果，由此推测化合物1、2、3和4可能是gpr35受体激动剂。
通过上述实验结果，推断化合物1、2、3和4的作用靶点为gpr35受体，本次实验从激动、脱敏和拮抗三个角度去验证分析。
首先是激动分析，将化合物1、2、3和4作用于ht-29细胞，每个化合物的浓度梯度都为100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm,1.563μm,0.781μm,0.391μm,0.195μm,0.098μm,0.049μm,0.024μm,0.012μm,结果如图7所示，化合物1、2、3和4的剂量响应曲线是单相“s”型，并且都达到饱和响应，对应的ec50值分别为15.73±2.03μm、85.22±15.23μm、39.89±4.67μm和17.85±1.05μm。化合物1、2、3和4的作用效能(efficacy)的强弱顺序是1>4>3>2。
然后使用脱敏分析的方法验证化合物1、2、3和4作用于gpr35受体的特异性。不同浓度的化合物1、2、3和4(浓度梯度都为100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm,1.563μm,0.781μm,0.391μm,0.195μm,0.098μm,0.049μm,0.024μm,0.012μm)预处理ht-29细胞1h之后，再加入1μm的敏喘宁继续监测1h，结果如图8所示，化合物1、2、3和4对gpr35受体激动剂敏喘宁的脱敏都呈现剂量依赖性。而且化合物1、2、3和4能在高浓度时将敏喘宁的dmr响应信号脱敏至最小，对应的ic50值分别为4.64±0.49μm、64.91±21.76μm、41.03±10.05μm、15.41±2.23μm。
最后使用拮抗分析方法验证化合物1、2、3和4作用于gpr35受体的特异性。ht-29细胞经gpr35受体的拮抗剂ml145预处理10min之后，ml145的浓度梯度为100μm,25μm,6.25μm,1.563μm,0.391μm,0.098μm,0.024μm，再加入浓度为ec80的化合物1、2、3和4(分别是8μm、40μm、20μm和10μm)，结果如图9所示。高浓度的ml145能够完全抑制化合物1、2、3和4的dmr响应信号，其ic50值分别为7.53±1.16μm、52.85±20.13μm、43.82±14.00μm和14.30±5.56μm，由此可见化合物1、2、3和4是gpr35激动剂。
通过激动分析、脱敏分析和拮抗分析三个实验表明gpr35受体是化合物1、2、3和4的作用靶点，且活性强弱顺序是1>4>3>2。
目前的研究表明gpr35受体与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，根据靶点与疾病的关联关系，可拓宽4个新双黄酮化合物的临床应用范围。
1.一种新双黄酮类化合物，其结构通式如式(a)所示；所述通式(a)为新双黄酮类化合物，或其晶型、或其手性异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物；
其中：
r1～r20分别独立地选自为氢、卤素、羟基、羧基、烷氧基、糖基、c1～c6的烷基、c1～c6的烯基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：r1选自氢或羟基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：r1、r3、r4、r7、r8、r13、r18选自羟基，所述式(a)化合物如式(b)所示：
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于：r2、r5、r6、r9、r11、r12、r14、r15、r16、r17、r19、r20均为氢，所述式(b)化合物如式(c)所示
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于：r10选自羧基、糖基或c1～c6的烷基。
6.根据权利要求1～5所述的化合物，其特征在于：所述化合物如式(ⅰ)所示：
7.根据权利要求6所述的化合物，其特征在于：所述化合物(ⅰ)构型如下式所示：
8.一种制备权利要求7所述化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)药材提取：太行崖柏刨花状药材1公斤～20公斤，每公斤药材加入5～20升纯水，30℃～90℃加热回流提取1～3小时，趁热滤过，再重复提取1～3次，趁热过滤，合并滤液得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液采用c18ye填料(5～60um)的反相柱进行分离纯化，采用体积比为0～100：90～10的乙醇/水溶液洗脱，得到馏分f1～f6；
(3)将步骤(2)所得馏分f2进行常压硅胶柱层析，溶剂体系为二氯甲烷/甲醇/水(9:1:0～5:5:0)洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，得到5个子馏分f2-a～f2-e；
(4)将步骤(3)所得子馏分f2-d再次进行常压硅胶柱层析，溶剂体系为二氯甲烷/甲醇/水(8:1:0～6:4:0)洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，得到4个子馏分f2-d-a～f2-d-d；
(5)将步骤(4)所得子馏分f2-d-c经过反相制备级hplc制备，色谱柱为常规c18固定相(5～60μm，20×250～50×250mm)，流动相a为(0％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40分钟，5％a～95％a，共得到10个子馏分，分别为f2-d-c-1～f2-d-c-10；
(6)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-6经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～30分钟，95％a～50％a，，得到式1化合物，命名为云璟素a；
(7)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-7经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0％～1％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～50分钟，95％a～10％a，得到式2化合物，命名为云璟素b；
(8)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-8经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～5％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～2％)甲酸-水，洗脱梯度为0～40分钟，95％a～60％a，得到式3化合物，命名为云璟素c；
(9)将步骤(5)所得子馏分f2-d-c-9经过制备级hplc制备，色谱柱采用亲水型色谱固定相，流动相a为(0.1％～1％)甲酸-乙腈，b为(0.1％～1％)甲酸-水，洗脱梯度为0～30分钟，95％a～50％a，得到式4化合物，命名为云璟素d。
9.权利要求1～7任一项所述化合物，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备预防和/或治疗糖尿病、高血压、心力衰竭、冠状动脉疾病、哮喘、疼痛、代谢综合症、炎症和癌症等相关疾病药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于：权利要求1～7任一项所述化合物，或其晶型、或其异构体、或其糖苷、或其药学形式上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
技术总结