本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种millepachine-ca-4衍生物及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用。
背景技术：
化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段，但是化疗药物对正常细胞的低选择性及肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性是影响化疗疗效和导致化疗失败的主要原因。微管广泛存在于真核生物细胞中，作为细胞骨架的关键成分，其主要作用是形成细胞纺锤体，维持细胞形态、细胞有丝分裂等。微管蛋白(tubulin)是由α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)构成的蛋白二聚体，因此抑制微管蛋白的聚集可以阻止纺锤体的形成，使得肿瘤细胞有丝分裂无法正常进行，从而使细胞周期受阻，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。2016年，《naturereviewsdrugdiscovery》发表的两篇论文统计分析了临床抗肿瘤药物研发的1554个靶点，tubulin在众多靶点研究中排名第二，这表明tubulin已成为抗肿瘤药物研发的重要靶点之一。
微管蛋白抑制剂(tubulinpolymerizationinhibitors，tpis)是一类作用于微管蛋白(tubulin)从而阻止细胞增殖的抗癌药物。天然产物一直是抗肿瘤药物研发的重要资源，目前临床上用于一线抗肿瘤的tips主要有紫杉烷类、爱博霉素类、喜树碱、长春碱类、以及日本研发成功近期在中国获批上市的艾日布林(eribulin)。但是，这些tpis往往具有来源珍贵、分子结构复杂且难以大规模合成等缺点，所以天然药物工作者们一直希望寻找到结构相对简单、易于化学合成、疗效优良的tips。
millepachine是一种从厚果崖豆藤中提取得到的具有苯并呋喃杂环结构的抗肿瘤活性的天然产物，其具有结构相对简单的特点，但抗肿瘤效果还需通过结构改造进一步改善。combretastatina-4(ca-4)是作用于tubulin的结构简单的顺式二苯乙烯“明星小分子天然产物”，是目前已知的tpis中活性最强的化合物之一。其磷酸二钠盐形式ca-4p已完成ⅲ期临床试验，拟作为抗甲状腺癌的孤儿药在欧洲上市；但是，后续临床试验结果表明ca-4p在高剂量下存在心血管毒性以及ca-4具有不稳定、易光解、易发生顺反异构化等缺点，目前fda已经中止其临床试验。ca-4自发现以来，研究者们一直致力于对其进行结构改造，药物化学家们已经设计并合成了约280000个化合物，以期找到活性更好，更有成药前景的先导化合物，其中二苯乙烯结构ca-4衍生物ombrabulin(ave8062)、二苯甲酮类ca-4衍生物bnc105p12等均进入临床研究阶段。
可见，millepachine及ca-4这两种天然产物具有结构简单、抗肿瘤活性优越的优点，但同时又具有不稳定、生物利用度差、有心血管毒性等缺点。本发明基于前期基础，通过将两种天然产物millepachine中的苯并呋喃杂环与ca-4中的二苯乙烯结构进行糅合，设计出一系列全新结构的millepachine-ca-4衍生物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种稳定性好、抗肿瘤活性高、毒副作用小的millepachine-ca-4衍生物，以克服ca-4在高剂量下存在心血管毒性以及ca-4具有不稳定、易光解、易发生顺反异构化、水溶性差等缺点。
本发明的另一目的在于提供上述millepachine-ca-4衍生物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种抗肿瘤的药物组合物，以millepachine-ca-4衍生物为活性成分。
本发明的再一目的在于提供上述millepachine-ca-4衍生物作为制备抗肿瘤药物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种millepachine-ca-4衍生物，其结构式如式i所示：
其中，ar为a、b或c三种不同取代的苯并吡喃杂环，x为o、s、nch3或se；y为c或o；r1为卤素、羟基、烷氧基、氨基或烷氨基；r2、r3、r4、r5独立的选自氢、羟基、氨基、卤素、三氟甲基、烷氧基或磷酸二钠盐。
所述烷氧基优选c1-c4的直链或支链的烷氧基；更优选为och3、och2ch3。
所述烷氨基优选c1-c3的直链或支链的烷氨基；更优选为nhch3、nch2ch3、n(ch3)2。
所述millepachine-ca-4衍生物的制备方法，包括下述步骤：
(1)苯并吡喃溴代中间体的合成：在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)及氯化亚铜存在条件下，3-氯-3-甲基-1-丁炔分别与不同取代的溴苯1/溴苯4/溴苯7发生亲核取代反应，分别得到中间体2/中间体5/中间体8；在60～80℃和吡啶存在条件下，中间体2/中间体5/中间体8发生分子内关环反应，分别得到苯并吡喃溴代中间体3/中间体6/中间体9；
(2)在正丁基锂存在条件下，苯并吡喃溴代中间体3/中间体6/中间体9分别与不同取代的苯甲醛10反应，得到二苯甲醇中间体11；然后经2-碘酰基苯甲酸(ibx)氧化，得到二苯甲酮中间体12；在正丁基锂(n-buli)存在条件下，二苯甲酮中间体12与甲基三苯基溴化磷进行witting反应，得到中间体13；
(3)在钯碳催化条件下，二苯甲酮中间体12或中间体13进行氢化还原反应，得到苯胺中间体14；在碳酸钾存在条件下，苯胺中间体14与卤代乙酰卤素(优选溴乙酰溴或氯乙酰氯)反应，得到目标化合物15；目标化合物15分别与不同取代的醇钠、氨水或不同取代的胺反应，分别得到酰胺侧链不同取代的目标化合物16/目标化合物17/目标化合物18。
步骤(1)中，3-氯-3-甲基-1-丁炔与溴苯的摩尔用量比为(1～3)：1，dbu与溴苯的摩尔用量比为(1～3)：1，反应条件为室温下搅拌5～10小时。
步骤(1)中，中间体2/中间体5/中间体8进行分子内关环反应的条件为60～80℃下回流反应8～12小时。
步骤(2)中，二苯甲醇中间体11的具体制备步骤为：在氩气保护下，将2～3摩尔份的苯并吡喃溴代中间体3/中间体6/中间体9溶于无水四氢呋喃(thf)中，并冷却至-60～-80℃，然后缓慢加入2～3摩尔份的正丁基锂，搅拌平衡0.5～1小时，再加入1摩尔份的不同取代的苯甲醛的thf溶液，继续搅拌12～24小时，反应完毕后，加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后粗品经柱层析分离，得到二苯甲醇中间体11。
步骤(2)中，二苯甲酮中间体12的制备步骤为：将1摩尔份的二苯甲醇中间体11溶于thf溶液中，搅拌条件下加入2～5摩尔份的2-碘酰基苯甲酸(ibx)粉末，搅拌5～10小时，tlc监测反应完毕后滤出沉淀，滤液浓缩得到粗产品，经柱层析分离得到二苯甲酮中间体12。
步骤(2)中，中间体13的制备步骤为：在氩气保护下，将2～3摩尔份的甲基三苯基溴化膦溶于无水thf中，将溶液冷却至-60～-80℃后缓慢滴加2～3摩尔份的n-buli，然后逐渐升至20～25℃后搅拌0.5～1小时，再次将混合物冷却至-60～-80℃后缓慢滴加1摩尔份的二苯甲酮中间体12的thf溶液，搅拌0.5～1小时后，逐渐升至20～25℃后搅拌12～24小时，tlc监测反应完毕后加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离得到中间体13。
步骤(3)中，苯胺中间体14的制备步骤如下：在1摩尔份的二苯甲酮中间体12或中间体13的thf溶液中，冰浴条件下加入10％-15％(g/g)的钯碳，氢气条件下反应6～12小时，然后过滤除去钯碳，滤液减压干燥后，粗品经柱层析分离，得到苯胺中间体14。
步骤(3)中，目标化合物15的制备步骤如下：将1摩尔份的苯胺中间体14溶于二氯甲烷(dcm)溶液中，加入8～10摩尔份的碳酸钾，室温下搅拌0.5～1小时后，在冰浴0～4℃条件下滴加5～10摩尔份的卤代乙酰卤素(优选溴乙酰溴或氯乙酰氯溶液)，继续反应4～8小时，tlc监测反应完毕后用乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物15。
步骤(3)中，目标化合物16的制备步骤如下：将1摩尔份的目标化合物15溶于甲醇中，加入2～5摩尔份的不同链长的醇钠(优选c1-c4醇钠)，50～80℃条件下回流搅拌5～12小时，tlc监测反应完毕后，用乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物16。
步骤(3)中，目标化合物17的制备步骤如下：将1摩尔份的目标化合物15溶于乙醇中，滴加5～10摩尔份的氨水溶液，室温下搅拌1～6小时，tlc监测反应完毕后用乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物17。
步骤(3)中，目标化合物18的制备步骤如下：将1～2摩尔份的目标化合物15溶解于丙酮中，搅拌条件下加入2～4摩尔份的碳酸钾，然后加入1～2摩尔份不同链长的盐酸胺，50～80℃下搅拌反应5～10小时，tlc监测反应完毕后，加入乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物18。
步骤(1)的反应式如下：
步骤(2)的反应式如下：
步骤(3)的反应式如下：
上式中，x’为卤素；16a-16c中r1为羟基或烷氧基；17a-17c中r1为氨基；18a-18c中r1为烷氨基。
一种抗肿瘤的药物组合物，含有治疗有效量的上述millepachine-ca-4衍生物或其药学上可接受的前药、盐、水合物、溶剂合物、晶型形式或非对映异构体为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。所述药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，包括赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂或表面活性剂。
所述的millepachine-ca-4衍生物和所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物主要用于冶疗肺癌、小细胞肺癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、长纤维细胞瘤、成神经管细胞瘤、急性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤等。
所述的millepachine-ca-4衍生物的施用量是根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病和严重程度等变化来采取不同的用量。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
(1)本发明的苯并呋喃杂环结构的millepachine-ca-4衍生物是一种新型的肿瘤微管蛋白抑制剂，是将两种天然产物结构进行糅合改造，得到抗肿瘤活性提高且对ca-4的缺点有明显改善的新型小分子化合物。
(2)本发明衍生物对多种肿瘤细胞有显著的抑制作用，对人肺癌细胞株a549的抗增殖抑制活性较millepachine相比提高了近250倍。
(3)本发明衍生物对人正常细胞毒副作用小，对多种人正常细胞株有较高的选择性，对正常细胞的毒性较ca-4p相比下降了近40倍。
(4)herg心脏毒性评价试验显示，本发明衍生物几乎没有心脏毒性，与阳性药ca-4p相比，安全性显著提高。
(5)肝微粒体代谢稳定性试验显示，本发明衍生物在肝微粒体中具有较好的代谢稳定性，t1/2长达4小时以上，是阳性药ca-4p的8倍左右。
(6)裸鼠移植瘤抗肿瘤试验显示，本发明衍生物的抑瘤率为78％，而阳性药物ca-4p的抑瘤率为38.5％，对照组化合物millepachine的抑瘤率仅为15.1％，结果表明新设计millepachine-ca-4衍生物抗肿瘤活性有了显著提高。
附图说明
图1为实验结束后处死小鼠图。
图2为实验结束后剥离小鼠肿瘤块图。
图3为给药期间各组小鼠肿瘤体积生长曲线。
图4为各组剥离肿瘤块重量图。
图5为各组动物体重图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明提供的a、b、c三个系列抗肿瘤化合物的合成方法，代表性化合物的合成如下：
实施例1.化合物a-1的制备
(1)中间体3：5-甲氧基-2,2-二甲基-2h-吡喃-苯甲醛的制备。
将商品化的原料1(1mmol)溶于10ml乙腈中，冰浴条件下搅拌依次加入dbu(2mmol)、3-氯-3-甲基-1-丁炔(1.5mmol)、氯化亚酮(0.1mmol)，搅拌8h后，加入稀盐酸调节ph＝2，然后加入乙酸乙酯萃取。有机相饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得粗产物，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，10:1)后，得到中间体2。
将中间体2(1mmol)溶于10ml吡啶中，70℃反应10小时后减压除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，10:1)后得到中间体3。黄色油状物，产率68％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.31(s,1h),7.69(d,j＝8.8hz,1h),6.64(d,j＝10.1hz,1h),6.49(d,j＝8.8hz,1h),5.64(d,j＝10.1hz,1h),3.89(s,3h),1.48(s,6h)。
(2)中间体12：(5-甲氧基-2,2-二甲基-2h-吡喃)(4-甲氧基-2-硝基)苯甲酮的制备
氩气保护下，将中间体3(2mmol)溶于无水thf(20ml)中，然后将溶液冷却至-78℃；然后将n-buli(2mmol)缓慢滴加到溶液中并搅拌0.5h，再滴加商品化的原料10(1mmol)的thf溶液。继续搅拌20h后，加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到粗产物中间体11。
将中间体11(1mmol)溶于thf(10ml)溶液中，分批加入ibx(3mmol)。室温搅拌8h后，滤出沉淀；滤液浓缩得粗产物，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，3：1)，得到中间体12，橙色固体，产率85％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.87(d,j＝7.5hz,1h),7.60(d,j＝7.5hz,1h),7.51(s,1h),7.27(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.52(d,j＝10.8hz,1h),6.45(d,j＝7.5hz,1h),5.20(d,j＝10.8hz,1h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),1.49(s,6h)。
(3)中间体(2-氨基-4-甲氧基)(5-甲氧基-2,2-二甲基-2h-吡喃)苯甲酮(14)的制备
将中间体12(500mg)溶于thf溶液中(3:1,60ml)，冰浴搅拌条件下加入10％(g:g)的钯碳粉末，氢气保护条件下，室温反应10小时后，tcl点板监测反应完全后，过滤除去钯碳，滤液减压除去溶剂得粗产物，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，10:1)后，得到中间体14。产率89％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.60(d,j＝7.5hz,1h),7.40(d,j＝7.5hz,1h),6.86(s,2h),6.72(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.53(d,j＝10.8hz,1h),6.48(d,j＝7.5hz,1h),5.77(s,0h),5.21(d,j＝11.0hz,1h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),1.51(s,6h)。
(4)目标化合物a-1的制备
将中间体14(1mmol)溶于10ml二氯甲烷中，冰浴条件下搅拌加入碳酸钾粉末(8mmol)，搅拌5min后缓慢滴加溴乙酰溴(8mmol)。体系缓慢升至室温反应5h，然后饱和碳酸氢钠溶液淬灭，dcm萃取三次；合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得粗产物，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，10：1)，得到目标化合物a-1。白色固体，产率78％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.90(s,1h),7.52(t,j＝7.7hz,2h),7.29(s,1h),6.85(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.66–6.35(m,2h),5.19(d,j＝11.0hz,1h),4.24(s,2h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),1.46(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ197.96,166.17,159.04,157.58,155.45,140.93,130.28,127.03,126.10,122.91,117.66,116.28,111.37,108.73,107.61,106.65,77.48,56.01,55.56,38.48,27.87。
化合物b-1、c-1与化合物a-1的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-1，白色固体，产率85％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.09(s,1h),7.47(d,j＝7.5hz,1h),7.37(d,j＝1.9hz,1h),7.21(d,j＝7.5hz,1h),7.05(d,j＝7.5hz,1h),6.69-6.55(m,1h),6.35(d,j＝11.0hz,1h),5.42(d,j＝10.8hz,1h),4.05(s,2h),3.95(s,3h),3.90(s,3h),1.58(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.38,166.17,155.01,148.82,141.48,140.93,131.77,130.82,125.74,124.95,122.91,120.11,111.75,108.73,106.65,76.73,56.47,56.10,29.72,27.67.
化合物c-1，白色固体，产率83％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.10(s,1h),7.85(d,j＝1.9hz,1h),7.35(d,j＝1.8hz,1h),6.83(d,j＝9.0hz,1h),6.28(d,j＝10.8hz,1h),5.64(d,j＝11.0hz,1h),3.92(s,2h),3.89(s,3h),3.59(s,3h),1.51(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.99,166.17,158.98,146.10,144.75,141.00,133.30,131.51,130.28,123.23,122.88,122.35,120.26,109.31,108.75,106.75,77.53,56.28,55.56,29.71,28.07.
实施例2.化合物a-2的制备
将化合物a-1(2mmol)溶解于干燥的甲醇中，室温搅拌条件下加入甲醇钠(6mmol)，回流反应8h，反应结束后，体系冷却至室温。加入乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥之后减压除去溶剂。粗品经柱层析纯化后得到目标物a-2。白色固体，产率73％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.24(s,1h),7.57(s,2h),7.27(d,j＝7.5hz,1h),6.85(d,j＝7.5,1h),6.66(d,j＝1.9hz,1h),6.47(d,j＝7.5hz,1h),5.23(d,j＝8.8hz,1h),4.10(d,j＝4.9hz,2h),3.95(s,3h),3.87(s,3h),2.87(t,j＝5.0hz,1h),1.44(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ197.80,171.54,159.04,155.17,152.77,140.60,134.73,127.03,126.10,122.91,117.66,115.30,111.37,108.73,107.61,106.65,77.48,61.00,56.27,55.93,27.87。
化合物b-2、c-2的合成方法与化合物a-2的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-2，黄色固体，产率72％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.50(s,1h),8.65(s,1h),7.33(d,j＝7.5hz,1h),6.93(d,j＝7.3hz,1h),6.69(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.63(d,j＝7.5hz,1h),6.26(d,j＝10.8hz,1h),5.22(d,j＝11.0hz,1h),4.16(s,2h),3.93(d,j＝11.1hz,6h),2.34(t,j＝4.9hz,1h),1.50(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ197.90,170.74,159.04,151.86,151.04,148.82,139.09,133.74,132.84,125.74,124.95,122.91,118.32,111.72,106.22,102.89,77.38,61.77,56.32,55.56,27.67。
化合物c-2，白色固体，产率73％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.30(s,1h),7.84(s,1h),7.45(d,j＝7.5hz,1h),7.33(s,1h),7.09(d,j＝1.9hz,1h),6.92(d,j＝8.3hz,1h),6.31(d,j＝9.9hz,1h),5.13(d,j＝10.8hz,1h),4.20(d,j＝2.9hz,2h),3.98(s,3h),3.91(s,3h),3.34(t,j＝5.0hz,1h),1.52(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ199.02,171.86,158.98,152.81,147.57,145.79,137.12,135.11,133.02,123.023,122.88,122.35,120.26,110.61,107.26,104.85,77.53,60.88,56.28,55.56,28.07.
实施例3.化合物a-3的制备
将化合物a-1(2mmol)溶解于乙醇(15ml)中，搅拌条件下加入25％nh3·h2o(8mmol)，室温反应3小时。反应结束后体系加入乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥之后减压除去溶剂。粗品经柱层析纯化后得到目标物a-3。白色固体，产率65％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.26(s,1h),7.92(s,2h),7.59(d,j＝7.5hz,1h),7.26(d,j＝7.5hz,1h),6.72(d,j＝9.5hz,1h),6.47(d,j＝8.6hz,1h),5.27(d,j＝10.8hz,1h),3.85(s,2h),3.83(s,3h),3.81(s,3h),1.54(s,2h),1.47(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ194.7,168.48,159.04,155.45,150.13,140.93,132.53,128.36,127.71,123.34,117.66,116.75,111.37,109.43,106.65,103.37,76.48,56.01,55.56,44.32,27.82。
化合物b-3、c-3的合成方法与化合物a-3的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-3，黄色固体，产率80％，1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ9.31(s,1h),8.62(s,1h),7.42(d,j＝8.2hz,1h),6.75(d,j＝7.5hz,1h),6.64(d,j＝7.3hz,1h),6.36(d,j＝4.4hz,1h),6.18(d,j＝11.0hz,1h),5.12(d,j＝11.0hz,1h),3.90(s,2h),3.85(s,6h),1.82(s,2h),1.69(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ195.35,169.46,159.04,150.65,148.33,141.13,132.03,131.31,129.81,125.74,124.15,122.01,119.05,116.30,109.66,107.06,77.38,56.32,56.12,45.41,27.63.
化合物c-3，白色固体，产率69％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.24(s,1h),8.05(s,1h),7.49-7.47(m,1h),7.09(d,j＝1.9hz,1h),6.80(d,j＝1.9hz,1h),6.77(d,j＝7.5,1.9hz,1h),6.37(d,j＝11.2hz,1h),5.57(d,j＝10.8hz,1h),3.96(s,3h),3.94(s,2h),3.92(s,3h),1.62(s,2h),1.54(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.73,168.90,158.98,146.71,143.82,140.24,134.26,131.20,130.49,123.52,122.88,121.75,120.77,109.31,107.90,105.25,78.03,56.28,55.20,44.74,28.31.
实施例4.化合物a-4、a-5、a-6的制备
将化合物a-1(2mmol)溶解于丙酮中，搅拌条件下加入碳酸钾(4mmol)，然后分别加入相应的盐酸甲胺/盐酸乙胺/盐酸二甲胺(2mmol)。70℃搅拌反应3h，反应结束冷却至室温，加入乙酸乙酯萃取。有机相饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，粗品经柱层析纯化后，分别得到相应的目标化合物a-4、a-5、a-6。
化合物a-4，黄色固体，产率86％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.55(s,1h),7.84(d,j＝1.9hz,2h),7.52-7.50(m,1h),7.40(d,j＝7.5hz,1h),6.72(d,j＝7.7hz,1h),6.56(d,j＝8.9hz,1h),5.34(d,j＝8.8hz,1h),3.94(s,3h),3.91(s,3h),3.25(s,2h),2.82(s,1h),2.53(s,3h),1.47(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.64,169.71,159.73,158.47,156.47,141.90,130.63,127.45,126.59,123.43,118.05,116.80,111.87,109.27,107.98,107.09,77.95,56.40,55.78,52.73,26.98,27.82。
化合物a-5，黄色固体，产率79％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.38(s,1h),8.33(s,2h),7.56(d,j＝7.5hz,1h),7.40(d,j＝7.5hz,1h),6.74(dd,j＝7.5,1.9hz,1h),6.62(d,j＝11.0hz,1h),5.28(d,j＝10.8hz,1h),3.95(s,3h),3.86(s,3h),3.55(s,2h),2.67(q,j＝8.0hz,2h),1.51(s,6h),1.13(t,j＝8.0hz,3h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ194.60,170.90,159.97,158.23,156.42,141.55,131.17,127.54,126.61,123.44,118.08,116.92,112.43,109.48,108.17,107.24,78.09,56.99,56.24,52.44,43.79,27.27,16.20。
化合物a-6，黄色固体，产率81％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.45(s,1h),8.06(d,j＝1.9hz,2h),7.56(d,j＝7.5hz,1h),7.38(d,j＝7.5hz,1h),6.75(dd,j＝7.4,1.9hz,1h),6.47(d,j＝10.8hz,1h),5.27(d,j＝11.0hz,1h),3.94(s,3h),3.87(s,3h),3.14(s,2h),2.58(s,6h),1.59(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.80,169.35,159.79,158.29,156.01,141.67,130.89,127.71,126.57,123.67,118.24,116.74,112.13,109.43,108.19,107.08,77.69,63.61,56.52,55.81,46.65,28.14。
化合物b-4、b-5、b-6、c-4、c-5、c-6的合成方法与化合物a-4、a-5、a-6的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-4，黄色固体，产率73％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.26(s,1h),8.13(d,j＝2.0hz,1h),7.39(d,j＝7.5hz,1h),6.97(d,j＝7.5hz,1h),6.90(d,j＝7.5hz,1h),6.74-6.72(m,1h),6.35(d,j＝10.8hz,1h),5.22(d,j＝11.0hz,1h),3.94(s,3h),3.86(s,3h),3.26(s,2h),2.63(s,3h),1.51(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ191.56,169.68,159.66,149.36,141.92,141.34,132.33,131.33,130.53,126.30,125.36,123.41,120.47,112.10,109.11,107.24,77.92,56.71,56.03,52.50,36.50,27.91.
化合物b-5，黄色固体，产率76％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.32(s,1h),8.16(s,1h),7.41(d,j＝7.5hz,1h),7.06(d,j＝3.8hz,1h),6.97(d,j＝3.8hz,1h),6.77(dd,j＝7.5hz,2.0hz,1h),6.38(d,j＝11.0hz,1h),5.22(d,j＝10.8hz,1h),3.92(s,3h),3.83(s,3h),3.52(s,2h),2.74(q,j＝8.0hz,2h),1.65(s,6h),1.22(t,j＝8.0hz,3h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.84,170.81,159.70,149.95,141.73,141.14,132.04,131.13,130.54,126.00,125.18,123.13,120.49,111.97,109.72,107.52,78.23,56.28,55.94,52.24,43.83,27.87,15.73.
化合物b-6，黄色固体，产率79％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.39(s,1h),8.09(d,j＝2.0hz,1h),7.39(d,j＝7.5hz,1h),6.97(d,j＝7.5hz,1h),6.91(d,j＝7.5hz,1h),6.73(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.36(d,j＝10.8hz,1h),5.20(d,j＝10.8hz,1h),3.91(s,3h),3.82(s,3h),3.13(s,2h),2.80(s,6h),1.65(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.37,169.14,159.04,149.34,141.83,141.23,132.26,131.33,130.62,126.19,125.36,123.50,120.82,112.68,109.28,106.18,77.81,63.63,56.74,56.03,46.50,28.03。
化合物c-4，棕色固体，产率77％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.35(s,1h),8.12(s,1h),7.50(d,j＝7.4hz,2h),7.13(d,j＝1.7hz,1h),6.75(dd,j＝7.4,1.8hz,1h),6.54(d,j＝11.3hz,1h),5.33(d,j＝10.8hz,1h),3.91(s,3h),3.89(s,3h),3.21(s,2h),2.56(s,3h),1.53(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ195.08,169.32,159.39,146.53,145.10,141.61,134.11,132.08,130.72,123.62,122.57,121.90,120.44,109.64,108.98,107.08,78.72,57.30,55.97,53.23,37.53,28.72.
化合物c-5，黄色固体，产率77％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.47(s,1h),7.89(s,1h),7.48(d,j＝10.8hz,2h),7.10(d,j＝2.0hz,1h),6.74(dd,j＝7.4,1.9hz,1h),6.53(d,j＝10.9,1.0hz,1h),5.26(d,j＝11.0hz,1h),3.99(s,3h),3.86(s,3h),3.49(s,2h),2.65(q,j＝8.0hz,2h),1.64(s,6h),0.96(t,j＝8.0hz,3h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ198.02,171.56,159.81,147.11,145.34,141.71,133.73,132.11,130.87,123.45,123.11,122.61,120.50,109.62,108.97,107.11,78.54,56.57,55.76,53.00,44.25,28.84,15.94.
化合物c-6，棕色固体，产率77％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.54(s,1h),8.02(s,1h),7.50(d,j＝1.2hz,2h),7.05(s,1h),6.76(d,j＝7.9hz,1h),6.38(d,j＝9.9hz,1h),5.21(d,j＝9.9hz,1h),3.93(s,3h),3.81(s,3h),3.26(s,2h),2.81(s,6h),1.63(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ199.68,169.09,159.38,146.59,144.96,141.61,133.76,131.91,130.80,123.52,123.08,122.58,120.41,109.56,108.95,106.98,77.74,63.48,56.62,55.97,46.31,28.50.
实施例5.化合物a-7的制备
(1)中间体5-甲氧基-2-(1-(5-甲氧基-2,2-二甲基-2h-吡喃))苯胺(14)的制备
中间体13的制备：氩气保护下，将甲基三苯基溴化膦(2mmol)溶于无水thf(30ml)中，然后将反应体系冷却至-78℃。将n-buli(2mmol)缓慢加入到混合物中，升温至室温并搅拌0.5h。将混合物再次冷却至-78℃，滴加中间体12(1mmol)的thf(2ml)溶液，搅拌0.5h后，升至室温并搅拌18h；反应结束后加入饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯萃取。合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得粗产物，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，3：1)得到中间体13。
中间体14制备：以中间体13为原料，合成中间体14，具体合成方法同实施例1的相应步骤(3)。黄色固体，产率87％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.15(d,j＝7.5hz,1h),7.10(d,j＝7.5hz,1h),6.55–6.48(m,1h),6.42(d,j＝7.5hz,1h),5.60(s,1h),5.48(s,2h),5.44(d,j＝1.1hz,1h),5.30(s,1h),5.24(d,j＝10.8hz,1h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),1.49(s,6h).
(2)目标化合物a-7的制备
具体的反应步骤同实施例1的相应步骤(4)。
化合物a-7，黄色固体，产率72％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.90(s,1h),7.41–7.14(m,2h),7.03(d,j＝7.5hz,1h),6.62(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.49(d,j＝11.0hz,1h),6.37(d,j＝7.5hz,1h),5.45(s,1h),5.34–5.23(m,2h),4.24(s,2h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),1.66(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ166.17,158.01,155.15,153.39,140.32,139.09,128.64,127.61,127.03,120.59,118.20,117.66,115.70,111.09,109.88,108.23,106.47,77.48,56.01,55.56,38.48,27.87.
化合物b-7、c-7的合成方法与化合物a-7的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-7,黄色固体，产率69％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.90(s,1h),8.57(s,1h),7.20(d,j＝7.5hz,1h),6.88–6.72(m,2h),6.61(dd,j＝7.5,2.0hz,1h),6.43(d,j＝10.8hz,1h),5.70(s,1h),5.55(s,1h),5.09(d,j＝11.0hz,1h),4.24(s,2h),3.90(s,3h),3.81(s,3h),1.55(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ166.17,158.01,146.95,146.79,141.41,139.09,130.82,128.73,128.64,127.51,124.00,120.59,120.11,119.33,110.21,109.88,106.47,77.38,56.32,55.56,38.48,27.67.
化合物c-7,黄色固体，产率65％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.90(s,1h),8.49(s,1h),7.23(d,j＝1.0hz,1h),7.05(d,j＝7.5hz,1h),6.68–6.56(m,2h),6.54(dd,j＝10.9,1.0hz,1h),5.62(d,j＝1.1hz,1h),5.37(s,1h),5.20(d,j＝10.8hz,1h),4.24(s,2h),3.90(s,3h),3.81(s,3h),1.62(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ166.17,157.93,146.19,145.61,142.89,139.11,133.13,131.51,128.74,122.35,121.20,119.85,116.88,113.16,109.93,106.52,77.53,56.28,55.56,38.48,28.07.
实施例6.化合物a-8的制备
以化合物a-1为原料，制备化合物a-8，具体制备步骤同实施例2。
化合物a-8，白色固体，产率67％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.14(s,1h),8.16(s,1h),7.28(d,j＝7.5hz,1h),7.04(d,j＝7.5hz,1h),6.59(d,j＝7.5hz,1h),6.54-6.47(m,2h),5.64(d,j＝11.0hz,1h),5.59(s,1h),5.42(s,1h),4.07(s,2h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),3.32(t,j＝4.9hz,1h),1.39(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ171.54,155.34,151.24,146.46,145.70,144.59,136.15,130.18,128.70,123.09,118.29,116.17,113.66,112.76,110.42,109.52,101.85,75.55,61.77,56.01,55.56,27.87.
化合物b-8、c-8的合成方法与化合物a-8的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-8,白色固体，产率59％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.62(s,1h),7.72(s,1h),7.01(d,j＝7.5hz,1h),6.67(d,j＝7.5hz,1h),6.60-6.53(m,2h),6.21(d,j＝9.9hz,1h),5.70(s,1h),5.30(d,j＝9.9hz,1h),5.26(s,1h),4.06(s,2h),3.87(d,j＝5.0hz,6h),3.31(t,j＝5.0hz,1h),1.45(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ171.76,159.16,152.06,151.94,147.89,141.93,138.39,131.34,128.74,127.04,126.27,123.10,122.99,119.33,110.19,109.88,106.47,76.89,62.15,56.61,55.99,27.57.
化合物c-8,白色固体，产率73％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.84(s,1h),7.73(s,1h),7.06(s,1h),6.76(d,j＝8.3hz,1h),6.62(s,2h),6.27(d,j＝7.5hz,1h),5.87(d,j＝9.4hz,1h),5.29(d,j＝1.8hz,2h),4.05(s,2h),3.91(s,3h),3.82(s,3h),3.33(t,j＝4.9hz,1h),1.49(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ172.92,153.66,147.85,146.42,145.61,141.79,135.13,133.13,131.51,122.48,121.20,120.36,119.08,116.88,112.53,112.15,106.52,76.75,61.77,56.28,55.56,28.07.
实施例7.化合物a-9的制备
以化合物a-8为原料，制备化合物a-9，具体制备步骤同实施例3。
化合物a-9，白色固体，产率89％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.42(s,1h),8.60(s,1h),7.20(d,j＝2.9hz,1h),6.86(d,j＝8.3hz,1h),6.53(d,j＝10.0hz,2h),6.48(d,j＝8.6hz,1h),5.63(s,1h),5.40(s,1h),5.28(d,j＝10.0hz,1h),3.94(s,3h)3.88(s,2h),3.82(s,3h),2.52(s,2h),1.42(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ168.60,157.99,155.25,153.55,139.80,138.70,128.34,127.30,126.52,120.06,117.86,117.32,115.19,110.48,109.26,107.44,105.24,77.53,56.01,55.56,44.13,27.82.
化合物b-9、c-9的合成方法与化合物a-9的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-9，白色固体，产率62％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.52(s,1h),7.73(s,1h),6.97(d,j＝1.9hz,1h),6.70(d,j＝7.5hz,2h),6.54(dd,j＝7.5,2.1hz,1h),6.32(d,j＝11.0hz,1h),5.67(s,1h),5.32(s,1h),5.13(d,j＝10.8hz,1h),3.91(s,3h),3.86(s,2h),3.83(s,3h),1.97(s,2h),1.53(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ159.43,147.13,146.34,141.58,139.49,131.08,128.74,128.64,127.74,125.29,121.69,120.36,119.78,110.78,109.88,106.88,77.38,56.58,55.85,44.74,27.94.
化合物c-9，白色固体，产率86％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.43(s,1h),7.73(s,1h),7.75(s,1h),6.93(d,j＝4.5hz,1h),6.77(d,j＝6.8hz,2h),6.57(dd,j＝11.8,2.5hz,1h),6.36(d,j＝11.7hz,1h),5.65(s,1h),5.28(s,1h),5.24(d,j＝11.8hz,1h),3.92(s,3h),3.87(s,2h),3.82(s,3h),2.00(s,2h),1.58(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ168.94,158.51,146.82,145.61,143.39,139.77,133.72,131.98,129.20,123.31,121.65,120.40,117.76,141.14,110.35,107.11,77.89,56.71,55.94,44.58,28.36.
实施例8.化合物a-10、a-11、a-12的制备
以化合物a-7为原料，制备化合物a-10、a-11、a-12，具体制备步骤同实施例4。
化合物a-10，白色固体，产率89％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.48(s,1h),7.76(s,1h),7.07(d,j＝7.5hz,1h),6.98(d,j＝10.0hz,1h),6.59(dd,j＝7.5,1.8hz,1h),6.51(d,j＝10.8hz,1h),6.40(d,j＝11.0hz,1h),5.53(s,1h),5.34(s,1h),5.28(d,j＝11.0hz,1h),3.92(s,3h),3.86(s,3h),3.25(s,2h),2.5(s,3h),1.63(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ169.87,156.97,154.52,152.27,141.63,139.93,129.39,128.17,126.82,121.07,118.86,117.20,115.46,111.51,110.29,108.63,107.05,77.85,56.56,55.65,51.60,36.83,27.75.
化合物a-11，白色固体，产率75％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.50(s,1h),8.56(s,1h),7.36(d,j＝4.2hz,1h),7.20(d,j＝8.8hz,1h),6.59-6.56(m,2h),6.44(d,j＝7.5hz,1h),5.56(s,1h),5.43(s,1h),5.38(d,j＝8.8hz,1h),3.95(s,3h),3.89(s,3h),3.46(s,2h),2.58(dd,j＝14.5,7.2hz,2h),1.62(s,6h),1.0(t,j＝7.5hz,3h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ170.28,157.85,154.91,153.11,140.54,139.32,128.96,127.85,126.68,120.69,118.34,117.24,115.23,111.53,110.02,108.33,106.11,77.75,56.27,55.81,51.75,43.67,28.33,15.34.
化合物a-12，白色固体，产率78％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)9.54(s,1h),7.96(s,1h),7.09(d,j＝8.5hz,1h),6.98(d,j＝8.2hz,1h),6.64(dd,j＝7.9,2.4hz,1h),6.51(d,j＝9.9hz,1h),6.19(s,1h),5.56(d,j＝10.8hz,1h),5.37(s,1h),5.28(d,j＝10.8hz,1h),3.81(d,j＝2.1hz,6h),3.17(s,2h),2.84(s,6h),1.66(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ169.32,158.63,156.07,154.32,146.21,144.71,139.09,130.48,129.01,121.40,118.20,116.84,115.70,113.40,110.64,109.88,106.47,78.03,63.26,56.05,55.63,46.00,27.41.
化合物b-10、b-11、b-12、c-10、c-11、c-12与化合物a-10、a-11、a-12的合成方法相同，结构式如表1所示，表征数据如下：
化合物b-10，白色固体，产率92％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.42(s,1h),7.80(s,1h),7.12(d,j＝2.2hz,1h),6.58(dd,j＝7.5,1.7hz,1h),6.48(m,2h),6.43(d,j＝10.8hz,1h),5.69(s,1h),5.51(s,1h),5.19(d,j＝11.0hz,1h),3.98(s,3h),3.92(s,3h),3.19(s,2h),2.49(s,3h),1.61(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ169.02,157.60,147.11,146.60,141.76,138.70,131.12,129.09,128.35,126.85,123.36,120.78,119.82,118.89,110.59,109.40,106.72,77.88,56.32,55.35,51.49,37.23,28.81.
化合物b-11，白色固体，产率85％1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.43(s,1h),7.69(s,1h),7.15(d,j＝8.8hz,1h),6.76(d,j＝7.5hz,1h),6.66(dd,j＝11.0,1.9hz,2h),6.48(d,j＝7.5hz,1h),5.65(s,1h),5.47(s,1h),5.19(d,j＝8.6hz,1h),3.91(s,3h),3.81(s,3h),3.46(s,2h),2.67(dd,j＝13.5,4.9hz,2h),1.57(s,6h),1.18(t,j＝8.0hz,3h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ170.40,158.85,147.95,146.79,142.62,138.06,132.34,130.02,129.57,127.16,125.13,121.14,119.76,118.86,110.47,109.70,106.71,77.67,56.26,55.80,51.65,41.62,29.72,15.34.
化合物b-12，白色固体，产率81％,1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.45(s,1h),8.61(s,1h),6.96(d,j＝2.8hz,1h),6.74(s,2h),6.46(dd,j＝8.8,2.1hz,1h),6.29(d,j＝10.8hz,1h),5.76(s,1h),5.54(s,1h),5.21(d,j＝11.0hz,1h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),3.36(s,2h),2.83(s,6h),1.50(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ169.21,158.34,147.03,146.92,141.57,139.23,131.17,129.02,128.54,127.67,124.18,120.76,119.85,118.93,110.50,109.59,107.04,78.11,61.89,56.78,56.11,46.06,27.22。
化合物c-10，白色固体，产率79％，1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ9.45(s,1h),7.83(s,1h),6.98(d,j＝7.4hz,1h),6.77(s,1h),6.65(d,j＝1.8hz,1h),6.56(dd,j＝8.8,1.9hz,1h),6.36(d,j＝9.9,1h),5.64(s,1h),5.35(s,1h),5.13(d,j＝10.8hz,1h),3.91(s,3h),3.91(s,3h),3.22(s,2h),2.28(s,3h),1.53(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ169.52,158.69,146.47,145.56,143.06,138.81,133.53,131.04,128.25,122.97,120.58,119.47,117.51,113.73,109.93,107.78,106.52。
化合物c-11，白色固体，产率73％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.54(s,1h),7.88(s,1h),7.14(d,j＝7.5hz,1h),6.95(s,1h),6.67(dd,j＝10.8,2.2hz,1h),6.43(d,j＝7.2hz,2h),5.50(s,1h),5.23(s,1h),4.97(d,j＝8.6hz,1h),3.94(s,3h),3.90(s,3h),3.56(s,2h),2.59(dd,j＝11.8,2.6hz,2h),1.53(s,6h),1.10(t,j＝8.8hz,3h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ170.52,158.50,146.47,145.52,142.68,138.93,131.99,131.14,128.55,123.23,120.77,119.47,116.51,112.64,109.45,108.28,106.14,77.81,56.36,56.20,52.01,43.67,28.30,15.42。
化合物c-12，白色固体，产率68％，1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ9.54(s,1h),7.92(s,1h),7.06(d,j＝3.5hz,1h),6.90(s,1h),6.64(dd,j＝11.8,2.5hz,1h),6.53(s,1h),6.40(d,j＝7.5hz,1h),5.62(s,1h),5.33(s,1h),5.13(d,j＝10.8hz,1h),3.98(s,3h),3.91(s,3h),3.25(s,2h),2.60(s,6h),1.52(s,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ169.37,158.40,147.11,145.28,142.70,138.92,133.81,130.83,128.25,123.04,120.68,119.54,117.90,112.48,109.39,108.34,107.14,77.83,63.68,56.55,55.31,45.93,28.30。
测试例1：细胞培养：
本发明中所用到的细胞株有：a549(人肺癌细胞株)、bel-7402(人肝癌细胞株)、hela(人宫颈癌细胞株)、mcf-7(人乳腺癌细胞株)、mgc-803(人胃癌细胞株)。五种细胞均培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基中，于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中培养。
测试例2：抗增殖抑制活性测试方法：
本发明中采用mtt方法测试所合成化合物对五种人癌细胞株的增殖抑制活性，并求出ic50值。所用到的细胞株有：a549(人肺癌细胞株)、a2780(人卵巢癌细胞株)、hela(人宫颈癌细胞株)、mcf-7(人乳腺癌细胞株)、hl-60(人白血病胞株)。具体操作步骤如下：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，以5×104个/孔的密度铺于96孔板中，继续培养24h后，吸弃旧的培养基，加入不同浓度的含药培养基，每个药物设置六个浓度，每个浓度设置三个复孔。加药培养48h后，向每孔加入5mg/ml的mtt水溶液，培养4h后吸弃培养基，向每孔加入150μl的二甲基亚砜(dmso)后在水平摇床上避光放置15min溶解结晶紫后，用酶标仪读取570nm下的吸光度值。根据吸光度值，用以下公式算出每个浓度下的细胞生长抑制率：抑制率％＝(1-(a加药-a空白)/(acontrol-a空白))*100％(注：a加药，a空白，acontrol分别代表加药孔，空白孔，对照孔的吸光度值)，然后利用graphpadprism5软件求出每个化合物的ic50值。
测试例3：抑制微管蛋白聚集活性测试方法：
本发明中使用的微管蛋白抑制实验的测试原理是根据微管蛋白聚合为微管时，其聚集程度会被插入的荧光探针4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(4,6-diamidino-2-phenyl-indole,dapi)检测到，聚集程度越高则荧光越强。使用商品化的微管蛋白聚集测试试剂盒(cyto-skeleton，cat.#bk011p)进行测试。实验前，根据试剂盒的说明书设置好荧光酶标仪的参数，准备相应浓度的待测化合物(dmso的终浓度为1％)，冰上解冻试剂盒中的20μlgtpstock、1.5ml的buffer1、tubulinglycerolbuffer及1管微管蛋白储备液。实验时，按205μlbuffer1、4.4μlgtpstock、150μltubulinglycerolbuffer、85μl微管蛋白储备液的比例加入以上反应液，混合后放于冰上。向96孔板中加入5μl不同浓度的待测化合物，空白对照组加入等量的空白溶剂，在37℃预热1min后迅速加入55μl上述配好的反应液。在发射波长为410nm，激发波长为340nm，孵育温度为37℃条件下用荧光光酶标仪动态检测整个微管聚合过程，反应持续90min，每隔1min读数一次。读数完毕后，根据读数计算每个浓度下的抑制率，根据浓度-抑制率的结果用graphpadprism5求得半数抑制浓度(ic50)。实验结果重复三次以上，取平均值作为最终结果。
测试例4：herg钾离子通道抑制实验评价心脏毒性
ca-4p在临床试验中发现具有心脏毒性，本发明设计的化合物为ca-4衍生物，因此本部分工作采用herg实验评价候选分子的心脏毒性。取对数期生长的cho-herg重组细胞，用细胞解离试剂detachin消化。待消化完全后加入培养基调整细胞密度为2～5×106个/ml，将此细胞悬液加到qpatch仪器上完成单细胞高阻抗封接和全细胞模式形成过程，在获得全细胞记录模式后，细胞钳制在-80mv，给予40mv去极化刺激，先给予一个-50mv前置电压刺激50ms，然后复极化到-50mv维持5s，再回到-80mv。每15s施加此电压刺激，记录2min后给予细胞外液记录1min，然后给予不同浓度化合物，从最低测试浓度开始，每个测试浓度给予1min，每个浓度至少测试3组细胞，实验数据由xlfit软件进行统计分析。
测试例5：lc/ms/ms检测候选分子在肝微粒体中的代谢稳定性
选用商品化的大鼠及人的肝微粒体进行实验。配制β-nadpna2再生系统：配制终浓度分别为1.3mmβ-nadpna2、3.3mm葡萄糖-6-磷酸溶液、0.4unit/ml的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液、3.3mmmgcl2溶液、1mg/ml的肝微粒体组成混合体系，取一定体积的本发明化合物(终浓度为100μm)加入到上述混合体系中，混匀后37℃下孵育不同的时间。孵育结束后，向体系中加入500μl的冰乙腈涡旋30s后终止反应。4℃，12,500rpm/min下离心10min，上清液经hplc及lc-ms/ms上机定量分析本发明化合物的剩余浓度。
测试例6：体内裸鼠移植瘤抗肿瘤抑制活性
balb/c-nu裸鼠(5周龄,18-20g)饲养于spf屏障环境中，可自由饮水和进食。取培养至3-5代的对数期生长的细胞，胰酶消化后用不含血清的培养基配制成1.0×107个/ml浓度的细胞悬液。将上述细胞悬液接种至裸鼠右肢靠近腋窝处皮下组织中，每只注射0.1ml。待小鼠体内肿瘤块长至约1000mm3时，脱颈处死小鼠，剥离出肿瘤组织块，在冰上用手术剪去除组织上的结缔组织及坏死部分后，将肿瘤块剪成大小均一，约4-6mm3的组织块，皮下接种于裸小鼠右肢偏腋窝处。待肿瘤组织块长至100-200mm3时分组给药。将小鼠随机分为空白对照组、本发明化合物给药组、对照化合物millepachine给药组、阳性药ca-4p组，每组10只。腹腔注射给药，空白组给予相同体积生理盐水溶液，隔天给药一次，测量并记录肿瘤组织的长、短径和小鼠体重，按以下公式计算肿瘤组织体积：肿瘤体积(mm3)＝0.5×长径×短径2。给药一个月后，脱颈处死小鼠，剥离肿瘤组织块，记录肿瘤块重量，计算给药化合物的抑瘤率。
下面是上述测试例的药理活性结果
结果1：上述实施例制备的化合物对人癌细胞株增殖抑制活性及微管蛋白聚集抑制活性
如表1中所示，本发明所涉及化合物对五种人癌细胞株均具有较好的抗肿瘤细胞增殖活性，ic50值达到了亚微摩尔级别，对靶点微管蛋白的抑制活性及对五种人癌细胞株的抗增殖抑制活性均远远优于改造前天然产物millepachine，部分优选化合物的活性分别提高了近10倍及80倍(见表1)。
表1、本发明部分化合物体外抑制微管蛋白聚集活性及对五种人癌细胞株抗增殖抑制活性
结果2：上述实施例制备的化合物对人正常细胞株毒性评价
如表2所示，部分化合物对人源正常细胞株均表现出较低的细胞毒性，说明该类衍生物毒副作用小。
表2.本发明部分化合物对人源正常细胞株的选择性
结果3：上述实施例制备的化合物早期心脏安全毒性评价
在新药研发的早期安全性评价阶段，化合物对herg钾离子通道抑制ic50>10μm时认为化合物具有微弱或者不具有herg抑制活性；而当ic50<1μm时，化合物被认为具有强烈的herg抑制活性，该类化合物进入临床前必须重点评价其诱发心脏毒性的风险。ca-4p在临床试验在高剂量下中显示出了心脏毒性，如表3显示，本发明中的优选化合物对herg钾离子通道抑制ic50均大于10μm，说明该类化合物具有较好的安全性。
表3本发明化合物对herg钾离子通道抑制活性总结
结果4：上述实施例制备的化合物的代谢稳定性结果
ca-4的一个最大缺陷是结构中碳碳双键的顺式结构不稳定性导致的生物活性不稳定性，因此本发明使用羰基结构替代ca-4结构中的碳碳双键。在与人源肝微粒体孵育一定时间后使用lc-ms/ms测试化合物的剩余量，从而计算出其t1/2，如表4所示，本发明制备的化合物均具有较好的代谢稳定性，t1/2达到阳性药ca-4p的8倍以上，说明本发明衍生物稳定性好。
表4.本发明化合物在人源肝微粒体中的代谢稳定性
结果5：本发明的化合物体内抗肿瘤活性结果
通过裸鼠移植瘤肿瘤模型建立，在给药一个月后，处死小鼠(如图1所示)，同时剥离小鼠肿瘤组织(如图2所示)，并记录各种肿瘤块的重量，在给药期间记录每组每只小鼠肿瘤体积的变化趋势(如图3所示)，给药结束后通过剥离的肿瘤块重量计算给药后的抑瘤率(如图4所示)。结果显示，实验结束时，没有给予药物处理的对照组肿瘤平均体积为1586.88mm3，平均重量为1.809g。改造前天然产物millepachine给药组的肿瘤平均体积为1347.93mm3，平均重量为1.492g，抑瘤率为15.1％。阳性对照药物ca-4p处理组肿瘤平均体积为976.02mm3，平均重量为1.092g，抑瘤率为38.5％。本实施例制备的化合物a-8、b-8、c-8处理组的肿瘤体积及平均重量分别为421.07mm3(0.469g)、366.07mm3(0.399g)、501.45mm3(0.556g)，抑瘤率分别为74.1％、77.9％、69.3％。实验结束时记录各组平均体重，如图5所示；各组小鼠体重无显著性差异，说明无明显毒性。
以上所述仅为本发明的实施例，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种millepachine-ca-4衍生物，其特征在于结构式如式i所示：
其中，ar为a、b或c三种不同取代的苯并吡喃杂环，x为o、s、nch3或se；y为c或o；r1为卤素、羟基、烷氧基、氨基或烷氨基；r2、r3、r4、r5独立的选自氢、羟基、氨基、卤素、三氟甲基、烷氧基或磷酸二钠盐。
2.根据权利要求1所述的millepachine-ca-4衍生物，其特征在于：所述烷氧基为c1-c4的直链或支链的烷氧基；所述烷氨基为c1-c3的直链或支链的烷氨基。
3.一种权利要求1或2所述的millepachine-ca-4衍生物的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)苯并吡喃溴代中间体的合成：在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯及氯化亚铜存在条件下，3-氯-3-甲基-1-丁炔分别与不同取代的溴苯1/溴苯4/溴苯7发生亲核取代反应，分别得到中间体2/中间体5/中间体8；在60～80℃和吡啶存在条件下，中间体2/中间体5/中间体8发生分子内关环反应，分别得到苯并吡喃溴代中间体3/中间体6/中间体9；
(2)在正丁基锂存在条件下，苯并吡喃溴代中间体3/中间体6/中间体9分别与不同取代的苯甲醛10反应，得到二苯甲醇中间体11；然后经2-碘酰基苯甲酸氧化，得到二苯甲酮中间体12；在正丁基锂存在条件下，二苯甲酮中间体12与甲基三苯基溴化磷进行witting反应，得到中间体13；
(3)在钯碳催化条件下，二苯甲酮中间体12或中间体13进行氢化还原反应，得到苯胺中间体14；在碳酸钾存在条件下，苯胺中间体14与卤代乙酰卤素反应，得到目标化合物15；目标化合物15分别与不同取代的醇钠、氨水或不同取代的胺反应，分别得到酰胺侧链不同取代的目标化合物16/目标化合物17/目标化合物18。
4.根据权利要求3所述的millepachine-ca-4衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，3-氯-3-甲基-1-丁炔与溴苯的摩尔用量比为(1～3)：1，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯与溴苯的摩尔用量比为(1～3)：1。
5.根据权利要求3所述的millepachine-ca-4衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，二苯甲醇中间体11的制备步骤为：在氩气保护下，将2～3摩尔份的苯并吡喃溴代中间体3/中间体6/中间体9溶于无水四氢呋喃中，并冷却至-60～-80℃，然后缓慢加入2～3摩尔份的正丁基锂，搅拌平衡0.5～1小时，再加入1摩尔份的不同取代的苯甲醛的thf溶液，继续搅拌12～24小时，反应完毕后，加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后粗品经柱层析分离，得到二苯甲醇中间体11；
二苯甲酮中间体12的制备步骤为：将1摩尔份的二苯甲醇中间体11溶于thf溶液中，搅拌条件下加入2～5摩尔份的2-碘酰基苯甲酸粉末，搅拌5～10小时，tlc监测反应完毕后滤出沉淀，滤液浓缩得到粗产品，经柱层析分离得到二苯甲酮中间体12；
中间体13的制备步骤为：在氩气保护下，将2～3摩尔份的甲基三苯基溴化膦溶于无水thf中，将溶液冷却至-60～-80℃后缓慢滴加2～3摩尔份的n-buli，然后逐渐升至20～25℃后搅拌0.5～1小时，再次将混合物冷却至-60～-80℃后缓慢滴加1摩尔份的二苯甲酮中间体12的thf溶液，搅拌0.5～1小时后，逐渐升至20～25℃后搅拌12～24小时，tlc监测反应完毕后加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离得到中间体13。
6.根据权利要求3所述的millepachine-ca-4衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，苯胺中间体14的制备步骤如下：在1摩尔份的二苯甲酮中间体12或中间体13的thf溶液中，冰浴条件下加入10％-15％(g/g)的钯碳，氢气条件下反应6～12小时，然后过滤除去钯碳，滤液减压干燥后，粗品经柱层析分离，得到苯胺中间体14；
目标化合物15的制备步骤如下：将1摩尔份的苯胺中间体14溶于二氯甲烷溶液中，加入8～10摩尔份的碳酸钾，室温下搅拌0.5～1小时后，在冰浴0～4℃条件下滴加5～10摩尔份的卤代乙酰卤素，继续反应4～8小时，tlc监测反应完毕后用乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物15。
7.根据权利要求3所述的millepachine-ca-4衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，目标化合物16的制备步骤如下：将1摩尔份的目标化合物15溶于甲醇中，加入2～5摩尔份的不同链长的醇钠，50～80℃条件下回流搅拌5～12小时，tlc监测反应完毕后，用乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物16；
目标化合物17的制备步骤如下：将1摩尔份的目标化合物15溶于乙醇中，滴加5～10摩尔份的氨水溶液，室温下搅拌1～6小时，tlc监测反应完毕后用乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物17；
目标化合物18的制备步骤如下：将1～2摩尔份的目标化合物15溶解于丙酮中，搅拌条件下加入2～4摩尔份的碳酸钾，然后加入1～2摩尔份不同链长的盐酸胺，50～80℃下搅拌反应5～10小时，tlc监测反应完毕后，加入乙酸乙酯萃取得到有机相，减压干燥后的粗品经柱层析分离，得到目标化合物18。
8.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1或2所述的millepachine-ca-4衍生物或其药学上可接受的前药、盐、水合物、溶剂合物、晶型形式或非对映异构体为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
9.一种权利要求1或2所述的millepachine-ca-4衍生物的用途，其特征在于：在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术总结