本发明涉及属于药物化学技术领域，尤其是涉及一种含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
新抗霉素(neoantimycin，nat)是新型抗肿瘤和抗真菌缩酚肽类天然产物，其分子骨架为十五元环四重内酯，并有一个3-n-甲酰氨基水杨酸基团(3-formamidosalicylate)、两个烷基和一个苄基侧链。已报到从链霉菌发酵产物中先后发现了以下十二个新抗霉素类似物，其结构差别主要在于分子母环c1位的羟基化或酮基化修饰、烷基侧链的大小、水杨酸酰基是否有氮取代或n-甲酰化修饰。
新抗霉素类天然产物普遍具有重要的药用活性，其中，起初发现新抗霉素化合物sw-163a和sw-163b具有免疫抑制和抗真菌活性(takahashi,k.etal,sw-163aandb,novelimmunosuppressantsproducedbystreptomycessp.，jantibiot(tokyo).2001,54,867-873)，随后发现其结构类似物prunustatina、jbir-04和jbir-05可以负调控肿瘤细胞靶点蛋白grp78(葡萄糖调节蛋白)的表达(umeda,y.etal,absolutestructureofprunustatina,anovelgrp78molecularchaperonedown-regulator，orglett.2007,9,4239-4242；izumikawa,m.etal,novelgrp78molecularchaperoneexpressiondown-regulatorsjbir-04and-05isolatedfromstreptomycesviolaceoniger,jantibiot(tokyo).2007,60,640-644)。最近又发现新抗霉素类化合物nat-a、nat-f、nat-g和nat-h对癌变关键靶点kras的胞膜定位和结肠癌细胞株sw620的多重耐药性均有显著的抑制作用(salim,a.a.etal,rarestreptomycesn-formylamino-salicylamidesinhibitoncogenick-ras,orglett.2014,16,5036-5039)，但是进一步的动物实验表明上述化合物具有较大的毒副作用，对肿瘤细胞的选择抑制活性较差。
有证据表明新抗霉素分子结构中的3-n-甲酰氨基水杨酸基团是其细胞毒活性的功能基团(salim,a.a.etal,rarestreptomycesn-formylamino-salicylamidesinhibitoncogenick-ras，orglett.2014,16,5036-5039)。然而在新抗霉素衍生物unantimycina(uat-a)分子结构中，该基团被3-羟基苯甲酸基团替代，且该化合物仍具有一定的抗肿瘤细胞活性(lim,c.l.etal,unantimycina,anewneoantimycinanalogisolatedfromamicrobialmetabolitefractionlibrary.jantibiot(tokyo).2016,69,456-458)，虽然该文献报道指出新抗霉素衍生物uat-a对hela、hl-60以及ht1080这三种肿瘤细胞具有较温和的抑制活性(ic50≈10μm)，但是没有证据表明uat-a对人肺癌细胞、大肠癌细胞和黑色素瘤细胞具备选择性抑制活性。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于公开四种是由链霉菌s.conglobatusatcc31005发酵产生的新结构新抗霉素衍生物unantimycinb～e(uat-b～e)。新抗霉素分子结构普遍含有3-n-甲酰氨基水杨酸基团(3-formamidosalicylate)，而本发明涉及的uat-b～e四个分子结构对应位置均是3-羟基苯甲酸基团，结构式如下：
本发明的第二目的在于提供所述含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物的制备方法。本发明所述含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物可由链霉菌s.conglobatus发酵得到或者通过化学合成获得。
若由链霉菌s.conglobatus发酵制备，
较佳的，所用的链霉菌s.conglobatus优选市售菌株atcc31005。
较佳的，发酵制备包括步骤：
将链霉菌s.conglobatus接种在固体培养基上，27～32℃培养4～6天后收集孢子；
取孢子接种至一级液体培养基，27～32℃摇瓶培养3～4天得种子液；
取种子液接种至二级液体培养基，27～32℃摇瓶培养3～4天得二级种子液；
取二级种子液接种至发酵培养基，27～32℃摇瓶培养5～7天后收集发酵液；
从发酵液中提取含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物。
较佳的，所述固体培养基含有1.5～2.5％大豆粉，1.5～2.5％d-甘露醇，1.5～2.5％琼脂。
较佳的，所述一级液体培养基含有2～4％胰酶大豆肉汤，9～11％蔗糖，0.4～0.6％酵母提取物。
较佳的，所述二级液体培养基含有2～4％大豆粉，4～6％葡萄糖，0.4～0.6％caco3，4～6mg/lcocl2·6h2o，0.15～0.25％(v/v)消泡剂。
较佳的，所述发酵培养基含有2～4％大豆粉，4～6％葡萄糖，0.4～0.6％caco3，0.15～0.25％(v/v)消泡剂。
进一步的，
所述固体培养基含有2％大豆粉，2％d-甘露醇，2％琼脂；
所述一级液体培养基含有3％胰酶大豆肉汤，10.3％蔗糖，0.5％酵母提取物；
所述二级液体培养基含有3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％caco3，5mg/lcocl2·6h2o，0.2％(v/v)消泡剂；
所述发酵培养基含有3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％caco3，0.2％(v/v)消泡剂。
较佳的，从发酵液中提取含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物的步骤包括：
向发酵液中加入0.05～0.2％(v/v)的甲酸，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物经30～45℃减压浓缩后得浸膏；
用甲醇重溶浸膏，过滤去渣后用正己烷萃取，去除正己烷层；
甲醇溶液经浓缩后，通过柱色谱分离得到化合物uat-b～e。
进一步的，柱色谱分离包括：
经正向硅胶柱分离，洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，洗脱溶剂配比梯度为50/1至0/1(v/v)；
取目标馏分经ods柱分离，洗脱溶剂梯度为30％-100％乙腈；具体指先采用30％乙腈 70％水洗脱，随后逐渐减小溶剂极性，乙腈含量梯度增加至100％。
再取目标馏分经硅胶柱分离，洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇(8/1/0至0/0/1，v/v/v)；具体指先采用石油醚-乙酸乙酯(8/1，v/v)洗脱，随后逐渐增加溶剂极性，逐步增加乙酸乙酯含量，再逐步增加甲醇含量。
取目标馏分用制备型hplc，反向ods柱(ymc-parkc18,20×250mm,5μm)进行最终分离；分离条件为：8ml/min，85％乙腈(含0.1％甲酸)；最终获得uat-b～e。
若通过化学合成制备，
较佳的，制备过程如下：
首先，由含有两个烷基和一个苄基侧链的十五元环四重内酯与苄基保护的3-羟基苯甲酸进行缩合，然后加氢脱苄基保护得到目标化合物uat-b和uat-d，进一步硼氢化还原得到目标化合物uat-c和uat-e。
较佳的，其中十五元环四重内酯可由以下路线制备，
上述制备路线中各中间体的具体制备和分离过程可参考现有文献(包括但不限背景技术所提及的文献)相同或相似结构化合物的制备和纯化过程，本发明中不再赘述。
本发明的第三目的在于公开所述的含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述抗肿瘤药物可用于预防和/或治疗肺癌、结肠癌和黑色素瘤中的一种或多种。
抗肿瘤细胞测试发现，本发明化合物uat-b～e均具有选择性的抗肿瘤细胞活性，即对人肺癌细胞、大肠癌细胞和黑色素瘤细胞的抑制活性与对照药cisplatin相当。除uat-d对人气道上皮细胞16hbe具有较弱抑制活性(ic50＝8.47μm)外，uat-b～e普遍对非癌细胞株抑制活性微弱(ic50>31.9μm)。因此uat有望被开发为选择性肿瘤抑制剂。
本发明的积极进步效果在于：
本发明公开了四种由链霉菌s.conglobatusatcc31005发酵产生的新结构新抗霉素衍生物unantimycinb～e(uat-b～e)，抗肿瘤细胞测试发现，化合物uat-b～e均具有选择性的抗肿瘤细胞活性，即对人肺癌细胞、大肠癌细胞和黑色素瘤细胞的抑制活性与对照药cisplatin相当。除uat-d对人气道上皮细胞16hbe具有较弱抑制活性(ic50＝8.47μm)外，uat-b～e普遍对非癌细胞株抑制活性微弱(ic50>31.9μm)。因此uat-b～e有望被开发为选择性肿瘤抑制剂。
附图说明
图1为化合物uat-b～e的2dnmr(dmso-d6)相关性；
图2a～2g为化合物uat-b的核磁谱图；
图3a～3g为化合物uat-c的核磁谱图；
图4a～4g为化合物uat-d的核磁谱图；
图5a～5g为化合物uat-e的核磁谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中百分符号“％”，若未特别指出，均指质量百分含量。若有特别指示“v/v”，则表示体积比或体积百分含量。
实施例1链霉菌s.conglobatus发酵制备化合物uat-b～e
(1)链霉菌s.conglobatus发酵
将链霉菌s.conglobatus(atcc31005)接种在sfm固体平板培养基(2％大豆粉，2％d-甘露醇，2％琼脂)上，27～32℃培养4～6天后用棉棒收集孢子，接种至一级液体培养基(3％胰酶大豆肉汤，10.3％蔗糖，0.5％酵母提取物)，250ml装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养3天。取该种子液按1/10(v/v)接种至100ml二级液体培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％caco3，5mg/lcocl2·6h2o，0.2％(v/v)消泡剂)，500ml装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养3天。取二级种子液按1/10(v/v)接种至100ml发酵培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％caco3，0.2％(v/v)消泡剂)，500ml装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养6天后收集发酵液12升。
(2)从链霉菌发酵产物中提取uat-b～e
给发酵液中加入0.1％(v/v)的甲酸，用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，乙酸乙酯萃取物经40℃减压浓缩后得浸膏。用300ml甲醇重溶该浸膏，将滤纸过滤去渣，用200ml正己烷通过分液滤斗去除油状物两次。甲醇溶液经浓缩后，通过拌样加载正向硅胶柱(sillicagel，200-300目)，减压过柱，洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，洗脱溶剂配比梯度为50/1至0/1(v/v)，获得6个馏分b1-b6，通过hplc-ms检测含uat-b～e的馏分。进一步把目标馏分加载ods柱，洗脱溶剂梯度为乙腈30％-100％，获得10～15个馏分。取目标馏分再次上样硅胶柱，洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇(8/1/0至0/0/1，v/v/v)，共获得10～15个馏分，取目标馏分用制备型hplc，反向ods柱(ymc-parkc18，20×250mm，5μm)进行最终分离。分离条件为：8ml/min，85％乙腈(含0.1％甲酸)。最终获得uat-b～e(淡黄色无定型)纯化合物量依次为：100mg、20mg、4mg和1mg。
实施例2通过化学合成获取uat-b～e
化合物uat-b～e可通过多部化学合成步骤获得，合成过如下：
uat-b～e的合成路线
首先，通过一些列的缩合步骤制得含有两个烷基和一个苄基侧链的十五元环四重内酯，然后与苄基保护的3-羟基苯甲酸进行缩合，再然后加氢脱苄基保护得到目标化合物uat-b和uat-d，进一步硼氢化还原得到目标化合物uat-c和uat-e。
化合物uat-b～e的结构解析
取1～10mg样品溶解于0.5mldmso-d6，用aglientdd2600mhznmr核磁共振仪采集核磁数据。经1h-和13c-nmr数据分析确定化合物结构，使用高分辨质谱(hr-esi-ms)分析确定化合物分子式。
图1示出了化合物uat-b～e的2dnmr(dmso-d6)相关性。
图2a～2g、图3a～3g、图4a～4g、图5a～5g分别为化合物uat-b～e的1h-nmr、13c-nmr、dept135、1h-1hcosy、hsqc、hmbc、noesy谱图。
表1至表4为化合物uat-b～e的核磁解析。
表1uat-b的核磁数据
表2uat-c的核磁数据
表3uat-d的核磁数据
表4uat-e的核磁数据
实施例3新抗霉素新结构衍生物uat-b～e的抗肿瘤细胞活性检测
通过cck8assay(dojindo,tokyo,japan)试剂盒检测肿瘤细胞活力。细胞培养过程如下：种子细胞通过96孔板培养，培养基中加入浓度为100u/ml的青霉素和浓度为100μg/ml的链霉素，接种细胞浓度为每孔3×103个细胞，37℃，5％co2，培养24h，然后以0.3-10000nm的浓度加入检测化合物(包括链霉菌s.conglobatus发酵产生的uat-b，uat-c，uat-d和uat-e，以及对照药物cisplatin)，培养72h后每孔加入10μl的wst-cck8试剂，37℃继续温育0.5-4h，最后通过酶标仪(spectramax190,moleculardevices,usa)在450nm波长检测细胞活力。
检测的肿瘤细胞包括人肺癌细胞(pc9)、人大肠癌细胞(sw620)和黑色素瘤细胞(a375)。同时以对应的正常细胞(包括人气道上皮细胞16hbe、人结肠上皮细胞ncm460、人永生化表皮细胞hacat)进行平行实验，检测化合物uat-b～e的正常细胞的毒性。
测试结果如表5所示，结果显示化合物uat-b～e均具有选择性的抗肿瘤细胞活性，即对人肺癌细胞、大肠癌细胞和黑色素瘤细胞的抑制活性与对照药cisplatin相当。除uat-d对人气道上皮细胞16hbe具有较弱抑制活性(ic50＝8.47μm)外，uat-b～e普遍对非癌细胞株抑制活性微弱(ic50>31.9μm)。因此uat有望被开发为选择性肿瘤抑制剂。
表1抑制肿瘤细胞ic50数值(μm)
1.一种含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物，其特征在于，其为下列四种化合物uat-b～e中的一种，
2.如权利要求1所述的含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物的制备方法，其特征在于，其由链霉菌s.conglobatus发酵得到。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其包括步骤：
将链霉菌s.conglobatus接种在固体培养基上，27～32℃培养4～6天后收集孢子；
取孢子接种至一级液体培养基，27～32℃摇瓶培养3～4天得种子液；
取种子液接种至二级液体培养基，27～32℃摇瓶培养3～4天得二级种子液；
取二级种子液接种至发酵培养基，27～32℃摇瓶培养5～7天后收集发酵液；
从发酵液中提取含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述固体培养基含有1.5～2.5％大豆粉，1.5～2.5％d-甘露醇，1.5～2.5％琼脂；
所述一级液体培养基含有2～4％胰酶大豆肉汤，9～11％蔗糖，0.4～0.6％酵母提取物；
所述二级液体培养基含有2～4％大豆粉，4～6％葡萄糖，0.4～0.6％caco3，4～6mg/lcocl2·6h2o，0.15～0.25％(v/v)消泡剂；
所述发酵培养基含有2～4％大豆粉，4～6％葡萄糖，0.4～0.6％caco3，0.15～0.25％(v/v)消泡剂。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，从发酵液中提取含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物的步骤包括：
向发酵液中加入0.05～0.2％(v/v)的甲酸，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物经30～45℃减压浓缩后得浸膏；
用甲醇重溶浸膏，过滤去渣后用正己烷萃取，去除正己烷层；
甲醇溶液经浓缩后，通过柱色谱分离得到化合物uat-b～e。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，柱色谱分离包括：
经正向硅胶柱分离，洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，洗脱溶剂配比梯度为50/1至0/1(v/v)；
取目标馏分经ods柱分离，洗脱溶剂梯度为30％-100％乙腈；
再取目标馏分经硅胶柱分离，洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇(8/1/0至0/0/1，v/v/v)；
取目标馏分用制备型hplc，反向ods柱(ymc-parkc18，20×250mm，5μm)进行最终分离；分离条件为：8ml/min，85％乙腈(含0.1％甲酸)；最终获得uat-b～e。
7.如权利要求1所述的含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物的制备方法，其特征在于，其制备过程如下：
首先，由含有两个烷基和一个苄基侧链的十五元环四重内酯与苄基保护的3-羟基苯甲酸进行缩合，然后加氢脱苄基保护得到目标化合物uat-b和uat-d，进一步硼氢化还原得到目标化合物uat-c和uat-e。
8.如权利要求1所述的含3-羟基苯甲酸基团的新抗霉素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物可用于预防和/或治疗肺癌、结肠癌和黑色素瘤中的一种或多种。
技术总结